分子生物学第三章-dna的复制-基于dna复制原理的pcr技术课件

PCR（聚合酶链式反应）

PCR（聚合酶链式反应）1Polymerasechainreaction

---AnimportanttechniquebasedonDNAPolymerase

Thepolymerasechainreaction(PCR)istousedtoamplifyasequenceofDNAinvitro,usingapairofprimerseachcomplementarytooneendofthetheDNAtargetsequence.理论技术Polymerasechainreaction

---A2Denaturation(变性):ThetargetDNA(template)isseparatedintotwostandsbyheatingto95℃Primerannealing(退火):Thetemperatureisreducedtoaround55℃toallowtheprimerstoanneal.Polymerization(elongation,extension)(延伸):Thetemperatureisincreasedto72℃foroptimalpolymerizationstepwhichusesdNTPsandrequiresMg++.TheprincipleofPCR:ThreedifferentstepsproceedineachPCRcycle.Denaturation(变性):Thetarget35’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’DenaturationAnnealingExtension(DNApolymerase)Cycle1Cycle2Cycle35’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’4Initial

DNA

8421NumberofDNAmolecules(2n):指数扩增Initial

DNA

8421NumberofDNA5Manycycles(25-35incommon)areperformedtocompleteonePCRreaction,whichresultedinanexponentialamplification

ofthetargetDNAinwhichbothforwardandreverseprimerspair.Manycycles(25-35incommon)6DNAtemplate(模板)AnysourceofDNAthatprovidesoneormoretargetmoleculescaninprinciplebeusedasatemplateforPCR.WhateverthesourceoftemplateDNA,PCRcanonlybeappliedifsomesequenceinformationisknownsothatprimerscanbedesigned.DNAtemplate(模板)Anysourceof7分子生物学第三章-dna的复制--基于dna复制原理的pcr技术课件8Figure8-3SubstratesrequiredforDNAsynthesisFigure8-3Substratesrequired9PCRPrimersAnnealonoppositestrandsofthetargetsequence:forwardandreverseprimers（正向引物和反向引物）HavesimilarG+Ccontents(Tm)sothattheyannealtotheircomplementarysequencesatsimilartemperatures

(annealtemperature:Tm-5°C)PCRPrimersAnnealonopposite105’-ATTCCGATCGCTAATCGATGGC-------TCCTGTGCATTTCGCCACTAGAG-3’3’-TAAGGCTAGCGATTAGCTACCG-------AGGACACGTAAAGCGGTGATCTC-5’5’-ATTCCGATCGCTAATCGATG-3’3’-CACGTAAAGCGGTGATCTC-5’forwardprimerreverseprimer5’-CTCTAGTGGCGAAATGCAC-3’5’-ATTCCGATCGCTAATCGATGGC-----115’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’DenaturationAnnealingExtension(DNApolymerase)Cycle1Cycle2Cycle35’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’12PCREnzymesPCREnzymes13Denaturation(变性):ThetargetDNA(template)isseparatedintotwostandsbyheatingto95℃Primerannealing(退火):Thetemperatureisreducedtoaround55℃toallowtheprimerstoanneal.Polymerization(elongation,extension)(延伸):Thetemperatureisincreasedto72℃foroptimalpolymerizationstepwhichusesdNTPsandrequiresMg2+.Denaturation(变性):Thetarget14Taqpolymerase：isolatedfromthethermophilicbacteriumThermusaquaticus(嗜热菌）,耐热DNA聚合酶，耐高温Ithasno3’to5’proofreadingexonucleaseactivityHigh-accuracyDNApolymeraseisavailablecommercially(高保真酶）Taqpolymerase：isolatedfrom15PCR仪PCR仪16DiscoveryofPCRtechnique希望大家不仅仅知道“是什么”，而且也了解“为什么”和“结论是怎么得出来的”DiscoveryofPCRtechnique希望大家17如果你的研究能力一般，那么，改革本研究领域中大家习以为常的最基本的技术，你就有可能获诺贝尔奖-----KaryMullis(卡里.穆利斯)如果你的研究能力一般，那么，改革本研究领域中大家习以为常的最18ThereplicationofDNAThereplicationofDNA19哥伦布竖立鸡蛋的故事DNA分子的拷贝术，复印机哥伦布竖立鸡蛋的故事20PCR技术的发现充满传奇色彩KaryMullis(卡里.穆利斯)1972年获得加州大学伯克利分校生物化学博士学位1979年进入塞特斯公司：与DNA合成相关的工作1983年4月：PCR的最初想法高速公路的灵感230=10亿想法付诸行动1983年12月：第一个PCR反应成功1984年塞特斯公司申请PCR技术专利PCR技术的发现充满传奇色彩21PCR技术引来的官司谁发明了PCR？DNA聚合酶的发现者？纸上谈兵KaryMullis(卡里.穆利斯)胜诉PCR技术引来的官司22KaryMulliswonthe1993NobelPrizeinChemistryforhisinventionofthepolymerasechainreaction

