同型半胱氨酸不同检测方法结果比较分析

同型半胱氨酸不同检测方法结果比较分析贾永娟;解娜;翟瑞雪;倪君君【摘要】目的比较同型半胱氨酸临床不同测定方法(液质联用法及免疫类方法)的差异.方法本文选取2014年至2016年我室参加国内和国际权威机构:卫生部临检中心和美国病理学家协会室间质评活动的反馈结果数据，通过分析同型半胱氨酸反馈结果数据以及我室采用液质联用法和免疫类方法同时测定同型半胱氨酸的数据，比较了液质联用法及免疫类方法的差异.结果我室的检测方法为液质联用法,自2014年参与美国美国病理学家协会室间质评以来结果均在可接受范围内，与靶值偏倚v25%,在此机构的室间质评活动中所属组为色谱法组别；而自2014年起参与国内卫生部临检中心室间质评以来除低值(v20.0pmol/L)在可接受范围内,其他浓度值的测定结果均高于临检中心室间质评可接受范围,且偏倚程度与浓度的增加呈现正相关.而我室在临检中心室间质评中所属组为缺省组组别或所有组组别,参与临检中心室间质评的其他实验室大部分以免疫类方法检测.除此之外，我室在采用液质联用法和免疫类方法同时测定同型半胱氨酸时结果存在差异.结论液质联用法与免疫类方法测定同型半胱氨酸结果存在偏差，且偏差与浓度呈现正相关.血液样品存在着内源性成分复杂,基质干扰严重等问题，免疫类方法易受这些问题的影响，而液质联用法具有专属性强、准确度高的特点,采用标准曲线定量可以得到可靠的结果.【期刊名称】《标记免疫分析与临床》【年(卷)，期】2018(025)009【总页数】7页(P1391-1397)【关键词】同型半胱氨酸;液质联用;免疫类方法;室间质评;方法比较【作者】贾永娟;解娜;翟瑞雪;倪君君【作者单位】北京和合医学诊断技术股份有限公司，北京101111；北京和合医学诊断技术股份有限公司，北京101111;北京和合医学诊断技术股份有限公司，北京101111;北京和合医学诊断技术股份有限公司，北京101111【正文语种】中文同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是一种含硫氨基酸。可在N5-甲基四氢叶酸转甲基酶及其辅酶维生素B12的作用下生成蛋氨酸，也可在胱硫醚-B-合成酶的催化下生成半胱氨酸。当酶的代谢出现障碍时，血浆中Hcy的升高，即高Hcy血症［1-2］。高Hcy血症是动脉粥样硬化和心脑血管疾病的一种独立危险因素，其水平高低与疾病的危险程度成正比，因此越来越受到广泛的重视和关注［3-4］。精准的检测方法是保障Hcy检测结果质量的基石，近年来临床常用的Hcy检测方法有免疫类方法（酶联免疫法［5］、荧光偏振免疫检测法［1,6］、循环酶法［6-7］等）和色谱法（高效液相色谱法［8］、气相色谱-质谱联用法［9］、液相色谱-质谱联用法［10-13］）等。这些检测方法各有优缺点，其中酶联免疫法操作简单，快捷高效。但其专用试剂大多按人份计算，价格较贵，大部分都为手工操作，比较耗时。荧光偏振免疫检测法灵敏度高，检测速度快，但价格昂贵，不易普及。循环酶法是参加室间质评实验室中选用数量最多的方法，约占总数的80%［14-15］。但循环酶法存在反应过程复杂，分析时间较长，所需试剂昂贵等缺点。除此之外循环酶法试剂盒使用说明中提到高浓度的内源性物质对测定的结果不容忽视，如甲基转氨循环酶法可能受到机体内源性氨、S-腺苷蛋氨酸、S-腺苷Hcy的干扰，而胱硫醚循环法可能受到内源性胱硫醚和丙酮酸盐的干扰［2］。相比之下，液相色谱-质谱联用仪虽然价格昂贵且需要专业人员操作，但具有更高的专属性、灵敏度、准确度和稳定性，线性范围更宽，且可以实现更快的分析速度。有文献报道［16］，免疫类的方法平均回收率为80.2%~89.9%,比文献中色谱法的平均回收率要低，我室的液质联用法检测血清的Hcy，平均回收率为95.0%~105.0%。近年来，随着人们对医疗服务的需求不断提升，〃精准医疗”成为临床医生和研究人员特别关注的议题，同时也越来越受到国家的重视，所谓〃精准医疗”，即精准诊断和精准治疗，而实现精准诊断是保障精准医疗的前提。液相色谱-质谱联用技术中液相色谱部分负责分离生物样品中的待测物和干扰物，质谱部分通过对待测物的质荷比（质量-电荷比）进行特异性检测来实现定量分析，该技术的自身特点无疑与临床检验发展趋势更为契合。本文针对本实验室自2014年来参加美国病理学家协会、卫生部临检中心的Hcy室间质评的数据结果分析液质联用法检测和免疫类方法检测的区别。