液体活检医学课件

液体活检在肿瘤精准治疗中的研究进展

1液体活检在肿瘤精准治疗中的研究进展内容摘要一.液体活检1）cfDNA&ctDNA&CTC概念和最新研究进展二.CTC/CTSC研究方法和进展

2）液体活检应用和意义三.我们的研究2内容摘要一.液体活检1）cfDNA&ctDNA&CT液态活检来源于肿瘤组织，存在于血液中：循环肿瘤细胞（CTC）循环肿瘤DNA（ctDNA）肿瘤外泌体exosome提示肿瘤发展进程及抗药性等信息，指导个体化精准治疗DiazLAJr,BardelliA.LiquidBiopsies:GenotypingCirculatingTumorDNA.JClinOncol.2014;32(6):579–5863液态活检来源于肿瘤组织，存在于血液中：DiazLAJr,cfDNAWhat:循环游离DNA，机体细胞释放入外周血循环后发生部分降解的内源性DNA。高度片段化，约170bp。Source:正常细胞、异常细胞（如肿瘤细胞），病毒DNA等State:半衰期短，动态表达量，核小体以单个、双联或三联的形式进入血液，并逐步分解。cfDNA（cell-freeDNA）4cfDNAWhat:循环游离DNA，机体细胞释放入外周血循ctDNAWhat:循环肿瘤DNA，是指肿瘤细胞DNA经脱落或细胞凋亡后释放进入循环系统。一种特征性的肿瘤生物标记物，可以被定性、定量和追踪。

Source:来源于肿瘤细胞的cfDNA，属于cfDNA的一种类型。不同患者的水平差异显著，受肿瘤负荷，分期等因素的影响ctDNA（circulatingtumorDNA）5ctDNAWhat:循环肿瘤DNA，是指肿瘤细胞DNA经脱cfDNA&ctDNAEllenHeitzer,PeterUlz,andJochenB.Geig.CirculatingTumorDNAasaLiquidBiopsyforCancer.ClinicalChemistry.2015,112–1236cfDNA&ctDNAEllenHeitzer,Pet1：CAPP-Seq（cancerpersonalizedprofilingbydeepsequencing）癌症个体化深度测序分析方法:利用定制化的NimbleGenSeqCapEZChoiceLibrary作为”筛选器“对样本靶向捕获后再深度测序，灵敏度高，特异性强且经济可行。

2：利用数字错误抑制（IDES）的方法和CAPP-seq（ctDNA测序方法），能够检测到频率低至0.004％的突变等位基因NewmanAM,LovejoyAF,KlassDM,etal.IntegrateddigitalerrorsuppressionforimproveddetectionofcirculatingtumorDNA.NatureBiotechnology(2016)doi:10.1038/nbt.3520ctDNA-高通量测序71：CAPP-Seq（cancerpersonalizedcfDNA－片段谱系分析Deepsequencingofcirculatingcell-freeDNAyieldsadense,genome-widemapofnucleosomeoccupancythatenablesidentificationofitscell-typesoforigin,potentiallyenablingthenoninvasivemonitoringofabroadersetofclinicalconditionsMatthewW.Snyder,MartinKircher,AndrewJ.Hilletal.Cell-freeDNAComprisesanInVivoNucleosomeFootprintthatInformsItsTissues-Of-Origin.Cell.2016Jan14;164(1-2):57-68.8cfDNA－片段谱系分析DeepsequencingofCTCWhat：

循环肿瘤细胞，是指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。Source:原发肿瘤和转移灶都会释放CTC。可检测到的CTC是肿瘤细胞在循环系统微环境下生存竞争的结果。CTC（circulatingtumorcells）9CTCWhat：循环肿瘤细胞，是指从实体瘤中脱离出来并进液体活检应用价值（监测肿瘤特异性突变发现肿瘤复发）EllenHeitzer,PeterUlz,andJochenB.Geig.CirculatingTumorDNAasaLiquidBiopsyforCancer.ClinicalChemistry.2015,112–12310液体活检应用价值（监测肿瘤特异性突变发现肿瘤复发）Ellen液体活检应用价值（分析耐药株的遗传变异）EllenHeitzer,PeterUlz,andJochenB.Geig.CirculatingTumorDNAasaLiquidBiopsyforCancer.ClinicalChemistry.2015,112–12311液体活检应用价值（分析耐药株的遗传变异）EllenHeit

液体活检优势及前景液态活检无侵入性、可频繁多次检测及快速反应能力均体现出发展潜力巨大应用价值。将削减无效肿瘤医疗开支、降低医疗成本。适应症广泛，如乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、食管癌等常见肿瘤均可用液态活检技术进行诊断与监测。2015年美国发布的肿瘤治疗计划的四大举措之一：“液态活检”血浆开发新方法来评估治疗反应以及抵抗可能的耐药性。根据中国国家癌症中心发布的数据，我国5年内诊断为癌症且仍存活的病例数约为749万。也是液态活检巨大的市场。

12液体活检优势及前景液态活检无侵入性、可频繁多次检测及快速反CTC研究概况1）CTC与转移的关系

2）CTC异质性与肿瘤治疗3）CTC应用和意义4）CTC研究方法13CTC研究概况1）CTC与转移的关系13CTCs(circulatingtumorcells,CTCs)

