PEG引发对老化燕麦种子抗氧化性能的影响#

中国科技论文在线 中国科技论文在线-FORMTEXTEffectofPEGprimingonoxidationresistanceinagedoatseedsFORMTEXTXIAFangshan1,2,FORMTEXTMAOPeisheng1,2(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ChinaAgriculturalUniversity;

2.BeijingKeyLaboratoryofGrasslandScience,Beijing100193)Abstract:FORMTEXTThisstudywasdesignedtoanalyzetheseedgermination,theactivitiesofsuperoxidedismutase(SOD),catalase(CAT),peroxidase(POD),andmalondialdehyde(MDA)contentsinagedoat(Avenasativa)seedswithultra-drymoisturecontent(4%),whichwasdeterioratedfor48dat45℃,andprimedfor0(CK),3and6hwithdifferentconcentrationsofPEG-6000(0,-0.3,-0.6,-0.9and-1.2Mpa),toexploretheeffectofPEGprimingonphysiologicalresponsesforagedoatseedswithultra-drymoisturecontent.TheresultsshowedthattheactivitiesofSOD,CATandPODdecreasedinagedoatseedsprimingwithPEGattheconcentrationof0and-0.3Mpa,leadingtoanincreaseinMDAcontents,thus,thegerminationpercentagedeclinedinagedoatseedswithultra-drymoisturecontent.However,theoppositetrendwasobservedafterprimingwithhighconcentrationofPEG(-0.9and-1.2Mpa).ThisindicatedthatPEGprimingwasnotonlypreventedtheimbibitiondamageforultra-driedoatseeds,butalsorepairedthedamagefromseedageing.Keywords:FORMTEXTOat,priming,polyethyleneglycol,seedageing,ultra-dry引言种子在贮藏过程中总会不可避免地发生老化现象，从而导致种子活力下降，甚至死亡[1]。种子活力的下降程度与其贮藏过程种子含水量的增加呈正相关[2]。超干贮藏可以在一定程度上维持种子的生理功能，保护种子膜结构的完整性，提高种子的耐贮藏性，最大限度地延长种子的贮藏寿命[3]。超干种子主要通过提高其超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）及过氧化物酶（peroxidase，POD）等抗氧化酶的活性来增强自身的耐贮藏性，表现为丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量下降，种子活力水平升高[4,5]。然而，超干种子在萌发初期会发生吸胀损伤，导致细胞膜完整性降低，溶质释放到质外体，及持续吸水等[6]。聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）引发可以提高老化种子的发芽率、发芽势、种子活力及幼苗生长，这已在小麦（Triticumaestivum）[7]、大豆（Glycinemax）[8]、穿心莲（Andrographispaniculata）[9]、茎瘤芥（Brassicajunceavar）[10]、蔓性千斤拔（Moghaniaphilippinensis）[11]及紫苏（Perillafrutescens）[12]等植物老化种子的研究中得到验证。PEG引发主要通过增强SOD、POD、CAT和APX等抗氧化酶的活性来提高老化种子的发芽率[13]。然而，目前尚未报道关于PEG引发对超干种子老化后的影响研究。燕麦（Avenasativa）是具有耐瘠薄、耐盐碱和抗旱耐寒等优良特性的传统粮食和优质饲草料作物[14]。燕麦籽实富含均衡蛋白质、可溶性膳食纤维β-葡聚糖、不饱和脂肪酸、维生素及矿物质等营养成分，对人类健康具有至关重要的作用[15]。因此，试验以超干燕麦种子为材料，分析不同PEG浓度及引发时间对其老化后抗氧化酶活性等的生理影响，以期为预防超干种子萌发过程的吸胀损伤，以及其老化后的修复机理研究提供理论基础。材料与方法材料来源供试燕麦（品种：三冠王）种子由中国农业大学牧草种子实验室提供，2009年收集于河北省张家口市沽源牧场，在-20°C保存至2014年试验进行。种子自然含水量为9.8%，正常种苗数为89%，不正常种苗数为5%。含水量的测定准确称取4.5g燕麦种子，放入样品盒中称重（精确到0.001g），设2次重复，130～133°C烘干1h后取出，盖好盒盖，放入干燥器内冷却30min，按公式计算含水量：种子含水量（％）=（M2-M3）/（M2-M1）×100%，式中M1，样品盒和盖的重量（g）；M2，样品盒、盖及样品的烘前重量（g）；M3，样品盒、盖及样品的烘后重量（g）。