动物毒性试验

关于动物毒性试验第一页，共五十六页，2022年，8月28日一、实验动物与实验动物化世界上的动物通常被我们按照其与人类的关系分为：野生动物（WildAnimal）经济动物（EconomicAnimal）观赏动物（OrnamentalAnimal）实验动物（LaboratoryAnimal）。是指经人工饲育，对其携带微生物实行控制，遗传背景明确或来源清楚的，用于科学研究、教学、生产、检定以及其它科学试验的动物。第二页，共五十六页，2022年，8月28日实验动物化：指以其它三类动物为来源，人为的使之变为实验动物的过程。实验用动物：Animalforexeperiment是指某些未经充分实验动物化，而在某些实验研究中经常用到或不可不用的动物。实验动物的特点：个体间的均一性；某些遗传上的稳定性；比较容易获得。第三页，共五十六页，2022年，8月28日二、实验动物的分类按微生物控制分：

种类饲养条件无菌动物（Germfreeanimal）隔离系统Isolationsystem悉生动物（Gnotobioticanimal）也叫已知生物体动物隔离系统Isolationsystem无特定病原体动物（SPF动物）（Specificpathogenfreeanimal）屏障系统中Barriersystem普通动物（Conventionalanimal）开放系统Opensystem（国际上）第四页，共五十六页，2022年，8月28日

我国的分类标准：——1994年国家技术监督局发布一级，普通动物（Conventionalanimal，CV）二级，清洁动物（Cleananimal，CL）三级，无特定病原体动物（Specificpathogenfreeanimal，SPF）四级，无菌动物（Germfreeanimal，GF）二级，清洁动物的饲养要求：

有屏障设施，空气经过滤净化，正压，进入饲养环境的一切物品均应严格灭菌：饲料、垫料、饮水、笼器具、工作人员的衣物、实验用品等。第五页，共五十六页，2022年，8月28日2按遗传学控制分近交系（Inbredstrain）封闭群（Closecolony）突变系（Mutantstrain）系统杂交动物（Hybirdanima）现代遗传工程产生的新品系第六页，共五十六页，2022年，8月28日1）近交系（Inbredstrain）

指近交程度相当于全同胞兄妹连续交配20代以上，近交系数达98.6%以上，基因达到高度纯合和稳定的动物群。①常见的培育方式：全同胞兄妹交配（B×Smating）父女或母子交配（回交，backcross）堂兄妹交配（cousinmating）不同的近交方式决定了近交程度提高的速度近交程度的衡量是以近交系数来表示的第七页，共五十六页，2022年，8月28日近交系数指群体中两个等位基因源于同祖先同一基因的概率1960年，Falconer经试验获得计算公式：Fn=1-(1-△F)nFn——第n代的近交系数n——近交代数△F——近交系数的代递增率同胞兄妹交配：19.1%父女或母子交配：19.1%堂兄妹交配：8%同父异母者交配：11.0%第八页，共五十六页，2022年，8月28日③近交系动物的特点基因位点的纯合性(homozygosity)遗传组成的同源性(isogenicity)长期遗传的稳定性(stability)表现性的均一性(uniformity)遗传特征的可辨别性(identifiability)遗传组成的独特性(individuality)国际分布性(internationaldistribution)背景资料的完整性(backgrounddata)第九页，共五十六页，2022年，8月28日④常用的近交系动物

日前世界上至少有250个小鼠品系，111个大鼠品系，20个家兔品系和14个豚鼠品系。在实验中应用最多的绝大部分是小鼠和大鼠的近交系。

小鼠常用的近交品系主要有：C57BL、C3H、BALB/c、DBA/2、CBA、A、AKR、NAB、B10.D2、SJL。

大鼠常用的近交品系主要有：F344、LEW、BN、SHR、DA、PVG、WAG、AC1、WF、WKY。第十页，共五十六页，2022年，8月28日2）封闭群（Closecolony）也称非近交系（noninbredstrain）、远交群和远交原种（outbred）。特点：具有杂合性，避免了近交衰退；较强的繁殖力和生活力，表现为：产仔多、胎间隔短、生长块、成熟早、疾病抵抗力强，成本低，可大量供应。个体差异较大常用品系：小鼠：昆明、NIH、ICR、LACA；大鼠：Wistar、SD；DunkinHarleg豚鼠；新西兰兔等。培育要求：5年以上不从外部引种，即不引进任何新的基因；只在群内进行随机交配；群体大小应保持在50只以上。第十一页，共五十六页，2022年，8月28日3）突变系（Mutantstrain）正常染色体的基因发生突变而具有了各种遗传缺陷的动物，进行定向培育而成的近交系；或用遗传学方法将突变基因导入已育成的近交系；这样具有突变基因的近交系称突变系。如果将突变基因保持在一个封闭群当中，称突变原种（mutantstock）。第十二页，共五十六页，2022年，8月28日4）系统杂交动物（Hybirdanima）指两个不同近交系杂交产生的第一代动物，也叫F1动物。特点：具有杂交优势。抗病力强，对环境和实验处理的耐受性强，克服了近交衰退，适于各种长期慢性实验；遗传和表现型的一致性。具有与近交系相似的个体均一性同时具有两个亲本片系的特点。不能进一步繁殖而保持其遗传组成不变，否则会出现遗传分离和基因重组。第十三页，共五十六页，2022年，8月28日5）现代遗传工程产生的新型品系