Ashworth早在1896年就提出了循环肿瘤细胞的概念。侵入循环系统的肿瘤细胞，大部分由于机体的免疫识别、机械杀伤及自身凋亡在短期内死亡，只有极少数存活下来，在适于自身存活和增殖的器官或组织形成转移灶。14CTCs(circulatingtumorcellCTC与肿瘤转移SimonAJoosse,TobiasMGorges,andKlausPantel.Biology,detection,andclinicalimplicationsofcirculatingtumorcells.EMBOMolMed.2015;7(1):1–11.15CTC与肿瘤转移SimonAJoosse,TobiasBrouwerA,DeLaereB,PeetersD,etal.consequencesofheterogeneityinthecirculatingtumorcellcompartment.Oncotarget.2016Mar9.doi:10.18632/oncotarget.8015.CTC异质性16BrouwerA,DeLaereB,PeetersCTC应用和意义CTCs肿瘤转移预测肿瘤治疗CTCs数量改变反映了肿瘤细胞对各种治疗方案的敏感性和有效性，为个体化治疗提供依据。监测早期转移乳腺癌、前列腺癌结肠癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌多种肿瘤监测CTCs基因表达／突变，找到药物敏感的靶点，指导个体化治疗17CTC应用和意义CTCs肿瘤转移预测肿瘤治疗CTCs数量改变CTC优化治疗方案2014年GoldKorn，接受多西他赛联合阿曲生坦治疗的转移性去势抵抗性前列腺癌患者，基线循环肿瘤细胞CTC数量可预测预后，3周时CTC升高提示总生存较差，有望作为重新指导和优化治疗的较好指标。GoldkornA，ElyB，QuinnDI，etal．CirculatingTumocellcountsarePrognosticofoverallsurvivalinSWOGS0421：aPhaseIIITrialofdocetaxelwithorwithoutatrasentanForMetastaticcastrationresistantprostatecancer.JClinOncol201432(11)：1136-1142．2012年Bian,乳癌患者在接受化疗（白蛋白结合型紫杉醇+卡培他滨+曲妥珠单抗）前后CTC变化。治疗前：CTC

3，HER-2+；1疗程：

CTC0。6疗程：病理学CR。证实CTC值在乳腺癌治疗早期发生显著变化，能够准确预示疗效，能够科学指导选择治疗方案。BianL，WangT，LiuY，etal．Evaluationoftreatmentresponseforbreastcancer：areweEnteringtheeraof”biologicalCompleteremission”?．ChinJCancerRes．2012，24：403-407．18CTC优化治疗方案2014年GoldKorn，接受多CTCs的研究方法RamdaneHarouaka,ZhigangKang,Si-YangZheng,LiangCao.Circulatingtumorcells:Advancesinisolationandanalysis,andchallengesforclinicalapplications.Pharmacology&Therapeutics.2014;141:209–221.19CTCs的研究方法RamdaneHarouaka,Zh研究方法（1）-CellSearchCellSearch系统是唯一经FDA批准进入临床应用的CTCs检测方案。原理：EpCAM抗体标识的微磁珠从全血中捕获细胞，用免疫荧光识EpCAM+CK+CD45−进行磁性分离。CTCEpCAMCKCD45DAPI20研究方法（1）-CellSearchCellSearch系CellSearch

数据解读:1.7.5ML外周血判断阈值：转移性乳腺癌CTCs≥5

细胞前列腺癌CTCs≥5细胞结肠癌：CTCs≥3细胞表明预后不良3.目前FDA只批准用于以上三种肿瘤21CellSearch数据解读:21CTCs的研究方法（2）-基因芯片22CTCs的研究方法（2）-基因芯片22CTCs的研究方法（3）-测序

XiaohuiNia,MingleiZhuo,ZheSua，etal.Reproduciblecopynumbervariationpatternsamongsinglecirculatingtumorcellsoflungcancerpatients.PNA,2013,52(110)21083-21088.23CTCs的研究方法（3）-测序

XiaohuiNia,MXiaohuiNia,MingleiZhuo,ZheSua，etal.Reproduciblecopynumbervariationpatternsamongsinglecirculatingtumorcellsoflungcancerpatients.PNA,2013,52(110)21083-21088.24XiaohuiNia,MingleiZhuo,ZheRamdaneHarouaka,ZhigangKang,Si-YangZheng,LiangCao.Circulatingtumorcells:Advancesinisolationandanalysis,andchallengesforclinicalapplications.Pharmacology&Therapeutics.2014;141:209–221.CTCs的分离方法（1）25RamdaneHarouaka,ZhigangKanCTCs的分离方法（2）-体外培养MinYu,AdityaBardia,NicolaAceto,etal.Exvivocultureofcirculatingbreasttumorcellsforindividualizedtestingofdrugsusceptibility.Science.2014;345(6193):216–220.PapanicolaoustainingforunculturedprimaryRepresentativeimagesofnonadherentCTCimmunofluorescentstaining：CK：red；Ki67：yellow；CD45：green；DAPI：blue.26CTCs的分离方法（2）-体外培养MinYu,AditCTSC研究概况1）CTSC定义