超干处理称量种子初始重量，并将其放置于装有变色硅胶的干燥器内，反复称重，当种子达到所需重量时（种子含水量为4%，鲜重），立即密封于12×17cm2的锡箔袋中，每袋大约20g种子，放入4°C冰箱备用。老化及PEG引发处理将调整好含水量的燕麦种子放于45°C恒温水浴箱内劣变48d，将老化种子用不同浓度的PEG-6000（0、-0.3、-0.6、-0.9和-1.2Mpa）分别引发处理0（CK）、3和6h，蒸馏水冲洗2次，用滤纸吸干表层水分，然后25°C室内风干，每个处理重复4次。发芽试验及发芽率测定参照国际种子检验协会（ISTA）的种子检验规程（2013）[16]规定的发芽条件。选取均匀饱满的种子100粒放入培养皿中，设4次重复，在20°C恒温条件下培养。初次计数第5d，末次计数第10d，最终统计正常种苗数，按以下公式计算种子发芽率（Germinationpercentage，Gp）：Gp（%）=（G10/N）×100，G10为第10天正常发芽种子数，N为发芽种子总数。SOD活性的测定SOD活性的测定参照Rao和Sresty[17]的方法，略作改动。通过在560nm处测定SOD对氮蓝四唑（nitrobluetetrazolium，NBT）光化学还原反应的抑制来计算SOD的活性。SOD的活性以每mg线粒体蛋白抑制NBT光化还原的50%作为一个酶活性单位（以Umg–1protein表示）。CAT活性的测定CAT活性通过由于H2O2含量减少在240nm波长处吸光度值在1min内的动态变化来计算，100µL粗酶液加入到3.4mL磷酸缓冲液（25mmolL-1，pH7.0，混合0.1mmolL-1EDTA），然后加入200µL0.1molL-1H2O2，反应由H2O2的加入启动。POD活性的测定POD活性的测定参照Kalpanaetal.[18]，略作改动。反应由加入0.1mL0.2molL-1H2O2开始，在470nm处测定2min内吸光度值的变化，每隔15s记录一次，以0.1ΔA470.min-1作为POD的一个单位。MDA含量的测定MDA含量测定参照Baillyetal.[19]的方法，略作改动。吸取0.95mL粗酶液，加入1.5mL蒸馏水和2.5mL含0.5%硫代巴比妥酸的20%三氯乙酸溶液，混合液于沸水浴中加热15min，迅速冷却，以4000rmin–1离心10min，上清液分别于532nm和600nm波长下测定光密度值。数据处理与统计分析试验数据通过Excel2010和SAS8.0统计分析软件处理，多重比较采用Duncans法进行，结果以平均值±标准误表示。结果分析PEG引发对老化燕麦种子发芽率的影响随PEG浓度增加，引发3h后老化燕麦种子发芽率呈先降后升的趋势（表1），浓度为-0.3Mpa时显著小于其它浓度（P<0.05），浓度为-0.9和-1.2Mpa时达最大值；引发6h后其发芽率逐渐升高，浓度为-1.2Mpa时显著高于0~-0.6Mpa（P<0.05）。浓度为0Mpa时，引发6h后老化燕麦种子发芽率显著小于CK（P<0.05）；浓度为-0.3Mpa时，引发3h后其发芽率显著小于CK（P<0.05）；浓度为-0.6~-1.2Mpa时，各引发时间之间老化燕麦种子发芽率差异不显著（P>0.05）。表1PEG引发下老化燕麦种子发芽率的变化（%）Table1ChangesofgerminationpercentageinagedoatseedsprimingwithPEG(%)引发时间PEG浓度PEGconcentrations（Mpa）Primingtime（h）0-0.3-0.6-0.9-1.20（CK）78±2.50Aa78±2.50Aa78±2.50Aa78±2.50Aa78±2.50Aa374±0.94ABb70±1.97Bc77±1.11Aab79±1.16Aa79±1.11Aa669±1.95Bd74±1.06Ac77±1.73Abc80±1.97Aab83±1.11Aa注：同列不同大写字母表示差异显著（P<0.05），同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。Note:meansinthesamecolumnwithdifferentcapitallettersaresignificantlydifference(P<0.05),inthesamerowwithdifferentsmalllettersaresignificantlydifference(P<0.05).PEG引发对老化燕麦种子SOD活性的影响随PEG浓度增加，引发3和6h后老化燕麦种子SOD活性呈逐渐升高的趋势（表2），浓度为0Mpa时显著小于其它浓度（P<0.05），浓度为-0.9和-1.2Mpa时显著大于0和-0.3Mpa（P<0.05）。浓度为0Mpa时，引发3和6h后老化燕麦种子SOD活性显著小于CK（P<0.05）；浓度为-0.3和-0.6Mpa时，引发3和6h均与CK差异不显著（P>0.05）；浓度为-0.9Mpa时，引发3和6h后老化燕麦种子SOD活性均显著大于CK（P<0.05），引发6h时SOD活性最高；浓度为-1.2Mpa时，引发6h后老化燕麦种子SOD活性显著高于引发3h和CK（P<0.05），而引发3h和CK之间SOD活性差异不显著（P>0.05）。