心灵的裸舞-自传KaryMulliswonthe1993Nobel23分子生物学第三章-dna的复制--基于dna复制原理的pcr技术课件24MypresentresearchworkDegeneratePCRcanbeusedtoclonegenecodingforenzyme简并引物PCR----结合自己的研究工作PCRapplication-example1MypresentresearchworkPCRap25Codon:degenerateAnticodon:wobble密码子的简并性Codon:degenerate密码子的简并性26Manyaminoacidsarespecifiedbymorethanonecodon-degeneracy(简并性).Codonsspecifyingthesameaminoacidarecalledsynonyms(同义密码子).GManyaminoacidsarespecified27Degenerateprimers(简并引物):

anoligopoolderivedfromaproteinsequence.His-Phe-Pro-Phe-Met-Lyscangenerateaprimer5’-CAYTTYCCNTTYATGAAR-3’Y=Pyrimidine(CorT)N=anybaseR=purine(AorG)Degenerateprimers(简并引物):28DegeneratePCR(简并PCR)Myresearchwork:molecularbiologyresearchoflaccase(漆酶)producedinfungi--白腐真菌漆酶的分子生物学研究DegeneratePCR(简并PCR)Myresea29白腐真菌白腐真菌（whiterotfungi)白腐真菌是一类使木材呈白色腐朽的丝状真菌的总称（主要是担子菌）已知的唯一能在纯系培养中有效地将木质素彻底降解为CO2和H2O的一类微生物白腐真菌白腐真菌（whiterotfungi)白腐真菌是30木质素：以芳香族为基本结构的高度复杂聚合物

Science,2007,315(5813):804-807

对与木质素结构相似的异生物质污染物也具有强大的降解能力木质素：以芳香族为基本结构的高度复杂聚合物Science,31木质素过氧化物酶（LiP）

锰过氧化物酶（MnP）

漆酶（Lac）白腐真菌木质素降解酶系非立体选择性和非特异性

木质素过氧化物酶（LiP）白腐真菌木质素降解酶系非立体选择性32漆酶（Laccase）含铜的多酚氧化酶,白腐真菌降解木质素的重要酶具有广泛的底物作用范围和独特的生物降解功能环境生物技术BiotechnologyAdvances24(2006)500–513漆酶（Laccase）含铜的多酚氧化酶,白腐真菌降解木质素的33UsedegeneratePCR(简并PCR)toclonelaccasegeneUsedegeneratePCR(简并PCR)to34Copper-bindingregionishighlyconservedCopper-bindingregionI:His-Trp-His-Gly-Phe-Phe-GlnCopper-bindingregionIV:His-Cys-His-Ile-Asp-Phe-HisCopper-bindingregionishighl35简并引物PCR获得1.6kb漆酶基因特异性序列基因组步移技术获得2118bp漆酶全长结构基因RACE和RT-PCR克隆得到了1566bp漆酶基因全长cDNA序列122kb1kb----我们自己的研究工作简并引物PCR获得1.6kb漆酶基因特异性序列基因组步移技术36Question:BydegeneratePCR,onlythepartialsequenceofonegenecanbeobtained,Howcanwegettheentiregene?Chromosomewalking(染色体步移技术)