2）CSC,CTC,CTSC三者关系

3）CTSC研究进展4）CTSC研究难点和未来方向27CTSC研究概况1）CTSC定义27CTSC背景介绍循环肿瘤干细胞（circulatingtumorstemcells,CTSCs）：CTCs中具有干细胞特性，即自我更新及分化潜能的一小群细胞。作为标志物CTSC具有更重要的临床价值。EMT可使CTCs获得干细胞特性，而具有药物耐受性和高侵袭性。CTSC已在包括肝癌，乳腺癌，胃癌，结直肠癌等多种肿瘤中被证实。28CTSC背景介绍循环肿瘤干细胞（circulatingtCSC,CTC,CTSC（肿瘤转移等级结构图）YangMH,ImraliA,HeeschenC.Circulatingcancerstemcells:theimportancetoselect.ChinJCancerRes.2015Oct;27(5):437-49.29CSC,CTC,CTSC（肿瘤转移等级结构图）YangMarkersforCTSCYangMH,ImraliA,HeeschenC.Circulatingcancerstemcells:theimportancetoselect.ChinJCancerRes.2015Oct;27(5):437-49.30MarkersforCTSCYangMH,Imral乳腺癌CTSC研究进展学者们采用不同的表面标志物组合来定义CTSC：Epcam/CK/CD44／CD24；Epcam/CK/ALDH1／CD24Epcam/CK/Vimentin/Fibernectin；Epcam/CK/TWISTI/Akt2PDKaEpcam/Muc1/HER2Kasimir—BauerS，Hoffmann0，WallwienerD，eta1．ExpressionOfstemcellandepithelial—mesenchymaltransitionmarkersinPrimarybreastcancerPatientsWithcirculatingtumorcells[J]．BreastCancerRes，2012，14(1)：R15．BaccelliI，SchneeweissA，RiethdorfS，eta1．Identificationofapopulationofbloodcirculatingtumorcellsfrombreastcancerpatientsthatinitiatesmetastasisinaxenografiassay[J]．NatBiotechnol，2013，31(6)：539．544．31乳腺癌CTSC研究进展学者们采用不同的表面标志物组合来定义C乳腺癌CTSC研究进展YuM．BardiaA，WittnerBS．eta1．CirculatingbreasttumorcellsExhibitdynamicchangesInEpithelialandmesenehymaleompostion[J]．Science，2013，339(6119)：580-584．

EPCAMlowMEThighCD47highCD44high32乳腺癌CTSC研究进展YuM．BardiaA，Wittn

2013年上海复旦大学附属肝癌研究所樊嘉及周俭研究组通过研究123例肝癌患者CTCs相关肿瘤干细胞免表标记物，包括CD133、ABCG2、CD90、β-catenin、E-cadherin以及Vimentin。2013年Liu等鉴于ICAM-1可能是肝癌干细胞标志物，也采用流式细胞术检测了肝癌血样，发现部分病例可检出CD45-ICAM-1+细胞，这样的细胞具有较强的体外成球和体内致瘤能力。Y.F.,etal.,Circulatingstemcell-likeepithelialcelladhesionmolecule-positivetumorcellsindicatepoorprognosisofhepatocellularcarcinomaaftercurativeresection.Hepatology,2013.57(4):p.1458-68。LiuS,LiN,YuX,etal.Expressionofintercellularadhesionmolecule1byhepatocellularcarcinomastemcellsandcirculatingtumorcells[J].Gastroenterology,2013,144(5):1031-1041肝癌CTSCs研究进展332013年上海复旦大学附属肝癌研究所樊嘉及周俭研究我们的研究

1)CSCandmiRNA2)CTCandCTSC34我们的研究

1)CSCandmiRNA34项目研究基础—前期基金支持1.2014年福建省卫教联合项目：结直肠癌循环肿瘤细胞和肿瘤干细胞的分子机制研究（WKJ-FJ-14）2.2012年福建省科技厅重点项目:《循环肿瘤细胞与肿瘤干细胞在恶性肿瘤个体化治疗中的应用研究》（2012Y0017）；3.2012年福建省卫生厅青年课题:《结直肠癌循环肿瘤细胞及其上皮间质变标志物的定量检测》（2012-2-13）；4.2012年福建省自然科学基金项目:《miR-148家族-靶蛋白网络在肝癌干细胞中调控机制研究》（2012J05138）；

5.2011年福建省医学创新课题:《乳腺癌循环肿瘤细胞（CTC）及其单细胞多基因检测的临床意义》（2011-CX-16）；6.2011年福建省自然科学基金项目:《循环肿瘤细胞及其耐药基因表达水平在晚期乳腺癌化疗敏感性中的应用研究》（2011J01141）35项目研究基础—前期基金支持1.2014年福建省卫教联合项目

－基金支持8.2009年福建省自然科学基金项目:《靶向乳腺癌干细胞的树

突状瘤苗抗肿瘤的研究》(2009J01118)9.2008年福建省自然科学基金项目:《miRNA靶向肝癌SP、NSP

细胞基因差异表达的研究》（2008J0077）7.2016年福建省自然科学基金项目：《miR-194调控肝癌干细

胞的靶基因和LncRNA鉴定》（2016J01436）36－基金支持8.2009年福建省自然科学基金项目:《靶向MoFlo超高速流式细胞分选系统稀有细胞检测的灵敏度高分选速度快

研究基础设备37MoFlo超高速流式细胞分选系统稀有细胞检测的灵敏度高分选速CSC-Sidepopulation(SP)assayItisgenerallyacceptedthatSPcellspossessstemcellcharacteristics.Critical:

OptimizeHoechst33342stainingproceduretoachieveaconsistentandtumorigenicSPsubtypeasSPapproachisbasedonthefunctionalpropertyofCSCstoexcludeHoechst-33342-dyeviaABCtransporters.SPNSP38CSC-Sidepopulation(SP)assay-MoFloanalysisandsorting39-MoFloanalysisandsorting39-SphereformationassayFloatingsphereswereformedbySPcells,whilenonebyNSPcellsHep-3BPLC/PRF/5Huh-740-SphereformationassayFloatin实验数据-TumorsformedinNOD/SCIDmicePLC/PRF/5Huh-7Hep-3BWeek12;1×103cells;SP:bluearrow;NSP:redarrow.41实验数据-TumorsformedinNOD/SCIDmiRNAprofilingresultbyRT-qPCRmiRNAIDSP/NSPFoldchangesP<0.05miR-9-3miR-9*-2.41miR-23b-2.12miR-27b-2.35miR-96-2.8miR-151-3p-2.65miR-151-5p-2.57miR-183*-2.23miR-183-3.16miR-194-2.03miR-146a-3.44miR-148b-3.14miR-340-3p-2.85miR-421-2.32miRNAIDSP/NSPFoldchangesP<0.05

miR-135b*-3.55miR-489-3.28miR-15a-2.79miR-21-2.67miR-22-2.5miR-365-2.47miR-450a-5p-2.46miR-7a-2.44miR-26b-2.28miR-125a-5p-2.27miR-25-2.22miR-126-3p-2.15miR-182-2.14Atotalof370miRNAspecieswereanalyzedinPLC/PRF/5SPandNSPcells,27miRNAswereidentifiedasdifferentiallyexpressed,allofwhichweredown-regulatedinSP.42miRNAprofilingresultbyRT-q实验数据-miR-148b在SP中低表达43实验数据-miR-148b在SP中低表达43实验数据--miR-148b改变SP比例44实验数据--miR-148b改变SP比例44实验数据--miR-148b改变增殖与耐药45实验数据--miR-148b改变增殖与耐药45实验数据-miR-148b改变迁移侵袭与血管生成46实验数据-miR-148b改变迁移侵袭与血管生成46实验数据-miR-148b过表达抑制肿瘤生成47实验数据-miR-148b过表达抑制肿瘤生成47实验数据-miR-148b沉默促进肿瘤生成48实验数据-miR-148b沉默促进肿瘤生成48研究方案——CTC/CTSC49研究方案——CTC/CTSC49研究方案——分选流程50研究方案——分选流程50已完成200例鼻咽癌患者CTC检测，100例乳腺癌患者CTC检测，100例肺癌患者CTC检测，150例直肠癌患者CTC/CTSC检测，具备完善的CTC检测技术流程。在研项目：150例初诊未治肠癌患者，跟踪其全病程临床资料并抽取各阶段血样，分析患者各个时期CTCs/CTSCs数值，以PSF为观察点，评估CTCs/CTSCs数值与临床分期、预后、治疗方案及疗效等情况的相关性，尤其是手术配合细胞治疗的疗效观察，开发CTC/CTSC在疗效评估中的应用。研究数据51已完成200例鼻咽癌患者CTC检测，100例乳腺癌患者CTC入组初诊未治肠癌患者150例跟踪患者全程临床资料并抽取各阶段血样（TIL组：根治术前、术后第一次细胞治疗后、细胞治疗2个周期后、细胞治疗3个周期后……对照组：根治术前、术后7天、术后1月，术后2月……每月一次

）利用Moflo对CTCs/CTSCs计数患者各个时期CTCs/CTSCs数值与临床分期、预后、治疗方案及疗效等情况相关性以PSF为观察点，评估手术配合细胞治疗的疗效观察52入组初诊未治肠癌患者150例利用Moflo对CTCs/CTS难点和关键技术CTC/CTSC研究难点稀有性：仅占PBMC的1/106活性：难以保持细胞活性进行后续研究单细胞性：细胞稀少难以进行后续研究分选精度可达到1/106可保持分选后细胞的活性进行单细胞水平RNA提取和预扩增，保证下游基因表达谱分析的质量MoFlo超高速流式细胞分选系统REPLI-gWTASingleCellKit本项目关键技术53难点和关键技术CTC/CTSC研究难点稀有性：仅占PBMC的流式分析CTC敏感性专一性检测研究数据54流式分析CTC敏感性专一性检测研究数据54研究数据CTCs的画门模式55研究数据CTCs的画门模式55研究数据CTSCs的画门模式56研究数据CTSCs的画门模式56CTCs的检测研究数据57CTCs的检测研究数据57研究数据CTSCs的检测58研究数据CTSCs的检测58首诊初治结直肠癌患者CTC/CTSC检测分析结果PatientCharacteristicsNumber(%)CTC、CTSC(CD44+)p-value