表2PEG引发下老化燕麦种子SOD活性的变化（%）Table2ChangesofSODactivitiesinagedoatseedsprimingwithPEG(%)引发时间PEG浓度PEGconcentrations（Mpa）Primingtime（h）0-0.3-0.6-0.9-1.20（CK）5.17±0.109Aa5.17±0.109Aa5.17±0.109Aa5.17±0.109Ca5.17±0.109Ba34.30±0.093Bd4.89±0.113Ac5.19±0.136Ab5.54±0.100Ba5.45±0.029Bab64.10±0.087Bd4.90±0.181Ac5.52±0.077Ab5.97±0.143Aa6.20±0.092Aa注：同列不同大写字母表示差异显著（P<0.05），同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。Note:meansinthesamecolumnwithdifferentcapitallettersaresignificantlydifference(P<0.05),inthesamerowwithdifferentsmalllettersaresignificantlydifference(P<0.05).PEG引发对老化燕麦种子CAT活性的影响随PEG浓度增加，引发3和6h后老化燕麦种子CAT活性呈逐渐升高的趋势（表3），浓度为0Mpa时显著小于其它浓度（P<0.05），浓度为-1.2Mpa时显著大于其它浓度（P<0.05），而引发3h时，浓度-0.3~-0.9Mpa之间CAT活性差异不显著（P>0.05）。浓度为0Mpa时，引发3h后老化燕麦种子CAT活性与CK差异不显著（P>0.05），而引发6h后显著低于CK（P<0.05）；浓度为-0.3Mpa时，引发3h后老化燕麦种子CAT活性与显著高于CK（P>0.05），而引发6h后与CK差异不显著（P>0.05）；浓度为-0.6Mpa时，引发3和6h后老化燕麦种子CAT活性差异不显著（P>0.05），但均显著高于CK（P<0.05）；浓度为-0.9和-1.2Mpa时，引发3和6h后老化燕麦种子CAT活性显著高于CK（P<0.05），而且引发6h后显著高于引发3h（P<0.05）。表3PEG引发下老化燕麦种子CAT活性的变化（%）Table3ChangesofCATactivitiesinagedoatseedsprimingwithPEG(%)引发时间PEG浓度PEGconcentrations（Mpa）Primingtime（h）0-0.3-0.6-0.9-1.20（CK）6.74±0.149Aa6.74±0.149Ba6.74±0.149Ba6.74±0.149Ca6.74±0.149Ca36.67±0.132Ad7.31±0.141Ac7.41±0.056Abc7.70±0.146Bbc8.11±0.102Ba65.86±0.173Be6.33±0.160Bd7.57±0.104Ac8.23±0.094Ab8.57±0.113Aa注：同列不同大写字母表示差异显著（P<0.05），同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。Note:meansinthesamecolumnwithdifferentcapitallettersaresignificantlydifference(P<0.05),inthesamerowwithdifferentsmalllettersaresignificantlydifference(P<0.05).PEG引发对老化燕麦种子POD活性的影响随PEG浓度增加，引发3和6h后老化燕麦种子POD活性呈逐渐升高的趋势（表4），引发3h后在浓度为0和-0.3Mpa时显著小于其它浓度（P<0.05），在浓度为-0.9和-1.2Mpa时显著大于其它浓度（P<0.05）；引发6h后在浓度为0Mpa时显著小于其它浓度（P<0.05），在浓度为-1.2Mpa时显著高于其它浓度（P<0.05），但是在浓度为-0.3~-0.9Mpa时POD活性差异不显著（P>0.05）。浓度为0Mpa时，引发3h与引发6h时老化燕麦种子POD活性差异不显著（P>0.05），但两者均显著低于CK（P<0.05）；在浓度为-0.3Mpa时，引发3h后老化燕麦种子POD活性显著低于CK（P<0.05），而引发6h后与CK差异不显著（P>0.05）；浓度为-0.6和-0.9Mpa时，引发3和6h后老化燕麦种子POD活性与CK差异不显著（P>0.05）；浓度为-1.2Mpa时，引发3和6h后老化燕麦种子POD活性均显著高于CK（P<0.05）。表4PEG引发下老化燕麦种子POD的变化（%）Table4ChangesofPODactivitiesinagedoatseedsprimingwithPEG(%)引发时间PEG浓度PEGconcentrations（Mpa）Primingtime（h）0-0.3-0.6-0.9-1.20（CK）31.8±1.32Aa31.8±1.32Aa31.8±1.32Aa31.8±1.32Aa31.8±1.32Ba327.7±1.06Bc26.2±0.57Bc30.0±0.25Ab33.6±0.56Aa35.3±1.07Aa625.9±0.48Bc32.6±1.30Ab30.7±0.58Ab32.8±1.28Ab36.2±0.98Aa注：同列不同大写字母表示差异显著（P<0.05），同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。