451-阿司匹林预防环磷酰胺致大鼠骨质疏松的实验研究

阿司匹林预防环磷酰胺致大鼠骨质疏松的实验研究于琼1,吴铁1，崔燎2，林坚涛1，陈志东1(1.广东医学院药理教研室,广东湛江524023；2.广东天然药物研究与开发重点实验室，广东湛江524023)

摘要：目的用环磷酰胺造成大鼠的骨质疏松模型，观察中、低剂量的阿司匹林对它的影响，并与碳酸钙加VitD进行比较。方法：三月龄的SPF大鼠分成空白对照组、环磷酰胺组(以·kg-1·d-1的环磷酰胺灌胃)、碳酸钙维D组（环磷酰胺+碳酸钙维D·kg-1·d-1，灌胃）、中剂量阿司匹林组（环磷酰胺+阿司匹林45mg·kg-1·d-1,灌胃）、低剂量阿司匹林组（环磷酰胺+阿司匹林9mg·kg-1·d-1,灌胃），连续15d。实验结束后，取大鼠左侧胫骨远端不脱钙包埋切片作骨组织形态计量学测量。同时观察大鼠胸腺，脾脏的重量指数，以及外周血白细胞数量。结果环磷酰胺可使大鼠外周血白细胞数量和脾脏指数明显下降，本实验剂量的阿司匹林不能有效对抗这种免疫抑制。环广东省科技计划项目（2004B30101003）作者简介：于琼,女,24岁，在读硕士。TelE-mail:audrey@.广东省科技计划项目（2004B30101003）作者简介：于琼,女,24岁，在读硕士。TelE-mail:audrey@.吴铁,通信作者，导师；男,51岁,教授。研究方向:骨质疏松药理学、中药药理学。TelE-mail:wutie@.崔燎，通信作者，导师；女，43岁，教授，博士，研究方向:骨质疏松药理学。TelE-mail:cui-liao@[关键词]阿司匹林；环磷酰胺；大鼠；骨质疏松；骨形态计量学环磷酰胺(Cyclophsphamide，CP)在临床上被广泛用于抗肿瘤治疗，同时也作为免疫抑制剂广泛用于免疫性疾病和变态反应的治疗。环磷酰胺应用时副作用较多，毒性也大，严重影响到该药的继续应用，特别是近年来已报道该药有使骨密度迅速减少，继而出现骨质疏松(osteoporosis,OP)[1]的不良反应，使我们预防环磷酰胺不良反应的困难明显增加了。另一方面，环磷酰胺致骨质疏松的作用为我们提供了药物致骨质疏松的研究方法，本项目组曾用环磷酰胺分别建立了大鼠和小鼠骨质疏松动物模型[2，3]，探讨环磷酰胺对骨的影响，并试图寻找到能预防环磷酰胺导致骨质疏松的不良反应，同时又能增强其药理作用的药物。阿司匹林作为百年老药，有着极其神奇的一面，它能参与多种生理活动，又可在不同剂量下呈现出不同的作用机制。Carbone等[4]的调查表明，服用阿司匹林的人往往具有着更高的骨密度；早在1991年就曾报道阿司匹林可影响正常大鼠的骨再建过程，而且存在明显的剂量依赖性[5]，但该研究仅停留在了大剂量上，其结果表现出骨代谢抑制作用[6]，对中、低剂量却未能涉及。阿司匹林对某些肿瘤也有抗癌作用[7，8]，本项目组曾证明阿司匹林对人肺腺癌细胞有明显的诱导凋亡作用[9]，本项目组以前的研究也发现阿司匹林有明显的免疫增强作用[10,11]，阿司匹林能否对抗环磷酰胺应用时副作用？能否在抗癌治疗方面与环磷酰胺联合应用增强抗癌作用而减轻其不良反应？能否在免疫性疾病和变态反应性疾病的治疗方面与环磷酰胺联合应用增强抗炎作用而减轻其不良反应？本研究重点探讨阿司匹林对环磷酰胺导致的骨质疏松的骨代谢影响，为阿司匹林对环磷酰胺联合应用进行实验研究。本实验用环磷酰胺作为工具药物造成大鼠的骨质疏松和免疫抑制模型，观察中低剂量的阿司匹林的作用效果，并与阳性对照药物碳酸钙维D进行比较，现报道如下：1材料与方法

1.1药品与试剂药品阿司匹林（药用原料药）：由山东新华制药股份提供，使用时用少量乙醇促溶后用生理盐水调整到实验室所需浓度。中剂量是根据体面积法由正常成人500mg日用量换算而来，稀释5倍为低剂量。环磷酰胺：江苏恒瑞医药股份,批号：403501。碳酸钙维D片：美国安士制药公司，批号：5B16656，每片相当于钙300mg,VitD100单位。试剂盐酸四环素：上海新亚制药厂生产，批号：891224-18；甲基丙烯酸甲酯：北京化工厂生产，批号：940117；Calcein(SigmachemicalCo.USA，lot：61F0527)；骨组织染料(Masson-GoldnerTrichrome；PonceanFuchsinStock；Phosotungsticacid-Oragne；Lightgreen；SliverNitrate)等均为Sigma产品。

