原核表达调控与色氨酸操纵子

关于原核表达调控与色氨酸操纵子第一页，共五十五页，2022年，8月28日转录：在DNA指导的RNA聚合酶催化下，以DNA链的一条链为模板，按照碱基配对原则合成RNA链的过程。不对称转录：在DNA双链分子中，转录通常只在DNA的一条链上进行，另一条链则不能转录，但可能对转录起调节作用，这种转录方式称不对称转录。转录单位：就是从启动子到终止子的一段DNA序列。第一节转录概述第二页，共五十五页，2022年，8月28日一、基因的编码链和有意义链

模板链：用于转录RNA的链称为模板链，或负（－）链，又称无义链。编码链：与模板链互补的DNA链称为编码链，或正（＋）链，又称有义链。第三页，共五十五页，2022年，8月28日二、转录的基本要点

底物：NTP；模板：反义链；方向：5’→3’；酶：RNA

pol；产物：RNA单链第四页，共五十五页，2022年，8月28日转录和复制：都是遗传信息的传递第五页，共五十五页，2022年，8月28日三、转录起始位点转录起点位点核苷酸为＋1。上游序列upstream：转录起点的前面的序列，用负数码（－）表示，起点前一个核苷酸为－1。下游序列downstream：

转录起点的后面的序列，用正数码（＋）表示。没有编号为○的碱基。第六页，共五十五页，2022年，8月28日第七页，共五十五页，2022年，8月28日第二节原核生物转录的过程

RNA的转录包括promotion，elongation，termination

三过程；从promoter到terminator称为transcriptionalunit；原核生物中的转录单位多为

polycistron；转录起始点记为+1，其上游记为负值，下游记为正值。+1

-10

+10upstreamstartpointdownstream第八页，共五十五页，2022年，8月28日一、转录的起始

关键：全酶能以很高的亲和性结合在启动子promoter；启动子：RNA聚合酶识别、结合并起始转录的一段DNA序列。第九页，共五十五页，2022年，8月28日转录的起始核心酶在σ因子帮助下特异性结合到DNA上；RNA

pol与启动子-35box结合，形成封闭型起始复合物；酶滑动到-10box，转变成为开放型起始复合物，启动子活化，双链解开，模板链暴露，插入最初的2个核苷酸；酶继续加上开头的几个NTP，形成三元起始复合物，在RNA链合成了8～9个碱基后，σ因子解离，转录开始。第十页，共五十五页，2022年，8月28日ModeloftheinteractionbetweenE.coilRNApolymeraseholoenzymeandapromoterDNAIncorporatingthefirstfewNt第十一页，共五十五页，2022年，8月28日二、原核生物转录的延伸

RNA

pol沿着模板链移动，RNA链不断延伸，并保持三元复合物的结构；转录泡中的DNA螺旋前开、后合，RNA延长，不断脱离DNA；RNA链的延伸速度不是恒定的，在模板富含GC的区域，转录就会减慢/停顿。第十二页，共五十五页，2022年，8月28日17bp螺旋解开长度12bpDNA-RNA复合体长度第十三页，共五十五页，2022年，8月28日影响RNA延伸速度的因素：①RNA

pol；②暂停信号：导致转录速度突然出现变化的特殊序列。GC富集区：产物RNA不易释放；IR：产物形成茎环结构，妨碍上游的模板恢复双链。③其他配基：ppNpp、NusA蛋白。第十四页，共五十五页，2022年，8月28日NusAprotein：

★69Kd,acidprotein★RNApol-attachingfactor★

ImpelRNApol.pausinginterminatorfor1’-15’andwaitingfor

Rho

factortostoptranscriptionofRNA

★Afterinitiation→substitutingσ→NusA+coreE

antitermination

Nproteinutilizationsubstance第十五页，共五十五页，2022年，8月28日第十六页，共五十五页，2022年，8月28日三、原核生物转录的终止