①转基因动物指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的动物。如果外源基因在动物染色体上整合稳定，则能进一步繁殖而保持外源DNA的存在。②嵌合体动物指将动物早期胚胎进行分割与同种或异种的胚胎细胞聚合而发育成的个体。不能进一步繁殖，只能在需要时随时生产。第十四页，共五十六页，2022年，8月28日三、实验动物的选择原则根据实验目的和要求，可考虑以下几个原则：1.近似性原则2.差异性原则3.易化原则4.相容和匹配原则5.重复性和均一性原则6.易获性原则：还要考虑是否经济及是否容易饲养管理

还要注意动物的种类、品种或品系、质量（遗传、微生物及营养状况）和健康状况等。第十五页，共五十六页，2022年，8月28日三、实验动物的选择原则根据实验的具体目的和要求，可考虑以下几个方面：1.选用与人类的机能、代谢结构、及疾病特点相似的实验动物。2.选用遗传背景明确、具有已知菌群及模型性状显著且稳定的动物。3.选用解剖生理特点符合实验目的要求的实验动物4.选用具有符合研究需要的某些特殊反应的动物。5.选用人畜共患疾病的实验动物6.选用传统应用的实验动物。第十六页，共五十六页，2022年，8月28日四、啮齿类实验动物的意义1.代谢方式与人接近，对化学物质敏感。2.体型大小适中。3.自然寿命不长，繁殖力强。4.实验动物化程度高。

常选用大、小白鼠。其它啮齿类动物如豚鼠、长爪沙鼠、地鼠等，

第十七页，共五十六页，2022年，8月28日五、动物实验所得数据的种属差异毒理学实验一般要求用两种实验动物（其中一种为非啮齿类）对同一毒物进行试验，以得到的两个LD50之比来划分种属差异的大小：LD50（A）／LD50（B）

易感性＜3没有种属差异3.1～9中等种属差异＞9明显种属差异第十八页，共五十六页，2022年，8月28日六、实验动物的饲育环境温度：各种实验动物的最适温度如下表，且要求温差不大于3℃，动物小鼠大鼠兔猫狗灵长类温度℃15-2018-2215-2015-2015-2020-24湿度：湿度过高微生物易于繁殖，过低（＜40％)易使灰尘飞扬，相对湿度还影响体温调节。因此，湿度以40～70％为宜，尤以45～55％为最适相对湿度。（一）气候因素第十九页，共五十六页，2022年，8月28日3.光照：光照与动物性周期有密切关系，尤其鼠类要避免日光直射。因此可以采用完全的人工光照，昼夜明暗交替，12h：12h或10h：14

h

。4.音响、噪音:

可引起动物紧张，大、小鼠尤怕突然音响，要求噪音不高于65分贝，一般60分贝以下（狗除外）。（二）物理化学因素5.