1.2实验仪器AE240电子天平(梅特勒-托利多仪器公司上海分公司生产)，XSZ-0800生物显微镜（广西梧州市光学仪器厂），血细胞计数板(上海求精生化仪器)，低速锯(BuehlerLTDUSA)，Leica组织切片机(德国)，LEICAQWN半自动图象分析仪(德国莱卡)。

1.3实验方法实验动物与分组3月龄±42.2）g，由广东医学院实验动物中心提供，SPF级，动物合格证号：2005A023。按体重对等原则随即分成5组，每组9只。A组为正常对照组:该组大鼠每天灌胃给予5ml·kg-1·d-1生理盐水。B组为模型组（环磷酰胺组），该组大鼠每天·kg-1·d-1。C组为阳性药物对照组（碳酸钙维D组），该组大鼠每天·kg-1·d-1·kg-1·d-1。D组为中剂量阿司匹林组：该组大鼠每天·kg-1·d-1及阿司匹林45mg·kg-1·d-1。E组为低剂量阿司匹林组：该组大鼠每天·kg-1·d-1及阿司匹林9mg·kg-1·d-1。5组动物均自由饮水和进食标准饲料。实验共给药15天，实验结束时，尾静脉取血做白细胞计数。后心脏取血处死，取胸腺和脾脏用AE240电子天平称重，计算器官指数，脾脏指数指脾脏重量与体重的比值，胸腺指数指胸腺重量与体重的比值。取左侧胫骨进行骨组织形态计量学测量。骨组织形态计量学测量[12]大鼠在处死前11、10d和4、3d分别给予四环素(30mg·kg-1)和calcein(8mg·kg-1)标记各2次，以在骨组织形成双荧光标记。大鼠给药15d后测定体重，处死并取左侧胫骨，除尽肌肉与组织，用低速锯将其分为2段，取上段曝露骨髓腔，固定于10％PBS福尔马林液24h，按硬组织切片法用甲基丙烯酸甲酯包埋不脱钙骨，切取两张4μm薄片及一张9μm厚片，薄片分别进行Masson-Coldner染色和AgNO3染色后封片，厚骨片则直接封片，厚、薄片皆在距骺线1mm处至远端3mm范围内进行松质骨的骨形态计量学参数测量。骨组织形态计量学静态参数包括：骨小梁面积百分数(％Tb．Ar)，骨小梁厚度(Tb．Th)，骨小梁数量(Tb．N)，骨小粱分离度(Tb.SP)，动态参数包括荧光标志周长百分数(％L．Pm)，矿化沉积率(MAR)，骨小粱周长形成率(BFR／BS)，骨小粱面积形成率(BFR／BV)，骨小粱体积形成率(BFR/TV)，每毫米破骨细胞数量(Oc.N/mm)。1．3．4数据处理参数值用(X±S)表示，各组之间的差异性用组间t检验。用变化率表示各实验组大鼠相对参数的变化〔如:变化率A=(待比较组/A组-1)×100%〕2结果阿司匹林对环磷酰胺大鼠体重、器官指数及血白细胞的影响阿司匹林对环磷酰胺大鼠体重、器官指数及血白细胞的影响见表1：

表1阿司匹林对环磷酰胺大鼠体重、器官指数及血白细胞的影响组别体重（g）脾脏指数(mg/g)胸腺指数(mg/g)血白细胞数（109/L）A正常对照组±±±±B环磷酰胺组±±±±变化率A(%)****C碳酸钙维D组±5±±±变化率A(%)***变化率B(%)D中量阿司匹林组±±±±变化率A(%)**变化率B(%)E低量阿司匹林组±±±±变化率A(%)***变化率B(%)注:n=9;A、B为变化率:A是与对照组比较,B是与环磷酰胺模型组比较;P<0.05,**P<0.01,***由表1可见，环磷酰胺对大鼠的体重和胸腺指数没有明显影响，说明本试验剂量的环磷酰胺对大鼠毒性不大。但脾脏指数（p<0.05）和血白细胞数(p<0.001)都有明显下降,提示环磷酰胺在本实验用量已可对大鼠产生了明显的免疫抑制作用。而阿司匹林和碳酸钙维D都不能对抗环磷酰胺的免疫抑制。