转基因动物及克隆动物-精选课件

转基因动物及克隆动物TransgenicAnimalandClonalAnimal

转基因动物及克隆动物TransgenicAnimal1内容

转基因动物克隆动物概述、方法、应用体细胞克隆内容转基因动物克隆动物概述、方法、应用体细胞克隆2第一部分转基因动物第一部分转基因动物31974年Jaenisch等用病毒SV40转化的小鼠早期胚胎移植到小鼠的子宫内，在小鼠的后代中检测到SV40基因的存在，进行转基因技术尝试，这是最早有关动物转基因的报道。1980年，Gordon等首次采用受精卵原核显微注射法，首次将疱疹病毒和SV40的DNA片段导入小鼠基因组，成功制作转基因小鼠，开创了转基因动物的新纪元。一、研究概况1974年Jaenisch等用病毒SV40转化的小鼠早期胚胎41982年Palmiter-“超级巨鼠”

华盛顿大学的Palmiter将大鼠的生长激素基因注射到小鼠受精卵内,

培育出体型明显大于正常小鼠的超级鼠,

成果轰动一时。1982年Palmiter-“超级巨鼠”

华盛顿5转基因小鼠A生长速度要比普通小鼠B的生长速度平均快50%。

转基因小鼠A生长速度要比普通小鼠B的生长速度平均快50%。6

1982年Palmiter“超级巨鼠”重组质粒鼠金属巯基蛋白启动子之后

大鼠生长激素基因置于小

Plonucleus（雄原核）显微注射小鼠子宫卵移植SOUTHERN杂交检测超级巨鼠1982年Palmiter“超级巨7转基因动物及克隆动物-精选课件81987年

世界上第一只商业化转基因

绵羊诞生(Roslin研究所)1989年

精子载体法应用于转基因动物2019年

转基因克隆动物(Roslin研究所)转基因克隆羊Polly:携带有人凝血因子Ⅸ

2019年

上海遗传研究所宣布转基因试

管牛“滔滔”诞生

1987年世界上第一只商业化转基因

9三十几年里，转基因动物技术飞速发展，转基因兔、转基因猪、转基因牛、转基因鸡、转基因鱼等陆续育成。转基因动物技术已广泛应用于生物学、医学、药学、畜牧学等研究领域转基因动物及克隆动物-精选课件10转基因鼠转基因鼠115只克隆出的转基因小猪Noel、Angel、Star、Joy和Mary。5只克隆出的转基因小猪12全球首只转基因猴“Andy”全球首只转基因猴“Andy”13转基因鱼转基因鱼14转基因试管牛“滔滔”转基因试管牛“滔滔”15英国1990－2000年科研中使用转基因动物的比例图英国1990－2000年科研中使用转基因动物的比例图16

三十年来，转基因动物经历了

兴起——高潮——现在相对平稳的过程。其重要意义在于人为实现动物物种之间，甚至动物与植物、微生物之间遗传物质的交换与重组。如：改变动物性状

导入抗病基因三十年来，转基因动物经历了17二、转基因动物的概念转基因动物（Transgenicanimal）嵌合体动物（Chimericanimal）指染色体基因组中整合有外源基

并能稳定遗传给后代的一类动物部分组织细胞中整合有外源基因组的动物二、转基因动物的概念转基因动物（Transgenicani18三、转基因动物培育原理

三、转基因动物培育原理19四、方法显微注射法逆转录病毒法ES（胚胎干细胞）法四、方法20

精子载体法脂质体载体法电脉冲法基因枪法体细胞核移植技术（转基因克隆技术）精子载体法脂质体载体法电脉冲法基因枪法体21（一）显微注射法

（以培育转基因小鼠为例）（一）显微注射法221.方法1.方法23显微注射制作转基因动物流程图显微注射制作转基因动物流程图242.具体步骤

（1）前期准备实验动物：供体鼠、受体鼠、结扎雄鼠仪器设备：拉针仪、煅针仪、体视镜、显微注射仪实验试剂耗材：超排激素：PMSG、HCG、透明质酸酶（HE）、小鼠胚胎操作和培养液：M2、M16、注射用矿物油、注射针、持卵针