<3≧3Age(years)0.157≦6025(50.0)1015>6025(50.0)1312Sex0.205female20(40.0)1010man30(60.0)1317Tumorsize(cm)0.189<526(52.0)1313≧524(48.0)1014TNMstage0.072I5(10.0)41II11(22.0)92III29(58.0)218IV5(10.0)14Tstage0.118T12(4.0)11T25(10.0)50T34(8.0)31T439(78.0)2613RLNM0.032N017(34.0)143N121(42.0)1011N212(24.0)102M(metastasis)0.024M045(90.0)3411M15(10.0)14研究数据59首诊初治结直肠癌患者CTC/CTSC检测分析结果Patien结直肠癌患者转移后化疗期间CTC/CTSC变化跟踪研究数据60结直肠癌患者转移后化疗期间CTC/CTSC变化跟踪研究数据6CTC分选分选白细胞对照：DAPI+/CD45-/Epcam-分选CTC细胞：DAPI+/CD45-/Epcam+61CTC分选分选CTC细胞：DAPI+/CD45-/Epcam实验方案62实验方案62研究数据-表达谱芯片聚类图肿瘤组织正常组织CTC细胞白细胞对照63研究数据-表达谱芯片聚类图肿瘤组织正常组织CTC实验方法CNV区域中CN与基因表达的相关分析图表达谱芯片比较基因组杂交64实验方法CNV区域中CN与基因表达的相关分析图表达谱芯片近年发表文章QinyingLiu,YangmeiXu,Shenghong,etal.miRNA-148bsuppresseshepaticcancerstemcellbytargetingneuropilin1.BioscienceReports,2015;35(4).XuYM,XieYQ,WangXR,etal.IdentificationofcancerstemcellsfromhepetocellularcarcinomacelllinesandtheirrelatedmicroRNAs.OncolRep.2013.30:2056-62.龚福生，黄伟炜，刘健,等.乳腺癌患者循环肿瘤细胞检测的临床意义.中华肿瘤防治杂志,2015,22(13):1009-1013.Identificationofperioperativecirculatingtumorcellsandpotentialbiomarkersofcirculatingtumorstemcellsincolorectalcancerpatientsbyflowcytometry.待发表袁婕郑秋红徐鹭英，等.流式细胞术检测鼻咽癌患者外周血循环肿瘤细胞及临床相关性分析第八届中国肿瘤学术大会暨第十三届海峡两岸肿瘤学术会议论文，2014.6.ZhengQH,etal.FloatingcellswithstemcellpropertiesingastriccelllineSGC-7901.Tumori.2011.97:393-399.7.ZhengQH,XuYM,WeiZQ,etal.Isolationandpurificationofcancerstem-likecellsfromcelllinePLC/PRF-5.ChineseTumorBiologicalTherapyJournal,2011,18(2):126-132.8.LaiL,CuiC,JinJ,etal.Mouseembryonicstemcell-derivedthymicepithelialcellprogenitorsenhanceT-cellreconstitutionafterallogeneicbonemarrowtransplantation.Blood.2011.118(12):3410-3418.65近年发表文章QinyingLiu,YangmeiXu,近年发表文章ChenG,WangL,LuJ,etal.OpticalDiagnosisforLungCancerUsingMultiphotonImaging.Scanning.2013.doi:10.1002/sca.21076.YanJ,TanC,GuF,etal.SorafenibdelaysrecurrenceandmetastasisafterlivertransplantationinaratmodelofhepatocellularcarcinomawithhighexpressionofpERK.LiverTranspl.2013.doi:10.1002/lt.23619.ChenL,ZhangWW,ZhengQH,etal.AculeatusquinonesA-D,novelmetabolitesfromthemarine-derivedfungusAspergillusaculeatus.Heterocycles.2013.Publishedonline.ZhengQF,WangJJ,YingMG,etal.Omentoplastyinpreventinganastomoticleakageofoesophagogastrostomyfollowingradicaloesophagectomywiththree-fieldlymphadenectomy.EurJCardiothoracSurg.2013.43(2):274-8.ChenY,ZhengX,ChenG,etal.ImmunoassayforLMP1innasopharyngealtissuebasedonsurface-enhancedRamanscattering.IntJNanomedicine.2012.7:73-82.YanJ,ZhuoS,ChenG,etal.Preclinicalstudyofusingmultiphotonmicroscopytodiagnoselivercanceranddifferentiatebenignandmalignantliverlesions.JBiomedOpt.2012.17(2):026004.7.ZhuoS,YanJ,ChenG,etal.Label-freeimagingofbasementmembranesdifferentiatesnormal,precancerous,andcancerouscolonictissuesbysecond-harmonicgenerationmicroscopy.PLoSOne.2012.7(6):e38655.8.YingM,ZhuoS,ChenG,etal.Real-timenoninvasiveopticaldiagnosisforcolorectalcancerusingmultiphotonmicroscopy.Scanning.2012.34(3):181-5.66近年发表文章66未来发展方向1.高新技术已逐渐渗入CTCs/CTSCs的分离与分析，新研发的技术设备功能更强，性能与检测效果逐步提高。2.单细胞全基因测序技术及单细胞基因组学可解决血液CTCs/CTSCs数量稀少的难题，能检测更多药效相关基因及分析耐药机制，为CTCs/CTSCs的分子分型及靶向药物治疗提供更准确的信息。67未来发展方向1.高新技术已逐渐渗入CTCs/CTSCs的分结语谢谢！液体活检，肿瘤精准治疗的宠儿！！！68结语谢谢！液体活检，肿瘤精准治疗的宠儿！！！68CSCsandmiRNAsTakahashiR.,etal.,Front.Genet.201469CSCsandmiRNAsTakahashiR.,e2013年Campos等对33例（0～Ⅲ期）非转移结直肠癌患者和9名健康人，通过进行CK表达、17号染色体及HER2基因水平分析，同时分析CTC的表型和基因型，结果表明：原发灶无HER2蛋白表达，却有63.33%的CTC出现HER2蛋白过表达。全面CTC分析可以为肿瘤个体化治疗提供更多疾病信息。CamposM,LuqueR,JiménezJ,etal.Simultaneousphenotypicandgeneticcharacterizationofsinglecirculatingtumorcellsfromcoloncancerpatients[J].HistolHistopathol,2013,28(11):1439-1450.CTC与肿瘤个体化治疗70CamposM,LuqueR,JiménezJ,研究难点CTC/CTSC研究难点稀有性：仅占PBMC的1/106或者更少活性：难以保持细胞活性进行后续研究单细胞性：细胞稀少难以进行后续研究71研究难点CTC/CTSC研究难点稀有性：仅占PBMC的1/1研究数据-表达谱芯片散点图