Question:BydegeneratePCR,on37LongDistance

inversePCRTechniqueforEfficientCloningofFlankingSequencesAdjacenttoKnownDNAFragmentsinversePCR(反向PCR)LongDistanceinversePCRTech38Reversetranscriptase(RT)-PCR逆转录PCR检测基因的转录量PCRapplication-example2Reversetranscriptase(RT)-PCR39Reversetranscriptase(RT)-PCR逆转录PCRAAA(A)n5‘-CapmRNA(dT)12~18

primeranneal5‘-CapAAA(A)n3‘5‘ReversetranscriptiondNTP,RT5‘-CapAAA(A)n5‘cDNA:mRNAhybridRegularPCRReversetranscriptase(RT)-PCR40RT-PCRapplicationClonecDNAofspecificgeneDetectingtheexpressionlevelofgeneRT-PCRapplicationClonecDNAo41Studythistechniquefromexperiment(实战中学习)DetectingtheexpressionlevelofgenebyRT-PCRmRNAcDNART-PCRproductStudythistechniquefromexpe42Rightpanel:PCRamplificationoftheclonedlac1cDNAusingthecyclenumberobtainedfromtheleftpanelValidationofsemiquantitativeRT-PCRassaysforexpressionleveloflac1(laccasegene)Leftpanel:KineticsofPCRamplificationwiththeelectrophoreticimageshownatthetop.Thecyclenumber(28)thatgenerateshalfmaximalreactionwasusedtoanalysetheexpressionofthegene.Rightpanel:PCRamplification43Eur.J.Biochem.(2004)271,318–328RT-PCRanalysisoftranscriptionoflac1inducedbydifferentconcentrationsofcopperlac1:laccasegenegpd:house-keepinggeneTheexpressionlevelswerenormalizedbyusingtherelativemRNAratio(lac1/gpd)-semiquantitativeRT-PCREur.J.Biochem.(2004)271,344各种芳香化合物对laccase基因的转录调控效果是不同的RT-PCRanalysisoftranscriptionpatternsoflac1inducedbydifferentaromaticcompoundsveratricacidferulicacid(阿魏酸)2,5-xylidinevanillin芳香化合物Eur.J.Biochem.(2004)271,318–328各种芳香化合物对laccase基因的转录调控效果是不同的R45RT-PCR(反转录PCR）:EffectsofvariouscopperconcentrationsonlccmRNAMeasurethelaccaseactivity:EffectsofvariouscopperconcentrationsonlaccaseactivityRT-PCR(反转录PCR）:Measurethelac46PCR（聚合酶链式反应）

PCR（聚合酶链式反应）47Polymerasechainreaction

---AnimportanttechniquebasedonDNAPolymerase

Thepolymerasechainreaction(PCR)istousedtoamplifyasequenceofDNAinvitro,usingapairofprimerseachcomplementarytooneendofthetheDNAtargetsequence.理论技术Polymerasechainreaction

---A48Denaturation(变性):ThetargetDNA(template)isseparatedintotwostandsbyheatingto95℃Primerannealing(退火):Thetemperatureisreducedtoaround55℃toallowtheprimerstoanneal.Polymerization(elongation,extension)(延伸):Thetemperatureisincreasedto72℃foroptimalpolymerizationstepwhichusesdNTPsandrequiresMg++.TheprincipleofPCR:ThreedifferentstepsproceedineachPCRcycle.Denaturation(变性):Thetarget495’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’DenaturationAnnealingExtension(DNApolymerase)Cycle1Cycle2Cycle35’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’50Initial