2.具体步骤（1）前期准备25显微注射仪显微注射仪26拉针仪煅针仪体视镜拉针仪煅针仪体视镜27（2）受精卵的采集

供体鼠超排：PMSG,ipHCG,ip

48hr输卵管膨大部受精卵的采集受精卵消化、洗涤、培养（2）受精卵的采集供体鼠超排：输卵管膨大部受28受精卵的采集受精卵的采集29受精卵的消化、培养消化、洗涤后受精卵原核清晰的受精卵受精卵的消化、培养消化、洗涤后受精卵原核清晰的受精卵30注射前注射后（3）受精卵的显微注射注射中注射前注射后（3）受精卵的显微注射注射中31（4）受精卵的移植受体假孕鼠的制备：母鼠与结扎公鼠合笼（与供体鼠同步）假孕鼠的挑选注射后收集卵的移植（4）受精卵的移植受体假孕鼠的制备：假孕鼠的挑选注射后32受精卵的移植受精卵的移植33（5）得到founder转基因小鼠

（6）对founder转基因小鼠进行鉴定、筛选、杂交获得纯合转基因小鼠（5）得到founder转基因小鼠

（6）对f34（二）逆转录病毒法（二）逆转录病毒法35关于逆转录病毒1、Retrovirus是只有一条单链RNA的病毒类的总称。2、逆转录病毒在逆转录酶（RT）的作用下可以将本身的单链RNA作为模板进行复制和遗传信息的传递。3、逆转录病毒通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用而进入宿主细胞。关于逆转录病毒1、Retrovirus是只有一条单链RNA的36原理1、逆转录病毒具有高效感染和在宿主细胞DNA上高度整合的特性。2、逆转录病毒能作为目的基因载体，通过感染早期胚胎细胞实现基因转移，产生嵌合体动物，再经过杂交、筛选即可获得转基因动物。原理1、逆转录病毒具有高效感染和在宿主细胞DNA上高度37关键步骤（1）逆转录病毒载体的构建

①提取病毒DNA②将DNA克隆载体中③酶切病毒结构蛋白编码区④将外源目的基因克隆到载体⑤转染细胞，测定外源基因的表达。

关键步骤（1）逆转录病毒载体的构建

38（2）包装细胞

决定着重组病毒效价及其宿主范围。常用φ-2细胞株（3）重组逆转录病毒感染早期胚胎载体转染包装细胞后与8细胞胚胎共培养进行转染（4）胚胎移植（5）建系（2）包装细胞

39（三）胚胎干细胞介导法（ES细胞法）（三）胚胎干细胞介导法40关于ES细胞1、胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES）人或动物的胚胎中均存在一些具有高度更新能力和多向分化能力但尚未分化的干细胞，称胚胎干细胞。2、它与早期胚胎聚集，或被注射到胚胎后，能参与宿主胚胎的发育，形成包括生殖细胞在内的所有组织。关于ES细胞1、胚胎干细胞（embryonicstemc41原理

将外源目的基因导入ES细胞，再移入胚泡期的宿主胚胎，最后将宿主胚胎移植到假孕母鼠子宫内，便可获得由胚胎干细胞介导的转基因动物。原理将外源目的基因导入ES细胞，再移入胚泡期的宿主42关键步骤①ES细胞的分离培养②ES细胞基因操作

电穿孔、显微注射、磷酸钙-DNA共沉淀、逆转录病毒感染等方法

③获取囊胚期胚胎④显微操作ES细胞注射到囊胚期胚胎内

⑤胚胎移植关键步骤①ES细胞的分离培养43三种转基因方法优缺点比较三种转基因方法优缺点比较44优点：

1、整合率相对较高2、可导入基因片断较长3、外源基因整合于所有的组织细胞中的概率高缺点：

1、整合率随机2、有些动物原核看不清，需经特殊处理才能有效导入3、需较精密仪器，费用昂贵显微注射法优点：显微注射法45优点：1、胚胎存活率高2、病毒DNA随机单拷贝整合3、宿主范围广