2.2阿司匹林对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态学的影响阿司匹林对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态学影响见附图1：附图1：环磷酰胺和防治药物对大鼠胫骨骨组织形态学影响图1a为正常对照组，该组的动物骨小梁呈现结构紧密、粗细均匀、连续性好；图1b为环磷酰胺模型组，该组动物骨小梁结构明显稀疏，细小，个别呈结节或钮扣状，出现大片无骨小梁骨髓区；图1c为碳酸钙维D组，该组动物的小梁骨较图1b明显增粗，增多，连续性有所恢复；图1d为中剂量阿司匹林组，该组动物的骨小梁粗细均匀，分布均匀，连续性好，较图1b在小梁骨的数量、宽度、长度、以及分布上都有了大幅改善；图1e为低剂量阿司匹林组，该组动物的小梁骨多且粗、排列有序，连续性较好，较图1b明显改善。2.3阿司匹林对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态计量学静态参数的影响阿司匹林对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态计量学静态参数的影响见表2：表2阿司匹林对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态计量学静态参数的影响组别骨小梁面积百分数(%)骨小梁厚度(μm)骨小梁数量(mm-1)骨小粱分离度（μm）A正常对照组±±±422±143B环磷酰胺组±±0±708±247变化率A(%)*******C碳酸钙维D组±±±472±173变化率A(%)-6.72变化率B(%)*****D中量阿司匹林组1±5±2.50±396±190变化率A(%)变化率B(%)********E低量阿司匹林组1±5±2.20±0.7446±181变化率A(%)变化率B(%)******注:n=9;A、B为变化率:A是与对照组比较,B是与环磷酰胺模型组比较;P<0.05,**P<0.01,***由表2可见：环磷酰胺可使大鼠胫骨上段松质骨），骨小粱分离度增加了67.8%(P<0.01)；提示环磷酰胺可使大鼠的小梁骨明显变稀，变薄，甚至断裂，骨髓空腔增大。阿司匹林和碳酸钙维D防治组的骨小梁数量、厚度以及面积百分数都显著增加（P<））,这一结果提示中、低量的阿司匹林以及碳酸钙维D都可有效对抗环磷酰胺所诱导的骨质疏松样改变，增加骨量，使骨小梁紧密，连续性强。2.4阿司匹林对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态计量学动态参数的影响阿司匹林对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态计量学动态参数的影响见表3表3阿司匹林对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态计量学动态参数的影响组别%L．Pm/%MARBFR／BSBFR／BVBFR/TVA正常对照组785.2±4683.3±25B环磷酰胺组42.6±2192.1±24变化率A(%)*******C碳酸钙维D组±134±15变化率A(%)*变化率B(%)*********D中量阿司匹林组±1.288±0.28±±1472±1±18变化率A(%)*****变化率B(%)**********E低量阿司匹林组1±1.279±0.2912.9±1±961±12.3±17变化率A(%)**变化率B(%)**********注:n=9;A、B为变化率:A是与对照组比较,B是与环磷酰胺模型组比较;P<0.05,**P<0.01,***由表3可见，环磷酰胺使大鼠五个骨形成的指标都），其中骨小1））；提示环磷酰胺在不影响骨吸收的情况下,明显抑制骨形成，使成骨细胞的数量、活性降低，骨基质矿化减少，骨再建处于负平衡中。阿司匹林和碳酸钙维D都明显增加环磷酰胺大鼠的骨形成参数值，其中三个骨形成率都呈大幅增长），骨矿化沉积率较正常大鼠也）；提示中、低剂量的阿司匹林以及碳酸钙维D可有效对抗环磷酰胺的骨形成抑制作用，促进成骨细胞的自身增值和分化，增加胶原矿化和新骨形成。3.1环磷酰胺可致实验大鼠产生免疫抑制，阿司匹林对此无预防作用环磷酰胺作为临床广泛使用的化疗药物，有明显的免疫抑制作用，本实验采用的环磷酰胺给药量对大鼠的体重没有影响，对大鼠的胸腺指数也没有明显影响，提示了该实验大鼠还没有产生明显的药物毒性作用，但该实验用量的环磷酰胺已可使大鼠的外周血白细胞数和脾脏指数显著地降低，产生了明显的免疫抑制作用。