DNA

8421NumberofDNAmolecules(2n):指数扩增Initial

DNA

8421NumberofDNA51Manycycles(25-35incommon)areperformedtocompleteonePCRreaction,whichresultedinanexponentialamplification

ofthetargetDNAinwhichbothforwardandreverseprimerspair.Manycycles(25-35incommon)52DNAtemplate(模板)AnysourceofDNAthatprovidesoneormoretargetmoleculescaninprinciplebeusedasatemplateforPCR.WhateverthesourceoftemplateDNA,PCRcanonlybeappliedifsomesequenceinformationisknownsothatprimerscanbedesigned.DNAtemplate(模板)Anysourceof53分子生物学第三章-dna的复制--基于dna复制原理的pcr技术课件54Figure8-3SubstratesrequiredforDNAsynthesisFigure8-3Substratesrequired55PCRPrimersAnnealonoppositestrandsofthetargetsequence:forwardandreverseprimers（正向引物和反向引物）HavesimilarG+Ccontents(Tm)sothattheyannealtotheircomplementarysequencesatsimilartemperatures

(annealtemperature:Tm-5°C)PCRPrimersAnnealonopposite565’-ATTCCGATCGCTAATCGATGGC-------TCCTGTGCATTTCGCCACTAGAG-3’3’-TAAGGCTAGCGATTAGCTACCG-------AGGACACGTAAAGCGGTGATCTC-5’5’-ATTCCGATCGCTAATCGATG-3’3’-CACGTAAAGCGGTGATCTC-5’forwardprimerreverseprimer5’-CTCTAGTGGCGAAATGCAC-3’5’-ATTCCGATCGCTAATCGATGGC-----575’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’3’DenaturationAnnealingExtension(DNApolymerase)Cycle1Cycle2Cycle35’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’3’5’58PCREnzymesPCREnzymes59Denaturation(变性):ThetargetDNA(template)isseparatedintotwostandsbyheatingto95℃Primerannealing(退火):Thetemperatureisreducedtoaround55℃toallowtheprimerstoanneal.Polymerization(elongation,extension)(延伸):Thetemperatureisincreasedto72℃foroptimalpolymerizationstepwhichusesdNTPsandrequiresMg2+.Denaturation(变性):Thetarget60Taqpolymerase：isolatedfromthethermophilicbacteriumThermusaquaticus(嗜热菌）,耐热DNA聚合酶，耐高温Ithasno3’to5’proofreadingexonucleaseactivityHigh-accuracyDNApolymeraseisavailablecommercially(高保真酶）Taqpolymerase：isolatedfrom61PCR仪PCR仪62DiscoveryofPCRtechnique希望大家不仅仅知道“是什么”，而且也了解“为什么”和“结论是怎么得出来的”DiscoveryofPCRtechnique希望大家63如果你的研究能力一般，那么，改革本研究领域中大家习以为常的最基本的技术，你就有可能获诺贝尔奖-----KaryMullis(卡里.穆利斯)如果你的研究能力一般，那么，改革本研究领域中大家习以为常的最64ThereplicationofDNAThereplicationofDNA65哥伦布竖立鸡蛋的故事DNA分子的拷贝术，复印机哥伦布竖立鸡蛋的故事66PCR技术的发现充满传奇色彩KaryMullis(卡里.穆利斯)1972年获得加州大学伯克利分校生物化学博士学位1979年进入塞特斯公司：与DNA合成相关的工作1983年4月：PCR的最初想法高速公路的灵感230=10亿想法付诸行动1983年12月：第一个PCR反应成功1984年塞特斯公司申请PCR技术专利PCR技术的发现充满传奇色彩67PCR技术引来的官司谁发明了PCR？DNA聚合酶的发现者？纸上谈兵KaryMullis(卡里.穆利斯)胜诉PCR技术引来的官司68KaryMulliswonthe1993NobelPrizeinChemistryforhisinventionofthepolymerasechainreaction