缺点：

1、整合率不高，整合位点是随机的2、后代多为嵌合体动物3、外源基因易发生重排或丢失4、病毒载体容量不大5、病毒DNA序列可能会干扰外源基因的表达

逆转录病毒法

优点：逆转录病毒法46优点：

1、整合率可控2、可用多种方法将外源基因导入ES细胞，其细胞的鉴定和筛选比较方便3、ES细胞注入囊胚及囊胚移植到子宫，操作比较简便

缺点：

1、ES细胞系培养、保存和维持不易2、后代多为嵌合体3、所需时间较长

ES细胞法

优点：ES细胞法47五、转基因关键技术外源目的基因的制备外源目的基因的有效导入受精卵（胚胎）培养与移植外源目的基因表达的检测等五、转基因关键技术外源目的基因的制备48六、应用价值研究基因的结构和功能及其表达与调控建立人类疾病动物模型研究人类疾病基因治疗

研制生物反应器扩大移植供体来源改良动物品种

六、应用价值研究基因的结构和功能及其表达与调控491、研究基因的结构和功能及其表达与调控Geneknockout(基因敲除)：

是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。

1、研究基因的结构和功能及其表达与调控Geneknocko502、动物疾病模型200多种动物模型建立（病毒、遗传、肿癌及眼疾病等）800余种人为改造小鼠产生其中开发最成功的是转基因小鼠2、动物疾病模型200多种动物模型建立（病毒、遗传、肿癌及眼51HBV转基因动物树鼩

HBV转基因动物树鼩523.基因治疗（genetherapy）

指将外源功能性目的基因导入病人体内，通过调控目的基因表达，抑制、替代或补偿缺陷基因，从而恢复受累细胞、组织或器官的生理功能，达到疾病治疗目的的一种方法。转基因动物为人类疾病基因治疗提供了良好的实验依据和模型3.基因治疗（genetherapy）534、研制生物反应器

生物反应器：

将药用蛋白或具有特殊意义的蛋白质基因导入动物的受精卵或早期胚胎，培育成转基因动物，使之在动物体内（如乳腺、血液等）高效表达，生产出天然活性蛋白，这种转基因动物就称之为动物生物反应器

4、研制生物反应器生物反应器：54优势目标产品产量高，容易收获目标产品质量好生产成本相对较低目标产品的提取相对较容易优势目标产品产量高，容易收获55主要动物牛、羊、猪、鸡主要靶器容乳腺、血液系统、膀胱及鸡输卵管系统主要动物牛、羊、猪、鸡主要靶器容乳腺、血液系统、膀胱56用动物乳腺表达外源基因的主要种类产品类别举例血液产品第8因子、第9因子、C蛋白、凝血酶III、

抗胰蛋白酶、血纤蛋白原抗体单克隆抗体药物干扰素、人生长激素、tPA、EPO疫苗Malaria组织维生物Collagen营养药乳白蛋白、乳铁蛋白、溶菌酶、人源化牛奶工业蛋白质蜘蛛网蛋白、贝类分泌的黏蛋白用动物乳腺表达外源基因的主要种类57我国乳腺生物反应器研究情况

目的基因名称产品的主要功能承担单位

人血清白蛋白血液溶胀剂中国农业大学人干扰素抗病毒因子中国农业大学鸡法氏囊病毒VP鸡疫苗中国农业大学第九因子血友病治疗上海儿童医院

EPO细胞因子上海儿童医院人胰岛素原糖尿病治疗新疆牧科院

TPA治疗血栓军事医学科学院人生长激素生长激素不足扬州大学我国乳腺生物反应器研究情况58现状已有约10种基因在大动物上得到高表达（1g/L以上），其中抗胰蛋白酶、凝血酶Ⅲ和葡萄糖苷酶进入临床实验阶段。世界上只有少数几头转基因牛问世，还没有生产出具有商业价值的转基因牛。现状已有约10种基因在大动物上得到高表达（1g/L以上），其59难点主要问题研制时间长、技术复杂、投资过大、风险性高转基因技术局限性基因调控机制难点主要问题研制时间长、技术复杂、转基因技术局限性60携带人血清白蛋白基因的转基因牛“滔滔”