Note:meansinthesamecolumnwithdifferentcapitallettersaresignificantlydifference(P<0.05),inthesamerowwithdifferentsmalllettersaresignificantlydifference(P<0.05).PEG引发对老化燕麦种子MDA含量的影响随PEG浓度增加，引发3和6h后老化燕麦种子MDA含量呈逐渐降低的趋势（表5），引发3h的老化燕麦种子MDA含量在浓度为0和-0.3Mpa时显著大于其它浓度（P<0.05），浓度为-1.2Mpa时显著小于其它浓度（P<0.05）；引发6h的老化燕麦种子MDA含量在浓度为0Mpa时显著大于其它浓度（P<0.05），浓度为-1.2Mpa时显著小于其它浓度（P<0.05）。浓度为0Mpa时，引发3和6h后老化燕麦种子MDA含量均显著高于CK（P<0.05），而两者之间差异不显著（P>0.05）；浓度为-0.3Mpa时，引发3和6h后老化燕麦种子MDA含量均显著高于CK（P<0.05），而且引发3h时显著高于引发6h（P<0.05）；浓度为-0.6Mpa时，引发3h后老化燕麦种子MDA含量显著高于引发6h和CK（P<0.05），而引发6h后其MDA含量与CK之间差异不显著（P>0.05）；浓度为-0.9和-1.2Mpa时，引发3和6h后老化燕麦种子MDA含量均显著低于CK（P<0.05），而引发3h和引发6h之间差异不显著（P>0.05）。表5PEG引发下老化燕麦种子MDA含量的变化（%）Table5ChangesofMDAcontentsinagedoatseedsprimingwithPEG(%)引发时间PEG浓度PEGconcentrations（Mpa）Primingtime（h）0-0.3-0.6-0.9-1.20（CK）0.591±0.026Ba0.591±0.026Ca0.591±0.026Ba0.591±0.026Aa0.591±0.026Aa30.730±0.012Aa0.756±0.010Aa0.659±0.004Ab0.540±0.007Bc0.489±0.009Bd60.724±0.003Aa0.675±0.014Bb0.607±0.006Bc0.512±0.010Bd0.476±0.006Be注：同列不同大写字母表示差异显著（P<0.05），同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。Note:meansinthesamecolumnwithdifferentcapitallettersaresignificantlydifference(P<0.05),inthesamerowwithdifferentsmalllettersaresignificantlydifference(P<0.05).讨论与结论种子老化会导致其抗氧化酶活性下降，活性氧累积增多，脂质过氧化增强，细胞膜透性增大，膜完整性降低，从而造成种子活力下降[20]。本试验中，在相同引发时间下，老化燕麦种子SOD、CAT和POD活性均随PEG浓度的增加而升高，而MDA含量则随PEG浓度增加而逐渐降低，所以其发芽率也逐渐升高，这说明PEG引发能够有效缓解超干燕麦种子的吸胀损伤，并修复其老化损伤。PEG引发的修复效果不仅与其浓度有关，还与其引发时间关系密切。浓度为0和-0.3Mpa的PEG引发3和6h后，老化燕麦种子的发芽率显著小于CK（P<0.05），这说明浓度为0和-0.3Mpa的PEG引发导致了超干燕麦种子的吸胀损伤，从而加剧了其老化后的细胞损伤，所以种子活力下降。PEG引发后老化的超干燕麦种子活力水平与其抗氧化酶活性关系密切。浓度为0Mpa的PEG引发6h后老化燕麦种子发芽率最低，而此时SOD、CAT和POD活性最低，由于SOD和POD活性与引发3h间差异不显著（P>0.05），所以两者之间MDA和发芽率也差异不显著（P>0.05）。但是由于SOD、CAT和POD活性均显著低于CK（P<0.05），所以其MDA含量也显著高于CK（P<0.05），而发芽率则显著低于CK（P<0.05）；浓度为-0.3Mpa的PEG引发6h后老化燕麦种子SOD、CAT和POD活性均与CK差异不显著（P>0.05），因此，虽然其MDA含量显著高于CK（P<0.05），但其发芽率与CK差异不显著（P>0.05）。浓度为-0.6Mpa的PEG引发3和6h后，尽管老化燕麦种子CAT显著高于CK（P<0.05），但SOD和POD活性与CK差异不显著（P>0.05），因此其发芽率也与CK差异不显著（P>0.05）。浓度为-0.9和-1.2Mpa的PEG引发3和6h后，老化燕麦种子POD活性SOD和CAT活性均显著高于CK（P<0.05），其MDA含量显著低于CK（P<0.05），但其发芽率与CK差异不显著（P<0.05），这说明PEG引发的修复首先开始于其内部抗氧化酶等生理的改善。综上所述，PEG引发可以通过提高燕麦种子的SOD、CAT和POD活性来缓解超干种子的吸胀损伤，而且能够修复其老化损伤，表现为MDA含量下降，从而提高其活力水平，但是PEG浓度应不低于-0.6Mpa。[参考文献](References)FORMTEXT[1]DraganićI,LekićS.Seedprimingwithantioxidantsimprovessunflowerseedgerminationandseedlinggrowthunderunfavorablegerminationconditions[J].TurkiskJournalofAgricultureandForestry,2012,36(4):421-428.