转录的终止依赖于RNA产物的特定序列；原核和某些真核生物的终止子要求转录产物RNA3’端具有发夹的二级结构，茎部富有GC序列；终止子的分类：根据终止反应是否需要ρ蛋白第十七页，共五十五页，2022年，8月28日1、不依赖于ρ因子的终止子（强终止子）结构特点：RNA具有一个发夹结构（富含GC）和随后polyU片段。作用机制：RNApol+发夹结构→转录暂停→后随杂合分子不稳定的poly(U-dA)→RNA容易从模板上脱落→RNA-DNA-RNApol解聚→转录终止第十八页，共五十五页，2022年，8月28日第十九页，共五十五页，2022年，8月28日2、依赖于ρ因子的终止子（弱终止子）

ρ因子：55kD，六聚体。能够利用水解ATP释放的能量使RNA从三元复合物中释放出来；结构：仍然具有茎环结构，但GC碱基对含量较少，下游也缺乏polyU结构。

第二十页，共五十五页，2022年，8月28日第二十一页，共五十五页，2022年，8月28日第三节原核生物转录的调控基因表达的调控主要发生在转录水平；转录水平上的调控是最为经济、灵活，又是最为重要、复杂的调控；①确定需要转录基因的起始位点；②精细调节基因表达的水平；③cisfactor与transfactor严格又灵活的互作；④保证RNApol的连续转录，准确终止。第二十二页，共五十五页，2022年，8月28日一、原核转录调控的相关概念

（一）诱导和阻遏：诱导：酶的合成取决于特定物质（常为substrate）的存在。如培养基中乳糖的存在促进了E.coli的半乳糖苷酶的合成；阻遏：当培养基中某种物质（常为product）含量较高，细胞就关闭合成这种物质的能力。如培养基中Trp的存在抑制了E.coli

Trp的合成；第二十三页，共五十五页，2022年，8月28日（二）调控的效应物调节蛋白+小分子物质→原核操纵子的诱导/阻遏。这些小分子是基因表达的调节物质--效应物。诱导物（inducer）：与调节蛋白结合，使其从DNA分子上脱落下来，RNApol开始转录。辅阻遏物（co-repressor）：与调节蛋白结合，可以提高调节蛋白与操纵基因的亲和性，进而关闭结构基因的转录。第二十四页，共五十五页，2022年，8月28日（三）正调控和负调控

正调控：调节蛋白与操纵子结合后促进转录的进行。负调控：调节蛋白与操纵子结合后抑制转录的进行。正、负调控都存在着诱导和阻遏。第二十五页，共五十五页，2022年，8月28日二、操纵子理论（operonconcept）定义：原核生物基因表达和调控的单元。包括：①结构基因：编码控制某一代谢途径的相关的酶；②调控元件：是调节结构基因转录的一段DNA序列，包括启动子和操纵基因；③调节基因：其产物（调节蛋白）能够识别并结合操纵基因，决定结构基因的转录与否。主要见于原核生物的转录调控，如乳糖操纵子、阿拉伯糖操纵子、组氨酸操纵子、色氨酸操纵子等第二十六页，共五十五页，2022年，8月28日色氨酸操纵子色氨酸操纵子(Trpoperon)是一种重要的操纵子，是联合使用或转录的一组基因，也是用来编码生成色氨酸的元件之一。色氨酸操纵子是在许多细菌存在，但首次在大肠杆菌中得到表征。当在环境中存在足量的色氨酸，它将不被使用。第二十七页，共五十五页，2022年，8月28日1.大肠杆菌色氨酸操纵子结构较简单，也是研究得最清楚的操纵子，结构基因依次排列为trpEDC2BA，其中trpGD和trpCF基因融合。2.枯草杆菌色氨酸操纵子的结构有所不同，7个结构基因中的6个依次排列为trpEDCFBA，存在于含有12个结构基因的芳香族氨基酸超操纵子（arooperon），第7个结构基因，trpG存在于叶酸合成操纵子中，该酶参与Trp和叶酸的合成。有2个启动子参与调控，一个位于arooperon的起始位置，另一个则位于trpE上游约200bp处。第二十八页，共五十五页，2022年，8月28日RPOLaEDCB

A调节基因前导区弱化子间隔区结构基因间隔区调节作用601621560159311961350804第二十九页，共五十五页，2022年，8月28日Trp的调控作用途径