携带人血清白蛋白基因的转基因牛“滔滔”61五、异种移植猪的器官大小、解剖生理特点与人类相似，其组织相容性抗原与人有较高的同源性。“三关”超急性排斥延缓性排斥、慢性排斥通过转基因来解决异种器官排斥的问题

五、异种移植猪的器官大小、解剖生理特点与人类相似，其组织相容62英国：将人的CD55、CD59转入猪中，在仔猪血管内皮细胞表达CD55、CD59。

将此转基因猪的心脏移植给猴，存活了10天。同济：将人的DFA转入猪中，此转基因猪的心脏在猴体内存活了90小时英国：将人的CD55、CD59转入猪中，在63六、品种改良

•

生长相关基因•产毛性能相关基因•抗病毒相关基因六、品种改良64生长激素基因转基因猪：生长速度提高了10~15%饲料报酬和瘦肉率提高了10%主要问题：

该转基因猪传了7代，仍未生产出纯合的转基因家系。生长激素基因转基因猪：65七、主要设备七、主要设备66显微操作仪显微操作仪67拉针仪煅针仪拉针仪煅针仪68电融合仪电融合仪69电极杯电极杯70细胞融合操作界面细胞融合操作界面71CO2培养箱CO2培养箱72体视显微镜体视显微镜73评述小鼠模型成功率高现转基因方法存在局限性，转基因率低现有的理论和技术还不能使人们随心所欲操

作动物基因组转基因动物仍具有商业化、产业化发展潜力评述小鼠模型成功率高74第二部分克隆动物第二部分克隆动物75克隆（Clone）WHO:遗传上同一的机体或细胞系（株）的无性生殖。克隆动物（clonalanimal）

是指用人工方法得到无性繁殖的在遗传上与亲本动物完全相同的动物克隆（Clone）WHO:遗传上同一的机体或细胞系（株）的无76动物克隆方法一、胚胎分割二、细胞核移植——胚胎细胞核移植——体细胞核移植动物克隆方法一、胚胎分割二、细胞核移植——胚胎细胞核移植77一、胚胎分割法