正常组织肿瘤组织CTC细胞白细胞对照72研究数据-表达谱芯片散点图

正常组织肿瘤组织CTC细胞白细胞乳腺癌CTSC研究进展2013年Yu，侵袭性强的乳腺癌类型，以间质性表型CTCs为主；而病情恶化的患者的间质型CTCs计数明显增多。在CTCs动态监测中，初始对相应靶向药物疗效较好，CTCs数量明显降低并以上皮型为主；经7个月治疗后出现了耐药性及病情进展，间质CTCs升高。患者CTCs、EMT干细胞特性与药物疗效或耐药情况密切相关。YuM．BardiaA，WittnerBS．eta1．CirculatingbreasttumorcellsExhibitdynamicchangesInEpithelialandmesenehymaleompostion[J]．Science，2013，339(6119)：580-584．73乳腺癌CTSC研究进展2013年Yu，侵袭性强的乳腺癌类型液体活检在肿瘤精准治疗中的研究进展

74液体活检在肿瘤精准治疗中的研究进展内容摘要一.液体活检1）cfDNA&ctDNA&CTC概念和最新研究进展二.CTC/CTSC研究方法和进展

2）液体活检应用和意义三.我们的研究75内容摘要一.液体活检1）cfDNA&ctDNA&CT液态活检来源于肿瘤组织，存在于血液中：循环肿瘤细胞（CTC）循环肿瘤DNA（ctDNA）肿瘤外泌体exosome提示肿瘤发展进程及抗药性等信息，指导个体化精准治疗DiazLAJr,BardelliA.LiquidBiopsies:GenotypingCirculatingTumorDNA.JClinOncol.2014;32(6):579–58676液态活检来源于肿瘤组织，存在于血液中：DiazLAJr,cfDNAWhat:循环游离DNA，机体细胞释放入外周血循环后发生部分降解的内源性DNA。高度片段化，约170bp。Source:正常细胞、异常细胞（如肿瘤细胞），病毒DNA等State:半衰期短，动态表达量，核小体以单个、双联或三联的形式进入血液，并逐步分解。cfDNA（cell-freeDNA）77cfDNAWhat:循环游离DNA，机体细胞释放入外周血循ctDNAWhat:循环肿瘤DNA，是指肿瘤细胞DNA经脱落或细胞凋亡后释放进入循环系统。一种特征性的肿瘤生物标记物，可以被定性、定量和追踪。

Source:来源于肿瘤细胞的cfDNA，属于cfDNA的一种类型。不同患者的水平差异显著，受肿瘤负荷，分期等因素的影响ctDNA（circulatingtumorDNA）78ctDNAWhat:循环肿瘤DNA，是指肿瘤细胞DNA经脱cfDNA&ctDNAEllenHeitzer,PeterUlz,andJochenB.Geig.CirculatingTumorDNAasaLiquidBiopsyforCancer.ClinicalChemistry.2015,112–12379cfDNA&ctDNAEllenHeitzer,Pet1：CAPP-Seq（cancerpersonalizedprofilingbydeepsequencing）癌症个体化深度测序分析方法:利用定制化的NimbleGenSeqCapEZChoiceLibrary作为”筛选器“对样本靶向捕获后再深度测序，灵敏度高，特异性强且经济可行。

2：利用数字错误抑制（IDES）的方法和CAPP-seq（ctDNA测序方法），能够检测到频率低至0.004％的突变等位基因NewmanAM,LovejoyAF,KlassDM,etal.IntegrateddigitalerrorsuppressionforimproveddetectionofcirculatingtumorDNA.NatureBiotechnology(2016)doi:10.1038/nbt.3520ctDNA-高通量测序801：CAPP-Seq（cancerpersonalizedcfDNA－片段谱系分析Deepsequencingofcirculatingcell-freeDNAyieldsadense,genome-widemapofnucleosomeoccupancythatenablesidentificationofitscell-typesoforigin,potentiallyenablingthenoninvasivemonitoringofabroadersetofclinicalconditionsMatthewW.Snyder,MartinKircher,AndrewJ.Hilletal.Cell-freeDNAComprisesanInVivoNucleosomeFootprintthatInformsItsTissues-Of-Origin.Cell.2016Jan14;164(1-2):57-68.81cfDNA－片段谱系分析DeepsequencingofCTCWhat：

循环肿瘤细胞，是指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。Source:原发肿瘤和转移灶都会释放CTC。可检测到的CTC是肿瘤细胞在循环系统微环境下生存竞争的结果。CTC（circulatingtumorcells）82CTCWhat：循环肿瘤细胞，是指从实体瘤中脱离出来并进液体活检应用价值（监测肿瘤特异性突变发现肿瘤复发）EllenHeitzer,PeterUlz,andJochenB.Geig.CirculatingTumorDNAasaLiquidBiopsyforCancer.ClinicalChemistry.2015,112–12383液体活检应用价值（监测肿瘤特异性突变发现肿瘤复发）Ellen液体活检应用价值（分析耐药株的遗传变异）EllenHeitzer,PeterUlz,andJochenB.Geig.CirculatingTumorDNAasaLiquidBiopsyforCancer.ClinicalChemistry.2015,112–12384液体活检应用价值（分析耐药株的遗传变异）EllenHeit