Trp合成途径较漫长，消耗大量能量和前体物，受到严格调控，其中色氨酸操纵子发挥着关键作用。调控作用主要有三种方式：阻遏作用、弱化作用以及终产物Trp对合成酶的反馈抑制作用。阻遏作用1.trp操纵子转录起始的调控是通过阻遏蛋白实现的。产生阻遏蛋白的基因是trpR，该基因距trpoperon基因簇很远。它结合于trp操纵基因特异序列，阻止转录起始。在有高浓度Trp存在时，阻遏蛋白-色氨酸复合物形成一个同源二聚体，并且与色氨酸操纵子紧密结合，因此可以阻止转录。当Trp水平低时，阻遏蛋白以一种非活性形式存在，不能结合DNA。在这样的条件下，trp操纵子被RNA聚合酶转录，同时Trp生物合成途径被激活。第三十页，共五十五页，2022年，8月28日RPOLaEDCB

A高色氨酸时

低色氨酸时

AUG前导肽邻氨基苯甲酸合酶邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶吲哚甘油磷酸合酶色氨酸合酶α和β亚基mRNAmRNA第三十一页，共五十五页，2022年，8月28日弱化作用

trp操纵子转录终止的调控是通过弱化作用（attenuation）实现的。枯草杆菌色氨酸操纵子表达主要受到色氨酸激活RNA结合蛋白(Trp-activatedRNA-bindingprotein,TRAP）的调节。该蛋白与色氨酸结合被激活后，可与trpE上游转录产物结合，导致转录终止。当色氨酸浓度较低时，TRAP失活，转录可以继续，结构基因得以表达。第三十二页，共五十五页，2022年，8月28日反馈抑制作用由于基因表达必然消耗一定的能源和前体物，相对于阻遏和弱化作用，反馈抑制作用更为经济和高效。终产物Trp对催化分支途径几步反应的酶具有反馈抑制作用，其50%抑制浓度分别为：邻氨基苯甲酸合酶，0.0015mmol·L-1；邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶，0.15mmol·L-1;色氨酸合成酶,7.7mmol·L-1。对于普通野生菌株，邻氨基苯甲酸合酶对Trp合成起到关键调控作用，常被称为瓶颈酶；但对高产Trp工程菌而言，上述任何一种酶的反馈抑制都会直接影响Trp产量。第三十三页，共五十五页，2022年，8月28日TheBacillussubtilisTRAPProteinCanInduceTranscriptionTerminationintheLeaderRegionoftheTryptophanBiosynthetic(trp)OperonIndependentofthetrpAttenuatorRNA2014第三十四页，共五十五页，2022年，8月28日1.InBacillussubtilis,transcriptionofthetryptophanbiosyntheticoperonisregulatedbyanattenuationmechanism.2.Whenintracellulartryptophanlevelsarehigh,theTRAP(trpRNA-bindingattenuationprotein)proteinbindstothe5‘leaderregionofthenascenttrpmRNAandinduces

transcriptiontermination.3.Inlimitingtryptophan,TRAPdoesnotbindandtheoperonistranscribed.TwocompetingRNAsecondarystructurestermedtheantiterminatorandterminator(attenuator)canformintheleaderregionRNA.ResearchBackground第三十五页，共五十五页，2022年，8月28日4.In

priorattenuationmodels,theonlyroleofTRAPbindingwastoaltertheRNAsecondarystructuretoallowformationoftheattenuator,whichhasbeenthoughtfunctionasanintrinsictranscriptionterminator.5.However,recentstudieshaveshownthattheattenuatorisnotaneffectiveintrinsicterminator.6.FromthesestudiesitwasnotclearwhetherTRAPfunctionsindependentlyorrequiresthepresenceoftheattenuatorRNAstructure.第三十六页，共五十五页，2022年，8月28日Figure1.ModeloftranscriptionattenuationoftheB.subtilistrpoperon.第三十七页，共五十五页，2022年，8月28日ResearchPurposes1.ToexaminetheroleoftheattenuatorRNAinTRAP-mediatedtranscriptiontermination,toexaminewhetherTRAPfunctionsindependentlyorrequiresthepresenceofthe