将未着床的早期胚胎经显微手术后，分割为二、四、六若干等份，给每个受体内植入一部分胚胎而妊娠产仔，这样由一个胚胎可以克隆出多个遗传性能完全一样的后代个体。

原理实质多胞胎复制一、胚胎分割法将未着床的早期胚胎经显微手术后，分割为78

二、核移植法（nucleartransfer）

二、核移植法79（一）胚胎细胞核移植

把发育到后期的胚胎的细胞核取出通过显微操作移植到另一去核卵中发育出新个体

1、基本思路

（一）胚胎细胞核移植把发育到后期的胚胎的细胞核取1、802、操作程序(1)卵母细胞去核：吸管吸除法紫外线照射法

(2)核供体的准备和移植:单个卵裂球(3)卵裂球与卵子的融合:电融合法(4)卵子的激活：电脉冲法(5)克隆胚胎的培养和移植2、操作程序813、存在问题

效率太低：

克隆胚胎的成活率只有10％～20％，成本太高3、存在问题82（二）体细胞核移植

2019年，《Nature》杂志发表了Roslin研究所的Wilmut等用乳腺细胞核移植培育克隆绵羊—“多莉(Dolly)”的实验报告，引起世人瞩目！

（二）体细胞核移植2019年，《Nature》杂志发表83Wilmut

andDollyWilmutandDolly84什么是体细胞克隆？将体细胞核移入去核的卵母细胞中，使卵母细胞被刺激、分裂并发育成个体，使得核供体的基因得到完全复制。什么是体细胞克隆？将体细胞核移入去核的卵母细胞中，使卵母细胞85体细胞克隆的关键环节体细胞克隆的主要程序与胚胎细胞克隆基本相同，其主要差别在供体细胞的选择血清饥饿法：在血清浓度从10℅降至0.5℅的培养液中培养5d诱导至静止期然后移入去核卵母细胞，恢复体细胞的全能性体细胞克隆的关键环节体细胞克隆的主要程序与胚胎细胞克隆基本相86技术线路图技术线路图87划时代意义理论上

证明了分化了的动物体细胞核也具有全能性，在分化过程中细胞核中的遗传物质没有不可逆变化划时代意义理论上证明了分化了的动物体细胞核也具有全能性88

证明了利用体细胞进行动物克隆的技术是可行的，将有无数相同的细胞可用来作为供体进行核移植，并且在与卵细胞相融合前可对这些供体细胞进行一系列复杂的遗传操作，从而为大规模复制动物优良品种和生产转基因动物提供了有效方法。实践上证明了利用体细胞进行动物克隆的技术是可行的，将有无数89克隆动物与克隆技术的应用1、培育遗传均一的实验动物2、培育优良畜种和拯救濒危动物

3、制备转基因克隆动物4、治疗性克隆（therapeuticcloning）

克隆动物与克隆技术的应用1、培育遗传均一的实验动物2、培育优90

此外，克隆技术在基础研究中的应用也是很有意义的，它为研究配子和胚胎发生，细胞和组织分化，基因表达调控，核质互作等机理提供了工具转基因动物及克隆动物-精选课件91存在的问题克隆技术在理论和技术上都还很不成熟。在实践中，克隆动物的成功率还很低。生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。伦理道德的冲击和公众对此的强烈反应也限制了克隆技术的应用。存在的问题克隆技术在理论和技术上都还很不成熟。92谢谢大家！谢谢大家！93转基因动物及克隆动物TransgenicAnimalandClonalAnimal

转基因动物及克隆动物TransgenicAnimal94内容

转基因动物克隆动物概述、方法、应用体细胞克隆内容转基因动物克隆动物概述、方法、应用体细胞克隆95第一部分转基因动物第一部分转基因动物961974年Jaenisch等用病毒SV40转化的小鼠早期胚胎移植到小鼠的子宫内，在小鼠的后代中检测到SV40基因的存在，进行转基因技术尝试，这是最早有关动物转基因的报道。1980年，Gordon等首次采用受精卵原核显微注射法，首次将疱疹病毒和SV40的DNA片段导入小鼠基因组，成功制作转基因小鼠，开创了转基因动物的新纪元。一、研究概况1974年Jaenisch等用病毒SV40转化的小鼠早期胚胎971982年Palmiter-“超级巨鼠”

华盛顿大学的Palmiter将大鼠的生长激素基因注射到小鼠受精卵内,

培育出体型明显大于正常小鼠的超级鼠,

成果轰动一时。1982年Palmiter-“超级巨鼠”

华盛顿98转基因小鼠A生长速度要比普通小鼠B的生长速度平均快50%。

转基因小鼠A生长速度要比普通小鼠B的生长速度平均快50%。99

1982年Palmiter“超级巨鼠”重组质粒鼠金属巯基蛋白启动子之后

大鼠生长激素基因置于小

Plonucleus（雄原核）显微注射小鼠子宫卵移植SOUTHERN杂交检测超级巨鼠1982年Palmiter“超级巨100转基因动物及克隆动物-精选课件1011987年