而阿司匹林并无法对抗这一免疫抑制作用，与阿司匹林能促进免疫分子、干扰素和白细胞介素-1的生成而提高机体免疫力的报道结果不一致[13]，可能与使用剂量和作用机制有关，有待进一步研究。3.2环磷酰胺可致实验大鼠骨量明显丢失，本实验剂量的阿司匹林能有效地预防骨丢失从骨组织形态计量学研究的静态参数结果可见：环磷酰胺能使大鼠骨量减少，骨小梁结构疏松退化，提示环磷酰胺可使大鼠产生明显的骨丢失，导致典型的骨质疏松的形态学改变；而阿司匹林可使骨小梁增多，变粗，增加环磷酰胺大鼠的骨量，改善骨微观结构，且中剂量的效果稍优于低剂量，提示了阿司匹林具有预防环磷酰胺致大鼠骨质疏松的作用，该作用可能与阿司匹林改善血流循环以及抑制脂质过度氧化等作用有关。3.3环磷酰胺致实验大鼠骨质疏松与其抑制骨形成有关，阿司匹林的预防机制是促进骨形成骨骼在整个生命过程都处于骨吸收和骨形成的动态平衡之中，这一平衡与破骨细胞和成骨细胞的功能密切相关。任何因素引起的成骨细胞生成减少、活性抑制或破骨细胞生成增加、过度活化，都将使骨形成弱于骨吸收，而引起骨丢失导致骨质疏松[14]。从骨组织形态计量学研究的动态参数结果显示：环磷酰胺组可反映成骨细胞数量和活性的%L．Pm/%，MAR分别下降了50.8%，21.6%，代表骨形成和骨转换活跃程度的主要指标BFR／BV也下降了50%,而骨吸收参数却无明显改变。提示环磷酰胺诱导大鼠产生骨质疏松是在不影响骨吸收的情况下，降低成骨细胞的数量和活性，使骨形成弱于骨吸收，而致使大鼠骨丢失。阿司匹林组的%L．Pm/%，MAR，BFR／BV三个指标都有大幅增长，低剂量组分别增加了148.8%，95.3%，243.9%；中剂量组则分别增加了330%，94.8%，363.1%，且较正常大鼠也有明显增加）；而两个剂量组的改变都不具有显著性，提示了阿司匹林预防环磷酰胺致大鼠的骨质疏松是由于上调成骨细胞功能，促进骨吸收，使骨吸收强于骨形成。3.4阿司匹林预防环磷酰胺致骨质疏松的机制探讨环磷酰胺对骨形成的抑制作用，可能是因为：（1）骨形成与成骨细胞功能密切相关，成骨细胞起源于多能的骨髓基质的间质细胞，主要功能是分泌骨胶原，以及参与类骨质矿化，促进新骨形成[14]。环磷酰胺可破坏细胞DNA和抑制核酸合成，可能通过抑制了骨髓基质的间质细胞向成骨细胞分化，降低成骨细胞活性，使胶原的合成与矿化受阻，从而抑制骨形成，导致骨丢失。（2）骨细胞和免疫细胞通过各自新释放的细胞因子和体液因子，共同发挥着骨髓与骨之间的彼此关联的机能，保障骨钙平衡，支持骨形成和骨重建，一旦平衡破坏，骨形成则会被抑制[14]。环磷酰胺作为免疫抑制剂，可明显减少骨髓有核细胞数量，破坏骨髓微环境，极可能通过破坏骨与免疫的平衡，而抑制骨形成。（3）环磷酰胺损伤胃肠道，使机体对钙质的吸收和利用减弱，可沉积的骨钙减少，而影响骨的矿化。阿司匹林预防环磷酰胺致骨质疏松的机制探讨：（1）阿司匹林具有骨形成的促进作用，使%L．Pm/%，MAR，BFR等重要的骨形成指标都明显增长，其中中剂量组的骨形成较正常大鼠活跃。（2）文献报道阿司匹林具有清除超氧化物酶、羟基和其他自由基的作用,具有保护细胞DNA的抗氧化活性[15，16]，可能对抗环磷酰胺对成骨细胞合成和分化的影响，促进骨形成作用。（3）阿司匹林具有抑制血小板的聚集，减轻凝血反应，改善微循环的作用，该作用可改善与骨重建相密切交流的骨髓微循环环境,对骨的营养和提高成骨细胞功能具有重要的意义；（4）阿司匹林具有促进高密度脂蛋白形成的作用，该作用可抑制脂质的过度氧化，预防动脉粥样硬化，同时可改善骨内血循环，抑制骨髓细胞成脂化，从而维持骨代谢正常[17]。3.5阿司匹林预防环磷酰胺致骨质疏松的意义（1）联合应用于肿瘤治疗环磷酰胺已被广泛运用于肿瘤的治疗，而阿司匹林也开始被用于预防癌症的发生发展。而二者是从不同角度对肿瘤细胞产生作用，其中环磷酰胺是通过直接破坏肿瘤细胞的DNA而抑制其生长繁殖；阿司匹林则是通过抑制COX-2的表达等作用[7]，促进肿瘤细胞调亡，预防癌症发生和转移。