液体活检优势及前景液态活检无侵入性、可频繁多次检测及快速反应能力均体现出发展潜力巨大应用价值。将削减无效肿瘤医疗开支、降低医疗成本。适应症广泛，如乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、食管癌等常见肿瘤均可用液态活检技术进行诊断与监测。2015年美国发布的肿瘤治疗计划的四大举措之一：“液态活检”血浆开发新方法来评估治疗反应以及抵抗可能的耐药性。根据中国国家癌症中心发布的数据，我国5年内诊断为癌症且仍存活的病例数约为749万。也是液态活检巨大的市场。

85液体活检优势及前景液态活检无侵入性、可频繁多次检测及快速反CTC研究概况1）CTC与转移的关系

2）CTC异质性与肿瘤治疗3）CTC应用和意义4）CTC研究方法86CTC研究概况1）CTC与转移的关系13CTCs(circulatingtumorcells,CTCs)

Ashworth早在1896年就提出了循环肿瘤细胞的概念。侵入循环系统的肿瘤细胞，大部分由于机体的免疫识别、机械杀伤及自身凋亡在短期内死亡，只有极少数存活下来，在适于自身存活和增殖的器官或组织形成转移灶。87CTCs(circulatingtumorcellCTC与肿瘤转移SimonAJoosse,TobiasMGorges,andKlausPantel.Biology,detection,andclinicalimplicationsofcirculatingtumorcells.EMBOMolMed.2015;7(1):1–11.88CTC与肿瘤转移SimonAJoosse,TobiasBrouwerA,DeLaereB,PeetersD,etal.consequencesofheterogeneityinthecirculatingtumorcellcompartment.Oncotarget.2016Mar9.doi:10.18632/oncotarget.8015.CTC异质性89BrouwerA,DeLaereB,PeetersCTC应用和意义CTCs肿瘤转移预测肿瘤治疗CTCs数量改变反映了肿瘤细胞对各种治疗方案的敏感性和有效性，为个体化治疗提供依据。监测早期转移乳腺癌、前列腺癌结肠癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌多种肿瘤监测CTCs基因表达／突变，找到药物敏感的靶点，指导个体化治疗90CTC应用和意义CTCs肿瘤转移预测肿瘤治疗CTCs数量改变CTC优化治疗方案2014年GoldKorn，接受多西他赛联合阿曲生坦治疗的转移性去势抵抗性前列腺癌患者，基线循环肿瘤细胞CTC数量可预测预后，3周时CTC升高提示总生存较差，有望作为重新指导和优化治疗的较好指标。GoldkornA，ElyB，QuinnDI，etal．CirculatingTumocellcountsarePrognosticofoverallsurvivalinSWOGS0421：aPhaseIIITrialofdocetaxelwithorwithoutatrasentanForMetastaticcastrationresistantprostatecancer.JClinOncol201432(11)：1136-1142．2012年Bian,乳癌患者在接受化疗（白蛋白结合型紫杉醇+卡培他滨+曲妥珠单抗）前后CTC变化。治疗前：CTC

3，HER-2+；1疗程：

CTC0。6疗程：病理学CR。证实CTC值在乳腺癌治疗早期发生显著变化，能够准确预示疗效，能够科学指导选择治疗方案。BianL，WangT，LiuY，etal．Evaluationoftreatmentresponseforbreastcancer：areweEnteringtheeraof”biologicalCompleteremission”?．ChinJCancerRes．2012，24：403-407．91CTC优化治疗方案2014年GoldKorn，接受多CTCs的研究方法RamdaneHarouaka,ZhigangKang,Si-YangZheng,LiangCao.Circulatingtumorcells:Advancesinisolationandanalysis,andchallengesforclinicalapplications.Pharmacology&Therapeutics.2014;141:209–221.92CTCs的研究方法RamdaneHarouaka,Zh研究方法（1）-CellSearchCellSearch系统是唯一经FDA批准进入临床应用的CTCs检测方案。原理：EpCAM抗体标识的微磁珠从全血中捕获细胞，用免疫荧光识EpCAM+CK+CD45−进行磁性分离。CTCEpCAMCKCD45DAPI93研究方法（1）-CellSearchCellSearch系CellSearch

数据解读:1.7.5ML外周血判断阈值：转移性乳腺癌CTCs≥5

细胞前列腺癌CTCs≥5细胞结肠癌：CTCs≥3细胞表明预后不良3.目前FDA只批准用于以上三种肿瘤94CellSearch数据解读:21CTCs的研究方法（2）-基因芯片95CTCs的研究方法（2）-基因芯片22CTCs的研究方法（3）-测序

XiaohuiNia,MingleiZhuo,ZheSua，etal.Reproduciblecopynumbervariationpatternsamongsinglecirculatingtumorcellsoflungcancerpatients.PNA,2013,52(110)21083-21088.96CTCs的研究方法（3）-测序