世界上第一只商业化转基因

绵羊诞生(Roslin研究所)1989年

精子载体法应用于转基因动物2019年

转基因克隆动物(Roslin研究所)转基因克隆羊Polly:携带有人凝血因子Ⅸ

2019年

上海遗传研究所宣布转基因试

管牛“滔滔”诞生

1987年世界上第一只商业化转基因

102三十几年里，转基因动物技术飞速发展，转基因兔、转基因猪、转基因牛、转基因鸡、转基因鱼等陆续育成。转基因动物技术已广泛应用于生物学、医学、药学、畜牧学等研究领域转基因动物及克隆动物-精选课件103转基因鼠转基因鼠1045只克隆出的转基因小猪Noel、Angel、Star、Joy和Mary。5只克隆出的转基因小猪105全球首只转基因猴“Andy”全球首只转基因猴“Andy”106转基因鱼转基因鱼107转基因试管牛“滔滔”转基因试管牛“滔滔”108英国1990－2000年科研中使用转基因动物的比例图英国1990－2000年科研中使用转基因动物的比例图109

三十年来，转基因动物经历了

兴起——高潮——现在相对平稳的过程。其重要意义在于人为实现动物物种之间，甚至动物与植物、微生物之间遗传物质的交换与重组。如：改变动物性状

导入抗病基因三十年来，转基因动物经历了110二、转基因动物的概念转基因动物（Transgenicanimal）嵌合体动物（Chimericanimal）指染色体基因组中整合有外源基

并能稳定遗传给后代的一类动物部分组织细胞中整合有外源基因组的动物二、转基因动物的概念转基因动物（Transgenicani111三、转基因动物培育原理

三、转基因动物培育原理112四、方法显微注射法逆转录病毒法ES（胚胎干细胞）法四、方法113

精子载体法脂质体载体法电脉冲法基因枪法体细胞核移植技术（转基因克隆技术）精子载体法脂质体载体法电脉冲法基因枪法体114（一）显微注射法

（以培育转基因小鼠为例）（一）显微注射法1151.方法1.方法116显微注射制作转基因动物流程图显微注射制作转基因动物流程图1172.具体步骤

（1）前期准备实验动物：供体鼠、受体鼠、结扎雄鼠仪器设备：拉针仪、煅针仪、体视镜、显微注射仪实验试剂耗材：超排激素：PMSG、HCG、透明质酸酶（HE）、小鼠胚胎操作和培养液：M2、M16、注射用矿物油、注射针、持卵针

2.具体步骤（1）前期准备118显微注射仪显微注射仪119拉针仪煅针仪体视镜拉针仪煅针仪体视镜120（2）受精卵的采集

供体鼠超排：PMSG,ipHCG,ip

48hr输卵管膨大部受精卵的采集受精卵消化、洗涤、培养（2）受精卵的采集供体鼠超排：输卵管膨大部受121受精卵的采集受精卵的采集122受精卵的消化、培养消化、洗涤后受精卵原核清晰的受精卵受精卵的消化、培养消化、洗涤后受精卵原核清晰的受精卵123注射前注射后（3）受精卵的显微注射注射中注射前注射后（3）受精卵的显微注射注射中124（4）受精卵的移植受体假孕鼠的制备：母鼠与结扎公鼠合笼（与供体鼠同步）假孕鼠的挑选注射后收集卵的移植（4）受精卵的移植受体假孕鼠的制备：假孕鼠的挑选注射后125受精卵的移植受精卵的移植126（5）得到founder转基因小鼠

（6）对founder转基因小鼠进行鉴定、筛选、杂交获得纯合转基因小鼠（5）得到founder转基因小鼠

（6）对f127（二）逆转录病毒法（二）逆转录病毒法128关于逆转录病毒1、Retrovirus是只有一条单链RNA的病毒类的总称。2、逆转录病毒在逆转录酶（RT）的作用下可以将本身的单链RNA作为模板进行复制和遗传信息的传递。3、逆转录病毒通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用而进入宿主细胞。关于逆转录病毒1、Retrovirus是只有一条单链RNA的129原理1、逆转录病毒具有高效感染和在宿主细胞DNA上高度整合的特性。2、逆转录病毒能作为目的基因载体，通过感染早期胚胎细胞实现基因转移，产生嵌合体动物，再经过杂交、筛选即可获得转基因动物。原理1、逆转录病毒具有高效感染和在宿主细胞DNA上高度130关键步骤（1）逆转录病毒载体的构建