材料与方法1—般资料选取2014年至2016年我室参加国内和国际权威机构卫生部临检中心（NCCL）和美国病理学家协会（CAP）室间质评活动的反馈结果数据。其中NCCL针对主要临床检验项目开展全国室间质量评价计划。目前已开展评价计划50种，涵盖临床生物化学、免疫学、血液体液学、微生物学、分子生物学、输血检验等专业，包括约200项检验项目，参加实验室约4000家（包括医疗机构、采供血机构、疾病控制机构、国际旅游卫生保健中心和体外诊断企业等）。CAP是一个设立在美国的非赢利临床实验室认证机构，被公认为是医学实验室质量保证的领导者之一。CAP的一个重要工作内容就是向世界各地的参与实验室开展能力验证活动（ProficiencyTesting,PT也称为室间质评）。通过室间质评和实验室实地评审进行CAP认证。CAP的室间质评结果是作为医学实验室执业许可或认证的依据。我室Hcy项目从2014年至2016年参与NCCL和CAP的室间质评活动，CAP室间质评结果良好，连续三年通过室间质评。而NCCL室间质评结果并不理想。除此之外，我室采用液质联用法，化学发光免疫分析法，和循环酶法对低中高不同浓度血清样本40例进行了测定，其中低浓度样本18例，中浓度样本11例，高浓度样本11例，进一步比较了不同检测方法结果关系及差异情况。2检测方法与仪器我室的检测方法为血浆样本经衍生化、除蛋白等前处理过程后，使用安捷伦1260高效液相色谱串联6410三重四级杆质谱仪采用内标法对Hcy进行定量测定。同时还使用了罗氏Cobase-601化学发光全自动免疫分析系统及购自上海晶都生物技术有限公司的同型半胱氨酸循环酶法检测试剂盒对Hcy进行定量测定。3统计学方法本文随机选取了2015年CAP室间质评上半年CR-A反馈的数据，CAP室间质评提供了低中高(5.25,24.18,50.58)三个浓度水平的样本，本文按照不同浓度水平结果进行分类，采用t检验，以双侧95%作为置信区间，在不同浓度水平下分别判断色谱法(chromatographic,Alldetections)与化学发光免疫分析法(chemiluminescenceimmunoassay)、酶分析法(enzymatic/enzymicassays)、免疫分析法(immunoassay)在测定结果上的差异性，且判断这种差异与不同浓度水平的关系。结果1不同浓度水平组Hcy测定结果对于不同浓度水平组Hcy测定结果分别进行比较，采用t检验进行统计，结果见表1,化学发光免疫分析法与色谱法相比，两种方法在低浓度水平上检测同一物质时，P>0.05，尚不能认为两种方法有显著性差异；而在中、高浓度水平上检测该物质时，P均<0.01，可认为两种方法差异有统计学意义，且化学发光免疫分析法的检测结果相对色谱法偏低。酶分析法与色谱法相比较，在低浓度和中浓度水平上，P>0.05，尚不能认为两种方法有显著性差异；而在高浓度水平上，P<0.05，可认为两种方法有显著性差异，且酶分析法与色谱法相比较，在高浓度水平下的测量结果偏低。免疫分析法与色谱法相比，两种方法在低浓度水平上检测该物质时，P>0.05，尚不能认为两种方法有显著性差异；而在中、高浓度水平上检测该物质时，P均<0.01,可认为两种方法有显著性差异，且免疫分析法的检测结果相对色谱法偏低。通过统计学分析比较可知色谱法与化学发光免疫分析法，酶分析法，免疫分析法在测定中高浓度水平样本时，存在显著性差异，且色谱法测定结果均比其他方法测定结果偏高。表1不同浓度水平组Hcy测定结果组别n化学发光免疫分析法色谱法t值P值低浓度4293.18±1.785.25±2.16-1.48>0.05中浓度42821.21±4.0024.18±4.33-2.70<0.01高浓度42343.78±7.8450.58±8.66-4.60<0.01组别n酶分析法色谱法t值P值低浓度3094.58±1.255.25±2.16-0.70>0.05中浓度31123.27±3.3524.18±4.33-0.85>0.05高浓度30247.08±8.2750.58±8.66-2.27<0.05组别n免疫分析法色谱法t值P值低浓度1194.13±0.76.25±2.16-0.94>0.05中浓度11920.12±2.6724.18±4.33-3.78<0.01高浓度11844.09±4.1750.58±8.66-5.24<0.012同型半胱氨酸检测结果比较我室用低中高不同浓度血清样本40例，用液质联用法，化学发光免疫分析法，酶循环法三种方法测定，分别比较了在不同浓度水平时液质联用法与化学发光免疫分析法的偏倚，液质联用法与酶循环法的偏倚，结果如表2所示：在低中高不同浓度水平时，液质联用法与化学发光免疫分析法的平均偏倚分别为9.00%,16.62%,30.13%，液质联用法与酶循环法的平均偏倚分别为7.96%,15•24%,28.90%。