本研究观察到阿司匹林可有效地对抗环磷酰胺所导致的骨丢失，如果能将两者联合应用于肿瘤治疗，那么既可以增强环磷酰胺的抗肿瘤作用，又可预防骨质疏松的发生。（2）联合应用于风湿性疾病治疗在临床上，环磷酰胺和阿司匹林都已经被广泛应用于风湿病的防治中。环磷酰胺作为免疫抑制剂，能够减少炎症并抑制免疫系统，主要通过改变DNA的合成，干扰细胞繁殖而起作用；阿司匹林通过抑制环氧化酶，减少炎症物质的产生，控制炎症引起的一系列症状。如果能以适当的剂量将两者联合运用于风湿病的治疗，既有效地控制风湿病的症状，又预防了环磷酰胺导致的骨丢失。参考文献：[1]MichaudLB,GoodinS.Cancer-treatment-inducedboneloss,part1.[MiscellaneousArticle].AmericanJournalofHealth-SystemPharamy.2003,63(5):419-430.[2]王永东，吴铁，刘晓青,等.环磷酰胺对大鼠骨组织形态计量学的影响.中国药理学通报.2001,17(5):575-8.[3]崔阳，吴铁，刘钰瑜.环磷酰胺致小鼠骨质疏松及何首乌的防治作用.中国骨质疏松杂志.2004,10(2):165-8.[4]CarboneLD,Tylavsky，CauleyJA,etal.Associationbetweenbonemineraldensityandtheuseofnonsteroidalanti-inflammatorydrugsandaspirin:impactofcyclooxygenaseselectivity.JBoneMinerRes.2003,18(10):1795-802.[5]SolheimLF,RonningenH,LangelandN.Effectsofacetylsalicylicacidandnaproxenonthemechanicalpropertiesofintactfemorainrats.ArchOrthopTraumaSurg.1986,105(1):5-10.[6]SolheimLF,RonningenH,LangelandN.Effectsofacetylsalicylicacidonheterotopicboneresorptionandformationinrats.ArchOrthopTraumaSurg.1986,105(3):142-5.

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Preventiveeffectofaspirinoncyclophosphamide-inducedbonelossinratsYuQiong1,WuTie1,CUILiao2，etal(1.DeptofPharmacology,GuangongMedicalCollege,Zhangjiang524023,Guangdong,China;2.GuangdongkeyLaboratoryforResearchandDevelopmentofNaturalDrugs,GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524023)[Abstract]ObjectiveTostudyosteoporosisofratsinducedbycyclophosphamideandinvestigatethepreventiveeffectsofaspirinonbonehistomorphometryoftherats.MethodsForty-five3month-oldSPFratswererandomlydividedintofivegroups:①intactratswasgivenwithvehicleascontrol(Intact+Veh);②·kg-1·d-1asthemodelgroup(CP+Veh);③calciumcarbonatewithvitamineDatdoseof0.4mg·kg-1·d-1wereaddedtothecyclophosphamidetreatedrats(CP+VD)④asiprinatdoseof