实验二 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定免疫球蛋白课件

实验二SDS分离鉴定

免疫球蛋白一、目的1、了解和掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理；2、掌握用此法分离鉴定纯化蛋白质的操作方法。二、原理1电泳技术基本原理电泳是指带电粒子在电场的作用下，发生定向泳动的现象。电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。SDS是一种阴离子表面活性剂.它能以一定比例和蛋白质结合，形成一种SDS-蛋白质复合物。这时，蛋白质即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低甚到消除。与些同时，蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋于一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的电泳迁移率的差异，仅仅取决于蛋白质的分子量。另外，SDS-蛋白质复合物在强还原剂（巯基乙醇）存在下，蛋白质分子内二硫键被打开，这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系。SDS四肽链结构所有Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构。两条重链（H）和两条轻链（L）。三、试剂与器材1、30%的丙烯酰胺6、浓缩胶缓冲液（PH6.8）6.0gTris,48mL1mol/LHCl,加水至100ml.8、5xSDS凝胶上样缓冲液四、实验步骤：1、聚丙烯酰胺凝胶的制备根据目的蛋白质的相对分子质量大小确定凝胶使用浓度，浓缩胶一般为3%~5%蛋白质相对分子质量/×103凝胶浓度/%>5002~5100~5005~1040~10010~1510~4015~20<1020~30分离胶浓度与蛋白质分子质量的关系1、配制10ML12%分离胶2、装配好电泳用双层垂直玻璃板，保证底部不漏水。将混合均匀的分离胶凝胶溶液灌入双层玻璃板之间，控制溶液高度距离矮玻璃板上缘2~3cm，立即在凝胶顶部加入2~3cm水层，室温静止30~60min，待凝胶凝固后吸去顶部水层，灌浓缩胶至双层玻璃板灌满为止，立即插入梳子，静止30~60min，待凝胶凝固。电泳槽3、浓缩胶的制备聚合完成之后，倒掉覆盖在凝胶上层的液体，尽可能用滤纸吸干凝胶顶层的残存液体。按下列配方制备浓缩胶，混匀后将浓缩胶灌入分离胶的上面，插入梳子，小心避免气泡的出现。3、蛋白质样品的制备样品中加入上样缓冲液，在沸水浴中煮沸3~5min，

5000~10000g离心3~5min，上清液备用。

4、点样将制备好的凝胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液，拨除梳子。用微量移液器点样。5、电泳样品在浓缩胶时，低电压（60~80V，起始电流不超过10~15mA），进入分离胶后，提高电压（100~200V，电流不超过30mA），当指示剂溴酚蓝前沿距离胶1~2mm，终止电泳。最好在低温下进行。

图1标准蛋白质与待测样品电泳图谱

实验结果分析

940006200043000310002010014400胶槽123注：胶槽1标准蛋白；胶槽2、3样品蛋白3.过硫酸铵容易吸潮，由于它溶解于水后很快降解失去催化能力，因此潮解后的过硫酸铵会渐渐失去活性。保存固体过硫酸铵应密闭干燥。过硫酸铵溶液宜制胶当天配制。4．蛋白加样量要合适。加样量太少，条带不清晰；加样量太多则泳道超载，条带过宽而重叠，甚至覆盖至相邻泳道。

（1）“微笑”现象

指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好。电泳过程中的不正常现象（2）“皱眉”现象

由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全。

（3）“拖尾”现象

样品溶解不佳引起。（4）“纹理”现象

由于样品中的不溶颗粒引起的。（5）偏斜现象

电极放置不平行引起或加样位置偏斜而引起（6）带太宽

加样量太多或加样孔泄漏引起实验三目的蛋白WesternBlotting检测一、目的1、了解WesternBlotting的原理及其意义，掌握WesternBlotting的操作方法；2、应用WesternBlotting技术鉴定经SDS分离后的目标蛋白。二、原理WesternBlotting简称蛋白质印迹法。蛋白质样品经SDS电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键的形式与蛋白质结合，从而固定蛋白质；以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体起免疫反应，再和酶标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中温育，即可检测出样品中的特异蛋白质组分。三、试剂与器材1、膜转移缓冲液2、TBST缓冲液3、封闭液含有5%脱脂奶粉的TBST液。4、DAB显色实验器材半干转移槽PVDF(聚偏氟乙烯)膜两张厚的滤纸刀片塑料盒四、操作步骤1、当表达产物的SDS电泳结束时，带上手套，剥胶，切6-8张滤纸和一张PVDF膜，它们的大小与凝胶完全吻合。2、在一塑料盒里加入少量转膜液，将滤纸与胶浸泡于其中5-10min；PVDF膜浸入甲醇中2min3、制备“夹心饼”：（膜可比滤纸稍大，防止短路）提起滤纸平放在盒盖上，用洁净15ml离心管压走多余的buffer，以不滴水为宜，平铺在半干转印槽上，再将湿润的膜（实验室统一剪角标记）放在该层滤纸上；接下来将已切角的胶平铺在膜上，在最上层再铺上滤纸并压走多余液体。4、转膜：（半干转）（PVDF膜0.22UM）半干转移中，一般恒流（1-1.5mA/cm2，60-90min），恒压的话15v60分钟就可以了。5、关闭电源，用镊子夹取PVDF膜，转移到塑料盒中，加入5%脱脂奶粉4℃封闭过夜。6、弃去封闭液，用TBST洗膜3次，每次5min7、加入一抗，室温平缓摇动2h；8、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min；9、加入二抗，室温下孵育1h；10、废弃液体用TBST洗膜3