由此可见液质联用法，化学发光免疫分析法，酶循环法在测定Hcy时存在差异，这种差异与浓度成正相关，且液质联用法比化学发光免疫分析法和酶循环法测定结果偏高。表2同型半胱氨酸检测结果比较浓度水平样本号液质联用法（口mol/L）化学发光免疫分析法（口mol/L）酶循环法（口mol/L）液质联用与化学发光免疫分析的偏倚（%）液质联用与酶循环的偏倚（%）低Test316.546.20.505.170.59Test138.328.108.002.703.90Test208.978.308.307.427.42Test3910.4910.3010.20.842.79Test1710.5510.0010.105.254.30Test040.759.709.909.777.91Test0211.3610.0010.101.0111.13Test0911.429.8010.5014.218.08Test011.4410.5010.208.2310.85Test2611.5910.1010.9012.825.92Test3311.6810.9010.506.7110.13Test3511.9110.6010.4011.0312.71Test1212.1211.2011.107.598.41Test2312.2410.4011.0015.000.10Test2812.3711.5011.907.003.76Test061.3910.9010.8012.0612.87Test3612.4310.9010.9012.2912.29Test1412.4711.1011.2010.9710.17均值11.0610.0310.149.007.96中Test2415.3812.7012.8017.4316.78Test1015.5512.9012.9017.0317.03Test0515.8013.1013.5017.0914.56Test2716.7614.0013.5016.4919.47Test1817.4715.1014.9013.5714.72Test1518.2416.3015.7010.6313.92Test1918.4815.3016.5017.2110.71Test301.6915.9016.3014.9412.80Test3818.9316.5016.5012.8512.85Test2519.2614.6015.5024.181.51Test1619.8415.6016.8021.3815.33均值17.674.7314.9916.6215.24高Test3430.1622.9024.083.9121.09Test3730.3923.1023.9823.8321.35Test0830.9022.3023.1027.8225.23Test1137.2427.4025.4026.4231.79Test2244.0930.1031.3031.7429.01Test3246.0331.3033.2032.0027.87Test4046.3333.1232.2028.5130.50Test0350.2331.3033.4037.6933.51Test0150.4034.2033.1032.144.33Test2152.5134.5334.9034.2433.54Test2952.7336.3337.1031.1029.64均值42.8229.6929.9730.1328.903我室与NCCL、CAP室间质评结果分析2014-2016年，我室Hcy项目参与NCCL和CAP室间质评，我室结果（液质方法）与CAP靶值偏差均在可接受范围内，而与NCCL靶值偏差较大，表3、4分别汇总了2014-2016年CAP和NCCL室间质评反馈结果。两个机构虽然评价标准和方式有差别，但是从我室结果与靶值的偏倚程度上可以看出NCCL反馈结果随着浓度的增加偏倚增大（见表3）,当浓度＞50顷。