心灵的裸舞-自传KaryMulliswonthe1993Nobel69分子生物学第三章-dna的复制--基于dna复制原理的pcr技术课件70MypresentresearchworkDegeneratePCRcanbeusedtoclonegenecodingforenzyme简并引物PCR----结合自己的研究工作PCRapplication-example1MypresentresearchworkPCRap71Codon:degenerateAnticodon:wobble密码子的简并性Codon:degenerate密码子的简并性72Manyaminoacidsarespecifiedbymorethanonecodon-degeneracy(简并性).Codonsspecifyingthesameaminoacidarecalledsynonyms(同义密码子).GManyaminoacidsarespecified73Degenerateprimers(简并引物):

anoligopoolderivedfromaproteinsequence.His-Phe-Pro-Phe-Met-Lyscangenerateaprimer5’-CAYTTYCCNTTYATGAAR-3’Y=Pyrimidine(CorT)N=anybaseR=purine(AorG)Degenerateprimers(简并引物):74DegeneratePCR(简并PCR)Myresearchwork:molecularbiologyresearchoflaccase(漆酶)producedinfungi--白腐真菌漆酶的分子生物学研究DegeneratePCR(简并PCR)Myresea75白腐真菌白腐真菌（whiterotfungi)白腐真菌是一类使木材呈白色腐朽的丝状真菌的总称（主要是担子菌）已知的唯一能在纯系培养中有效地将木质素彻底降解为CO2和H2O的一类微生物白腐真菌白腐真菌（whiterotfungi)白腐真菌是76木质素：以芳香族为基本结构的高度复杂聚合物

Science,2007,315(5813):804-807

对与木质素结构相似的异生物质污染物也具有强大的降解能力木质素：以芳香族为基本结构的高度复杂聚合物Science,77木质素过氧化物酶（LiP）

锰过氧化物酶（MnP）

漆酶（Lac）白腐真菌木质素降解酶系非立体选择性和非特异性

木质素过氧化物酶（LiP）白腐真菌木质素降解酶系非立体选择性78漆酶（Laccase）含铜的多酚氧化酶,白腐真菌降解木质素的重要酶具有广泛的底物作用范围和独特的生物降解功能环境生物技术BiotechnologyAdvances24(2006)500–513漆酶（Laccase）含铜的多酚氧化酶,白腐真菌降解木质素的79UsedegeneratePCR(简并PCR)toclonelaccasegeneUsedegeneratePCR(简并PCR)to80Copper-bindingregionishighlyconservedCopper-bindingregionI:His-Trp-His-Gly-Phe-Phe-GlnCopper-bindingregionIV:His-Cys-His-Ile-Asp-Phe-HisCopper-bindingregionishighl81简并引物PCR获得1.6kb漆酶基因特异性序列基因组步移技术获得2118bp漆酶全长结构基因RACE和RT-PCR克隆得到了1566bp漆酶基因全长cDNA序列122kb1kb----我们自己的研究工作简并引物PCR获得1.6kb漆酶基因特异性序列基因组步移技术82Question:BydegeneratePCR,onlythepartialsequenceofonegenecanbeobtained,Howcanwegettheentiregene?Chromosomewalking(染色体步移技术)

Question:BydegeneratePCR,on83LongDistance

inversePCRTechniqueforEfficientCloningofFlankingSequencesAdjacenttoKnownDNAFragmentsinversePCR(反向PCR)LongDistanceinversePCRTech84Reversetranscriptase(RT)-PCR逆转录PCR检测基因的转录量PCRapplication-example2Reversetranscriptase(RT)-PCR85Reversetranscriptase(RT)-PCR逆转录PCRAAA(A)n5‘-CapmRNA(dT)12~18

primeranneal5‘