①提取病毒DNA②将DNA克隆载体中③酶切病毒结构蛋白编码区④将外源目的基因克隆到载体⑤转染细胞，测定外源基因的表达。

关键步骤（1）逆转录病毒载体的构建

131（2）包装细胞

决定着重组病毒效价及其宿主范围。常用φ-2细胞株（3）重组逆转录病毒感染早期胚胎载体转染包装细胞后与8细胞胚胎共培养进行转染（4）胚胎移植（5）建系（2）包装细胞

132（三）胚胎干细胞介导法（ES细胞法）（三）胚胎干细胞介导法133关于ES细胞1、胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES）人或动物的胚胎中均存在一些具有高度更新能力和多向分化能力但尚未分化的干细胞，称胚胎干细胞。2、它与早期胚胎聚集，或被注射到胚胎后，能参与宿主胚胎的发育，形成包括生殖细胞在内的所有组织。关于ES细胞1、胚胎干细胞（embryonicstemc134原理

将外源目的基因导入ES细胞，再移入胚泡期的宿主胚胎，最后将宿主胚胎移植到假孕母鼠子宫内，便可获得由胚胎干细胞介导的转基因动物。原理将外源目的基因导入ES细胞，再移入胚泡期的宿主135关键步骤①ES细胞的分离培养②ES细胞基因操作

电穿孔、显微注射、磷酸钙-DNA共沉淀、逆转录病毒感染等方法

③获取囊胚期胚胎④显微操作ES细胞注射到囊胚期胚胎内

⑤胚胎移植关键步骤①ES细胞的分离培养136三种转基因方法优缺点比较三种转基因方法优缺点比较137优点：

1、整合率相对较高2、可导入基因片断较长3、外源基因整合于所有的组织细胞中的概率高缺点：

1、整合率随机2、有些动物原核看不清，需经特殊处理才能有效导入3、需较精密仪器，费用昂贵显微注射法优点：显微注射法138优点：1、胚胎存活率高2、病毒DNA随机单拷贝整合3、宿主范围广

缺点：

1、整合率不高，整合位点是随机的2、后代多为嵌合体动物3、外源基因易发生重排或丢失4、病毒载体容量不大5、病毒DNA序列可能会干扰外源基因的表达

逆转录病毒法

优点：逆转录病毒法139优点：

1、整合率可控2、可用多种方法将外源基因导入ES细胞，其细胞的鉴定和筛选比较方便3、ES细胞注入囊胚及囊胚移植到子宫，操作比较简便

缺点：

1、ES细胞系培养、保存和维持不易2、后代多为嵌合体3、所需时间较长

ES细胞法

优点：ES细胞法140五、转基因关键技术外源目的基因的制备外源目的基因的有效导入受精卵（胚胎）培养与移植外源目的基因表达的检测等五、转基因关键技术外源目的基因的制备141六、应用价值研究基因的结构和功能及其表达与调控建立人类疾病动物模型研究人类疾病基因治疗

研制生物反应器扩大移植供体来源改良动物品种

六、应用价值研究基因的结构和功能及其表达与调控1421、研究基因的结构和功能及其表达与调控Geneknockout(基因敲除)：

是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。

1、研究基因的结构和功能及其表达与调控Geneknocko1432、动物疾病模型200多种动物模型建立（病毒、遗传、肿癌及眼疾病等）800余种人为改造小鼠产生其中开发最成功的是转基因小鼠2、动物疾病模型200多种动物模型建立（病毒、遗传、肿癌及眼144HBV转基因动物树鼩

HBV转基因动物树鼩1453.基因治疗（genetherapy）

指将外源功能性目的基因导入病人体内，通过调控目的基因表达，抑制、替代或补偿缺陷基因，从而恢复受累细胞、组织或器官的生理功能，达到疾病治疗目的的一种方法。转基因动物为人类疾病基因治疗提供了良好的实验依据和模型3.基因治疗（genetherapy）1464、研制生物反应器