XiaohuiNia,MXiaohuiNia,MingleiZhuo,ZheSua，etal.Reproduciblecopynumbervariationpatternsamongsinglecirculatingtumorcellsoflungcancerpatients.PNA,2013,52(110)21083-21088.97XiaohuiNia,MingleiZhuo,ZheRamdaneHarouaka,ZhigangKang,Si-YangZheng,LiangCao.Circulatingtumorcells:Advancesinisolationandanalysis,andchallengesforclinicalapplications.Pharmacology&Therapeutics.2014;141:209–221.CTCs的分离方法（1）98RamdaneHarouaka,ZhigangKanCTCs的分离方法（2）-体外培养MinYu,AdityaBardia,NicolaAceto,etal.Exvivocultureofcirculatingbreasttumorcellsforindividualizedtestingofdrugsusceptibility.Science.2014;345(6193):216–220.PapanicolaoustainingforunculturedprimaryRepresentativeimagesofnonadherentCTCimmunofluorescentstaining：CK：red；Ki67：yellow；CD45：green；DAPI：blue.99CTCs的分离方法（2）-体外培养MinYu,AditCTSC研究概况1）CTSC定义

2）CSC,CTC,CTSC三者关系

3）CTSC研究进展4）CTSC研究难点和未来方向100CTSC研究概况1）CTSC定义27CTSC背景介绍循环肿瘤干细胞（circulatingtumorstemcells,CTSCs）：CTCs中具有干细胞特性，即自我更新及分化潜能的一小群细胞。作为标志物CTSC具有更重要的临床价值。EMT可使CTCs获得干细胞特性，而具有药物耐受性和高侵袭性。CTSC已在包括肝癌，乳腺癌，胃癌，结直肠癌等多种肿瘤中被证实。101CTSC背景介绍循环肿瘤干细胞（circulatingtCSC,CTC,CTSC（肿瘤转移等级结构图）YangMH,ImraliA,HeeschenC.Circulatingcancerstemcells:theimportancetoselect.ChinJCancerRes.2015Oct;27(5):437-49.102CSC,CTC,CTSC（肿瘤转移等级结构图）YangMarkersforCTSCYangMH,ImraliA,HeeschenC.Circulatingcancerstemcells:theimportancetoselect.ChinJCancerRes.2015Oct;27(5):437-49.103MarkersforCTSCYangMH,Imral乳腺癌CTSC研究进展学者们采用不同的表面标志物组合来定义CTSC：Epcam/CK/CD44／CD24；Epcam/CK/ALDH1／CD24Epcam/CK/Vimentin/Fibernectin；Epcam/CK/TWISTI/Akt2PDKaEpcam/Muc1/HER2Kasimir—BauerS，Hoffmann0，WallwienerD，eta1．ExpressionOfstemcellandepithelial—mesenchymaltransitionmarkersinPrimarybreastcancerPatientsWithcirculatingtumorcells[J]．BreastCancerRes，2012，14(1)：R15．BaccelliI，SchneeweissA，RiethdorfS，eta1．Identificationofapopulationofbloodcirculatingtumorcellsfrombreastcancerpatientsthatinitiatesmetastasisinaxenografiassay[J]．NatBiotechnol，2013，31(6)：539．544．104乳腺癌CTSC研究进展学者们采用不同的表面标志物组合来定义C乳腺癌CTSC研究进展YuM．BardiaA，WittnerBS．eta1．CirculatingbreasttumorcellsExhibitdynamicchangesInEpithelialandmesenehymaleompostion[J]．Science，2013，339(6119)：580-584．

EPCAMlowMEThighCD47highCD44high105乳腺癌CTSC研究进展YuM．BardiaA，Wittn

2013年上海复旦大学附属肝癌研究所樊嘉及周俭研究组通过研究123例肝癌患者CTCs相关肿瘤干细胞免表标记物，包括CD133、ABCG2、CD90、β-catenin、E-cadherin以及Vimentin。2013年Liu等鉴于ICAM-1可能是肝癌干细胞标志物，也采用流式细胞术检测了肝癌血样，发现部分病例可检出CD45-ICAM-1+细胞，这样的细胞具有较强的体外成球和体内致瘤能力。Y.F.,etal.,Circulatingstemcell-likeepithelialcelladhesionmolecule-positivetumorcellsindicatepoorprognosisofhepatocellularcarcinomaaftercurativeresection.Hepatology,2013.57(4):p.1458-68。LiuS,LiN,YuX,etal.Expressionofintercellularadhesionmolecule1byhepatocellularcarcinomastemcellsandcirculatingtumorcells[J].Gastroenterology,2013,144(5):1031-1041肝癌CTSCs研究进展1062013年上海复旦大学附属肝癌研究所樊嘉及周俭研究我们的研究

1)CSCandmiRNA2)CTCandCTSC107我们的研究

1)CSCandmiRNA34项目研究基础—前期基金支持1.2014年福建省卫教联合项目：结直肠癌循环肿瘤细胞和肿瘤干细胞的分子机制研究（WKJ-FJ-14）2.2012年福建省科技厅重点项目:《循环肿瘤细胞与肿瘤干细胞在恶性肿瘤个体化治疗中的应用研究》（2012Y0017）；3.2012年福建省卫生厅青年课题:《结直肠癌循环肿瘤细胞及其上皮间质变标志物的定量检测》（2012-2-13）；4.2012年福建省自然科学基金项目:《miR-148家族-靶蛋白网络在肝癌干细胞中调控机制研究》（2012J05138）；

5.2011年福建省医学创新课题:《乳腺癌循环肿瘤细胞（CTC）及其单细胞多基因检测的临床意义》（2011-CX-16）；6.2011年福建省自然科学基金项目:《循环肿瘤细胞及其耐药基因表达水平在晚期乳腺癌化疗敏感性中的应用研究》（2011J01141）108项目研究基础—前期基金支持1.2014年福建省卫教联合项目

－基金支持8.2009年福建省自