时间分辨荧光免疫

5-2时间分辨荧光免疫分析郑鹄志西南大学化学化工学院发展历程1979年，可标记抗体的Eu3+-β-二酮体-EDTA1983年，建立时间分辨荧光免疫技术，用于测定HCG和磷酸酯酶A“镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配套研究”获2003年度国家科技进步二等奖一、时间分辨荧光免疫分析特点1.荧光衰减时间长镧系元素荧光衰变时间常见荧光物质荧光寿命荧光物质荧光寿命Eu3+714μs非特异性荧光背景1-10ns人血清白蛋白4.1ns人球蛋白、血红蛋白3.0ns细胞色素C3.5nsFITC4.5ns丹磺酰氯14ns苯胺萘磺酸16ns稀土螯合物104-106ns2.Stokes位移大

荧光物质激发波长发射波长Stokes位移Eu-(β-NTA)3340nm613nm273nmSm-(β-NTA)3340nm600nm260nmTb-(PTA)3295nm490/543nm195/248nmDy-(PTA)3295nm573nm278nm镧系元素发射峰窄优点灵敏度高（10-18mol/孔）原子标记多标记技术二、时间分辨荧光免疫分析体系非均相时间分辨荧光免疫分析均相时间分辨荧光免疫分析（一）非均相时间分辨荧光免疫分析时间分辨固相免疫分析解离增强荧光免疫分析酶放大免疫分析1.时间间分分辨辨固固相相免免疫疫分分析析灵敏敏度度一一般般不不高高实例例加拿拿大大CyberFluor的FIAgen系统统Eu3+-BCPDA为标标记记物物2.解离离增增强强分分析析原理理示示意意图图（1）双双功功能能螯螯合合剂剂EDTA衍生生物物、、DTTA衍生生物物、、DTPA衍生生物物一端端与与镧镧系系离离子子螯螯合合，，一一端端与与抗抗原原/抗体体连连接接近中中性性时时，，螯螯合合物物足足够够稳稳定定酸性性条条件件下下，，镧镧系系离离子子迅迅速速、、彻彻底底释释放放Eu-DTTA应用用最最广广泛泛（2）增增强强液液增强强原原理理图图一般般增增强强百百万万倍倍β-NTA：Eu(β-NTA)3(TOPO)2复合合物物TOPO：荧荧光光增增强强协协同同剂剂TritonX-100：表表面面活活性性剂剂，，形形成成胶胶束束醋酸酸：：酸酸性性介介质质（3）酶酶放放大大酶催催化化底底物物，，生生成成的的产产物物与与溶溶液液中中镧镧系系离离子子、、螯螯合合剂剂生生成成荧荧光光强强、、寿寿命命长长的的三三元元复复合合物物ALP酶放放大大免免疫疫分分析析示示意意图图双标标记记测测定定AFP和β-hCGβ-NTA作为为螯螯合合剂剂340nm激发发，，Eu:615nm,820μs；Sm:643nm,88μs（二二））均均相相免免疫疫分分析析基于于时时间间分分辨辨荧荧光光共共振振能能量量转转移移无需需洗洗涤涤、、分分离离、、加加增增强强液液TBP-Eu：Eu3+-二吡吡啶啶二二胺胺，，最最大大发发射射615nm，供供体体APC：别别藻藻蓝蓝蛋蛋白白，，最最大大发发射射665nm，受受体体能量量转转移移效效率率最最高高的的供供体体/受体对时间分辨辨荧光共共振能量量转移免免疫分析析示意图图三、时间间分辨免免疫分析析方法夹心法竞争法间接法捕获法生物素-亲和素放放大法1.夹心法双抗体夹夹心法双抗原夹夹心法2.竞争法3.间接法间接法测测定HCV抗体4.捕获法捕获法测测定抗-CMVIgM5.生物素-亲和素法法生物素-亲和素检检测PAPP-A四、应用用1.肿瘤标志志物检测测2.传染病检检测3.糖尿病检检测4.激素检测测5.细胞活性性检测1.肿瘤瘤标志物物AFP测定：双双抗体夹夹心法固相包被被抗体加入样品品或标准准品加入Eu标记抗体体加入增强强液测定荧光光灵敏度：：0.17U/ml2.传传染病检检测梅毒螺旋旋体抗体体检测：：双抗原原夹心法法强阳性血血清和正正常人血血清分别别作为阴阴阳对照照阴性对照照、阳性性对照和和样品加加入板上上，孵育育加入铕标标记抗原原，孵育育加入增强强液，检检测荧光光符合中国国药品生生物制品品鉴定所所结果3.糖尿尿病检测测C-肽检测：：双抗体体夹心法法抗体包被被微孔板板加入标准准品或样样品加入铕标标记抗体体增强液，，检测荧荧光灵敏度：：0.08ng/ml4.激素素检测三碘甲状状腺原氨氨酸（T3）：竞争争法微孔板中中加入抗抗体标准品或或样品、、铕标记记T3加入增强强液，测测定荧光光灵敏度：：0.21ng/ml5.