生物反应器：

将药用蛋白或具有特殊意义的蛋白质基因导入动物的受精卵或早期胚胎，培育成转基因动物，使之在动物体内（如乳腺、血液等）高效表达，生产出天然活性蛋白，这种转基因动物就称之为动物生物反应器

4、研制生物反应器生物反应器：147优势目标产品产量高，容易收获目标产品质量好生产成本相对较低目标产品的提取相对较容易优势目标产品产量高，容易收获148主要动物牛、羊、猪、鸡主要靶器容乳腺、血液系统、膀胱及鸡输卵管系统主要动物牛、羊、猪、鸡主要靶器容乳腺、血液系统、膀胱149用动物乳腺表达外源基因的主要种类产品类别举例血液产品第8因子、第9因子、C蛋白、凝血酶III、

抗胰蛋白酶、血纤蛋白原抗体单克隆抗体药物干扰素、人生长激素、tPA、EPO疫苗Malaria组织维生物Collagen营养药乳白蛋白、乳铁蛋白、溶菌酶、人源化牛奶工业蛋白质蜘蛛网蛋白、贝类分泌的黏蛋白用动物乳腺表达外源基因的主要种类150我国乳腺生物反应器研究情况

目的基因名称产品的主要功能承担单位

人血清白蛋白血液溶胀剂中国农业大学人干扰素抗病毒因子中国农业大学鸡法氏囊病毒VP鸡疫苗中国农业大学第九因子血友病治疗上海儿童医院

EPO细胞因子上海儿童医院人胰岛素原糖尿病治疗新疆牧科院

TPA治疗血栓军事医学科学院人生长激素生长激素不足扬州大学我国乳腺生物反应器研究情况151现状已有约10种基因在大动物上得到高表达（1g/L以上），其中抗胰蛋白酶、凝血酶Ⅲ和葡萄糖苷酶进入临床实验阶段。世界上只有少数几头转基因牛问世，还没有生产出具有商业价值的转基因牛。现状已有约10种基因在大动物上得到高表达（1g/L以上），其152难点主要问题研制时间长、技术复杂、投资过大、风险性高转基因技术局限性基因调控机制难点主要问题研制时间长、技术复杂、转基因技术局限性153携带人血清白蛋白基因的转基因牛“滔滔”

携带人血清白蛋白基因的转基因牛“滔滔”154五、异种移植猪的器官大小、解剖生理特点与人类相似，其组织相容性抗原与人有较高的同源性。“三关”超急性排斥延缓性排斥、慢性排斥通过转基因来解决异种器官排斥的问题

五、异种移植猪的器官大小、解剖生理特点与人类相似，其组织相容155英国：将人的CD55、CD59转入猪中，在仔猪血管内皮细胞表达CD55、CD59。

将此转基因猪的心脏移植给猴，存活了10天。同济：将人的DFA转入猪中，此转基因猪的心脏在猴体内存活了90小时英国：将人的CD55、CD59转入猪中，在156六、品种改良

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生长相关基因•产毛性能相关基因•抗病毒相关基因六、品种改良157生长激素基因转基因猪：生长速度提高了10~15%饲料报酬和瘦肉率提高了10%主要问题：

该转基因猪传了7代，仍未生产出纯合的转基因家系。生长激素基因转基因猪：158七、主要设备七、主要设备159显微操作仪显微操作仪160拉针仪煅针仪拉针仪煅针仪161电融合仪电融合仪162电极杯电极杯163细胞融合操作界面细胞融合操作界面164CO2培养箱CO2培养箱165体视显微镜体视显微镜166评述小鼠模型成功率高现转基因方法存在局限性，转基因率低现有的理论和技术还不能使人们随心所欲操

作动物基因组转基因动物仍具有商业化、产业化发展潜力评述小鼠模型成功率高167第二部分克隆动物第二部分