l/L,偏倚已超过50%,且均是我室结果大于靶值。连续3年内进行的5次比对均是同样的趋势，表明这—现象并非偶然，而是存在着规律。在进行NCCL室间质评过程中，我室所属组为缺省组组别或所有组组别，参与NCCL室间质评的其他实验室大多采用免疫类方法（尤其以循环酶法为主）进行检测。而我室参加CAP室间质评所属组为色谱法组别，并未发现待测成分浓度与偏倚存在联系，偏倚均＜25%，连续3年共6次的结果均匀分布在靶值上下可以接受的范围内。除此之外，我室在参加NCCL和CAP这两个机构的室间质评时，严格保证是同一时间，同一实验人员，用同一台仪器，同一条标曲去定量分析。对于这些差异，我室分析传统的免疫方法特异性相对较低，易受基质复杂的血液样本中内源性物质的干扰，使得定量结果偏低，而这种干扰正相关。液质联用法特异性强，采用标准曲线进行定量可以校正这种干扰。表3NCCL室间质评反馈结果允许范围评价结果2014上半年20141116.415.46.4912.3~18.5年份样本编号我室结果（pmol/L）靶值（pmol/L）偏倚（%）通过20141224.920.322.6616.2~24.4未通过20141334.425.634.3720.5~30.7未通过20141452.334.352.4827.4~41.2未通过20141576.443.276.8534.6~51.8未通过2015上半年20151316.6515.378.3312.30~18.44通过20151126.6821.3625.1417.06~25.58未通过20151239.9727.2746.5721.82~32.72未通过20151547.5032.8444.6426.27~39.41未通过20151454.1335.8151.1628.65~42.97未通过2015下半年20152215.7714.637.7911.70~17.56通过20152519.9416.6120.0513.29~19.93未通过20152435.4724.8442.7919.87~29.81未通过20152155.3435.2556.9928.20~42.30未通过20152361.2737.7262.4330.18~45.26未通过2016上半年20161318.9815.1225.5312.10~18.14未通过20161227.4319.5140.5915.61~23.41未通过20161534.7723.6846.8318.94~28.42未通过20161166.3236.1283.6128.90~43.34未通过20161471.3838.7784.1131.02~46.52未通过2016下半年20162326.2318.5741.2514.86~22.28未通过20162253.6131.1072.3824.88~37.32未通过20162454.3129.0986.7023.27-34.91未通过20162555.1732.3670.4925.89~38.83未通过20162160.2133.2181.3026.57~39.85未通过表4CAP室间质评反馈结果允许范围评价结果2014上半年HMS-013.84.5817.02.5~6.6年份样本编号我室结果3mol/L）靶值3mol/L）偏倚（%）通过HMS-0248.153.6910.432.7~74.7通过HMS-0324.126.8410.216.1~37.6通过2014下半年HMS-0422.423.143.212.3~34.0通过HMS-0512.513.386.67.2~19.6通过HMS-064.65.4916.22.5~8.5通过2015上半年HMS-0122.024.189.017.5~30.9通过HMS-024.15.2521.91.9~8.6通过HMS-0346.550.588.137.3~63.9通过2015下半年HMS-045.25.8511.13.1~8.6通过HMS-0526.524.129.917.8~30.5通过HMS-0617.914.3824.510.7~18.1通过2016上半年HMS-0153.147.9910.622.3~73.9通过HMS-0229.024.4918.411.2~37.8通过HMS-035.95.2412.62.1~8.3通过2016下半年HMS-046.55.8710.74.1~7.6通过HMS-0520.717.9315.410.9~24.9通过HMS-0637.531.8317.819.0~44.7通过讨论血清Hcy水平是临床上早期诊断心脑血管疾病的重要指标，鉴于其是动脉粥样硬化和心血管疾病独立危险因素，精准检测为临床医生提供可靠的实验数据显得尤为重要。