attenuatorRNAstructure.第三十八页，共五十五页，2022年，8月28日MaterialandMethods1.BacterialstrainsandtransformationsE.coliK802wasusedasahostforplasmidconstructionandpropagation.B.subtilisBG2087(argC4)andBG4233(argC4DmtrB)wereusedashostsfortransformationandintegrationofgenefusions.BG4233containsadeletioninmtrB(fromcodons7–62),whichencodesTRAP.第三十九页，共五十五页，2022年，8月28日Maincontent1.TRAPinducesefficienttranscriptionterminationwithinthetrpleaderregioninvivowhentheattenuatorismutated.2.TRAPinducesefficienttranscriptionterminationinvivowithinthetrpleaderregioninwhichtheattenuatorsegmentisdeleted.3.MappingthelocationofTRAP-mediatedtranscriptionterminationwithinthemutanttrpleaderregions.4.TRAPdoesnotcauseefficienttranscriptionterminationwithinthemutanttrpleaderregionsinvitro.5.NusAandthetimingofTRAPbindingtothenascentRNAareimportantinTRAP-mediatedtranscriptiontermination.第四十页，共五十五页，2022年，8月28日Results1.TRAPinduces

efficienttranscriptiontermination

withinthetrpleaderregioninvivowhentheattenuatorismutated.A.DiagramdepictingtheWTandmutant

trpattenuatorswithalteredbases

inthestem-loopstructureorU-stretch.第四十一页，共五十五页，2022年，8月28日B.SchematicrepresentationofthetranscriptionalreporterfusionswithlacZthatwereusedtoexamineTRAP-mediatedregulationoftranscriptionterminationinvivo.第四十二页，共五十五页，2022年，8月28日第四十三页，共五十五页，2022年，8月28日

TheresultsinTable1showthatTRAPisabletoinducetranscriptionterminationinthetrpleaderregiondespitesignificantalterationstothestem-looportotheU-richtractoftheattenuator.Butthelocationwhereterminationoccursintrpleaderregionscontainingalteredattenuatorswillbeaddressedbelow.第四十四页，共五十五页，2022年，8月28日2.TRAPinducesefficienttranscriptionterminationinvivo

withinthetrpleaderregioninwhichtheattenuator

segmentisdeleted.Figure3.Diagramdepictingdeletionmutationsinthestem-loopandU-stretchofthetrpattenuator.stem-loopofthetrpattenuator108142第四十五页，共五十五页，2022年，8月28日第四十六页，共五十五页，2022年，8月28日3.MappingthelocationofTRAP-mediatedtranscription

terminationwithinthemutanttrpleaderregions.A

(A)SchematicdiagramofRNaseprotectionassays(RPA)using32P-labeledantisenseprobesandcellularRNAfromB.subtilis.第四十七页，共五十五页，2022年，8月28日(B)RNaseprotectionassaystodeterminelocationoftranscriptionterminationintrpleaderregionscontainingmutantattenuatorsinexcesstryptophan.第四十八页，共五十五页，2022年，8月28日

TogethertheseresultsdemonstratethattranscriptsfromthetrpE'-'lacZfusioncontainingtheU-stretch(US)ortheDisruptedstem(DS)mutantattenuatorterminateatapproximatelythesamelocationastranscriptsthatterminateattheWTattenuator.第四十九页，共五十五页，2022年，8月28日4.TRAPdoesnotcauseefficienttranscriptionterminationwithinthemutanttrpleaderregionsinvitro.(A)DiagramofDNAtemplatesusedforinvitrotranscriptionattenuationassays.

(B)6%polyacrylamide-8Mureagelelectrophoresisanalysisoftheproductsofinvitrotranscriptionofthewildtype(WT),U-stretch(US),mismatchstem(MM),anddisruptedstem(DS)templatesintheabsenceandpresenceof0.25or0.5mMTRAP.500uMNTP第五十页，共五十五页，2022年，8月28日

PreviousstudieshaveshownthatNusA

stimulatesRNAPpausingatpositions107and144withintheB.subtilistrpleaderregion.

Pausingatposition107hasbeensuggestedtoprovidetimeforTRAPtobindthenascentRNAbeforeRNAPprogressesbeyondtheattenuatorregion.Hence,wetestedwhetherthepresenceofNusAcouldenhanceTRAP-mediatedterminationatthesemutantattenuators.第五十一页，共五十五页，2022年，8月28日5.NusAandthetimingofTRAPbindingtothenas