[2]ParkheyS,NaithaniSC,KeshavkantS.ROSproductionandlipidcatabolismindesiccatingShorearobustaseedsduringaging[J].PlantPhysiologyandBiochemistry,2012,57(1):261-267.

[3]Perez-GarciaF,Gomez-CampoC,EllisRH.Successfullong-termultra-drystorageofseedof15speciesofBrassicaceaeinagenebank:variationinabilitytogerminateover40yearsanddormancy[J].Seedscienceandtechnology[J].2009,37(3):640-649.

[4]LiY,QuJJ,ZhangWM,etal.Impactofultra-drystorageonvigorcapacityandantioxidantenzymeactivitiesinseedofAmmopiptanthusmongolica[J].BotanicalStudies,2010,51(4):465-472.

[5]CuiK,WangHY,LiK,etal.Physiologicalandbiochemicaleffectsofultra-drystorageonbarbadosnutseeds[J].CropScience,2014,54(4):1748-1755.

[6]BewleyJD,BradfordKJ,HilhorstHWM,etal.Seeds:Physiologyofdevelopment,germinationanddormancy[M].3rdEdi.SpringerPress,NewYork.2013:143-147.

[7]张自阳，姜小苓，卢春瑞，等.PEG引发处理对人工老化小麦种子活力及幼苗生长的影响[J].河南科技学院学报，2013，41(1)：1-5.

[8]王炜，史雨刚，王曙光.PEG引发对老化大豆种子发芽及活力的影响[J].山西农业科学，2011，39(7)：650-654.

[9]潘春柳，黄燕芬，邓志军，等.PEG处理对新鲜和老化穿心莲种子萌发及幼苗生长的影响[J].种子，2013，32(12)：30-34.

[10]王慧超，赵昌琼，郑美娜，等.聚乙二醇（PEG）浸种对茎瘤芥老化种子活力及其幼苗生长的影响[J].植物生理学通讯，2010，46(2)：131-134.

[11]冯世鑫，马小军，李小勇，等.PEG浸种对老化的蔓性千斤拔种子萌发及活力的影响[J].作物杂志，2013(1)：136-139.

[12]张春平，何平，杜丹丹，等.ZnSO4和PEG引发对老化紫苏种子萌发及幼苗抗氧化酶活性的影响[J].中国中药杂志，2010，35(18)：2372-2377.

[13]JafariH,NajafiR,SoltaniA,etal.Seeddeterioration