本文分析了历年来NCCL和CAP的室间质评结果，并采用液质联用法，化学发光免疫分析法，酶循环法三种方法同时测定Hcy，提出了液质联用法和免疫类方法测定Hcy时存在一定的差异，且这种差异与浓度存在正相关。有文献表明循环酶法与液质联用法测定Hcy的结果确实存在偏差，液质联用法的结果明显偏高［17］，我室的测定结果与文献报道中存在的现象相吻合。分析造成这一现象的原因可能是NCCL室间质评中应用最为广泛的循环酶法易受血浆中内源性物质的干扰［18］，且循环酶法的线性范围较窄，当血浆中的Hcy浓度高于SOpmol/L时，测定偏差较大［19］。我室采用的液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测方法从原理上讲采用三重四级杆质谱仪作为检测器，MRM扫描模式，第一个四级杆筛选母离子，第二个四级杆也就是碰撞室对母离子进行碰撞诱导解离，第三个四级杆筛选子离子，这就使其具备高选择性，避免了待测样品中内源性物质的干扰。液质联用法专属性好，灵敏度、准确度和精密度高，线性范围更宽，借助标准曲线进行定量的结果更为可靠［20］，与免疫法相比，液相色谱串联质谱法更适用于小分子化合物的定性和定量检测［21］。除此之外，个体化和精准医疗的发展在很大程度上依赖于准确的检测结果，而质谱技术作为高新检测技术，在临床生化检测、临床免疫学检测及临床分子生物学诊断等领域已经开始显现成果，成为临床上一种重要的检测技术［22］。液质联用法可以实现批量处理标本，进行高通量检测，基于以上，液质联用法更适合临床大规模Hcy标本测定的需要［17］。医学诊断行业内的权威机构MayoClinic(梅奥医学诊断中心)官方提供的资料中显示血浆中Hcy检测方法为液质联用法，进一步佐证了液质联用法的可靠性。参考文献【相关文献】［1］肖路延，唐志毅.荧光偏振免疫分析法测定血浆中同型半胱氨酸［J］.临床检验杂志，2001,19(1):35-36.［2］张术华，程必蕴.不同方法测定同型半胱氨酸结果比较分析［J］.检验医学与临床，2012,9(10):1191-1192.［3］杨涛，高金娥.血同型半胱氨酸检测的临床意义及其与冠心病研究进展［J］.内蒙古医科大学学报，2016(1):80-83.刘君，万云高，孙志媛，等.同型半胱氨酸与心脑血管疾病相关性研究进展[J].中华临床医师杂志：电子版，2012,6(1):94-98.周莉，于秀娟，管洪在.血清同型半胱氨酸四种检测方法诊断脑梗死的效能比较及评价[J].山东医药，2015(21):54-56.赵静.循环酶法与荧光偏振免疫法测定血清同型半胱氨酸水平的结果比较[J].河北医学，2014(11):1801-1804.符俊超，邸玉玮，郑卫东，等.循环酶法检测同型半胱氨酸的性能验证分析[J].中国卫生检验杂志，2014(13):1913-1915.[8]唐秀芳，甄乾娜，樊子勉，等•柱前衍生高效液相色谱-荧光检测法测定血浆中同型半胱氨酸[J].色谱，2012,30(6):613-617.[9]黄秋靖，张琦，彭婕，等.甲基丙二酸尿症伴同型半胱氨酸尿症的眼部表现[J].国际眼科杂志，2015(12):2090-2093.[10]KOVACA,SVIHLOVAK,MICHALICOVAA,etal.LiquidChromatographyTandemMassSpectrometryMethodforDeterminationofHomocysteineinRatPlasma:ApplicationtotheStudyofaRatModelforTauopathies[J].JChromatogrSci,2015,53(6):953.[11]GOPUCL,HARIPR,GEORGER,etal.Simultaneousdeterminationofhomocysteineandasymmetricdimethylarginineinhumanurinebyliquidchromatography-tandemmassspectrometr