细胞胞活性检检测测定细胞胞活性原原理图T：靶细胞胞E：效应细细胞NK细胞胞活性靶细胞：：K562细胞加入EuCl3,DTPA,硫酸葡聚聚糖，4ºC孵育向靶细胞胞中加入入效应细细胞（NK细胞），，孵育，，离心，，测上清清荧光计算比释释放率（（%）9、静静夜夜四四无无邻邻，，荒荒居居旧旧业业贫贫。。。。12月月-2212月月-22Saturday,December24,202210、雨中黄叶树树，灯下白头头人。。21:10:5021:10:5021:1012/24/20229:10:50PM11、以我独沈久久，愧君相见见频。。12月-2221:10:5021:10Dec-2224-Dec-2212、故人人江海海别，，几度度隔山山川。。。21:10:5021:10:5021:10Saturday,December24,202213、乍见见翻疑疑梦，，相悲悲各问问年。。。12月月-2212月月-2221:10:5021:10:50December24,202214、他乡乡生白白发，，旧国国见青青山。。。24十十二二月20229:10:50下下午21:10:5012月月-2215、比不了得得就不比，，得不到的的就不要。。。。十二月229:10下下午12月-2221:10December24,202216、行动出成成果，工作作出财富。。。2022/12/2421:10:5021:10:5024December202217、做前，，能够环环视四周周；做时时，你只只能或者者最好沿沿着以脚脚为起点点的射线线向前。。。9:10:50下午午9:10下午午21:10:5012月-229、没有失失败，只只有暂时时停止成成功！。。12月-2212月-22Saturday,December24,202210、很多事事情努力力了未必必有结果果，但是是不努力力却什么么改变也也没有。。。21:10:5021:10:5021:1012/24/20229:10:50PM11、成功就就是日复复一日那那一点点点小小努努力的积积累。。。12月-2221:10:5021:10Dec-2224-Dec-2212、世间成事，，不求其绝对对圆满，留一一份不足，可可得无限完美美。。21:10:5021:10:5021:10Saturday,December24,202213、不知香积寺寺，数里入云云峰。。12月-2212月-2221:10:5021:10:50December24,202214、意志坚强的的人能把世界界放在手中像像泥块一样任任意揉捏。24十二月月20229:10:50下午21:10:5012月-2215、楚塞塞三湘湘接，，荆门门九派派通。。。。十二月月229:10下下午午12月月-2221:10December24,202216、少年年十五五二十十时，，步行行夺得得胡马马骑。。。2022/12/2421:10:5021:10:5024December202217、空山山新雨雨后，，天气气晚来来秋。。。9:10:50下下午9:10下下午午21:10:5012月月-229、杨杨柳柳散散和和风风，，青青山山澹澹吾吾虑虑。。。。12月月-2212月月-22Saturday,December24,202210、阅阅读读一一切切好好书书如如同同和和过过去去最最杰杰出出的的人人谈谈话话。。21:10:5021:10:5021:1012/24/20229:10:50PM11、越越是是没没有有本本领领的的就就越越加加自自命命不不凡凡。。12月月-2221:10:5021:10Dec-2224-Dec-2212、越是无无能的人人，越喜喜欢挑剔剔别人的的错儿。。21:10:5021:10:5021:10Saturday,December24,202213、知人者者智，自自知者明明。胜人人者有力力，自胜胜者强。。12月-2212月-2221:10:5021:10:50December24,202214、意志坚坚强的人人能把世世界放在在手中像像泥块一一样任意意揉捏。。24十十二月20229:10:50下午午21:10:5012月-2215、最具具挑战战性的的挑战战莫过过于提提升自自我。。。十二月月229:10下下午午12月月-2221:10December24,202216、业余余生活活要有有意义义，不不要越越轨。。2022/12/2421:10:5021:10:5024December202217、一个个人即即使