粉尘包括微生物在内。实验动物室的粉尘可引起鼻、咽喉炎、哮喘、发热、皮肤炎等过敏性症状，粉尘中的微生物也可造成动物污染。粉尘的数量与空气过滤效果、换气次数、空气湿度、饲养方式、人员操作等有关。第二十页，共五十六页，2022年，8月28日6.气流速度及空气清洁度：动物室内的臭气主要有氨、甲基硫醇、硫化氢等物质。以氨的浓度最高，故一般以氨的含量作为衡量空气质量的重要指标。当氨浓度较高时，会刺激动物的粘膜而引起流泪、咳嗽，严重时可引起急性肺水肿，而造成动物死亡。高浓度的氨引起动物体质下降，从而影响动物实验效果。要求空气中的NH3不超过20ppm。因此要求有5-15次／小时的换气量。气流速度为10-25cm／s。再加上适当的饲养密度和日常清洁工作。为了抑制动物室内的臭气，应减少动物饲养密度，2～3日左右频繁地更换笼具、垫料，增加换气次数。我国动物室的氨浓度标准为14mg／m3以下。（三）居住因素：笼具、垫料、饮水器等第二十一页，共五十六页，2022年，8月28日第二十二页，共五十六页，2022年，8月28日第二十三页，共五十六页，2022年，8月28日第二十四页，共五十六页，2022年，8月28日第二十五页，共五十六页，2022年，8月28日七、动物营养要求饲料蛋白质最少占13—15％，最好18-24％,但通常不超过30％，而其中1／3为营养价值较高的蛋白质。饲料中脂肪占4-6％，一般不超过10％。碳水化合物在40-70％左右，粗纤维要占10-15％钙占1.5％，磷占0.75％。此外，还要注意维生素E和B族维生素及食盐的供应。大鼠对Vk与Vc无特殊要求，但豚鼠应注意Vc供应，兔子饲料中应保证有足够的纤维素，狗的饲料中应有一定的肉食，还要保证有适当的户外活动.第二十六页，共五十六页，2022年，8月28日成分名称成分含量%主要微量元素含量（每kg饲料中）主要维生素含量（每kg饲料中）粗蛋白≥18铁不低于100mg铜不低于10mg

不高于250mg锌不低于30mg锰不低于80mg维生素A不低于7000IU维生素D3不低于800IU维生素E不低于60IU维生素K3不低于3mg维生素B6不低于8mg维生素B12不低于0.02mg粗纤维≤5粗灰分≤8钙0.8-1.8总磷0.6-1.2赖氨酸≥1.35食盐0.5水分≤10大、小鼠生长维持颗粒饲料北京科澳协力饲料有限公司按照GB14924·3-2001标准生产第二十七页，共五十六页，2022年，8月28日大、小鼠繁殖颗粒饲料成分名称成分含量（%）主要微量元素含量（每kg饲料中）主要维生素含量（每kg饲料中）粗蛋白≥20铁不低于100mg铜不低于10mg

不高于250mg锌不低于80mg锰不低于80mg维生素A不低于15000IU维生素D3不低于600IU维生素E不低于120IU维生素K3不低于10mg维生素B6不低于12mg维生素B12不低于0.01mg粗纤维≤5粗灰分≤8钙0.8-1.8总磷0.6-1.2赖氨酸≥1.35食盐0.5水分≤10第二十八页，共五十六页，2022年，8月28日第二节常用试验动物的一般处理第二十九页，共五十六页，2022年，8月28日一、试验前观察

动物在试验前，一般要观察一周，使实验动物适应实验室生活条件，同时淘汰一部分不健康与不适用的动物。慢性毒性试验要求比较严格，最好观察两周，并反复仔细观察。实验动物必须健康并发育正常，体型丰满，毛浓密且紧贴于皮肤表面，有光泽，眼明亮而有神，天然孔无分泌物，周围清洁，食欲良好，运动敏捷自如，无异常姿态。第三十页，共五十六页，2022年，8月28日

生理常数项目

大鼠小鼠豚鼠家兔猫狗妊娠天数（日）21～2318～2165～7228～3260～6858～63断奶天数（日）25～3020～3021～3545～556060断奶时体重（g）50±10～14200±700±性成熟时期（月）2.5～32±4±6～83～412±性成熟时体重（g）150～25020～30500～700

1000±出入较大每年胎次4～74～73～53～52～32每胎仔数5～95～9

1～5

3～53～61～10自然寿命（年）2～2.51.5～26～84～910～12

20±体温（℃）37.5～39.5

38～3938～39.5

38～39.5

38～3937.5～39呼吸频率（次／分）70～100140～180

80～12050～6010～30脉搏（次／分）270～350540～720

230～390

120～14070～120血压（mmHg）90～120133～160

75～9082～124120～140常用实验动物的生理常数第三十一页，共五十六页，2022年，8月28日二、试验动物编号与标记

1染色标记：常用于大鼠、小鼠、豚鼠等动物红色（0.5％中性红或品红溶液）——代表十位数黄色（3～5％苦味酸染料）——代表个位数习惯上按前中后和左中右次序分成9区，代表1～9。这样，用此种方法即可标记99只动物。第三十二页，共五十六页，2022年，8月28日二、试验动物编号与标记

鼠尾染色标记法第三十三页，共五十六页，2022年，8月28日二、试验动物编号与标记

2剪耳标记：

用于兔、大鼠等在耳朵不同部剪一小孔（或用打孔器打一小孔）表示一定号码。3其它，如挂牌和剪毛等方法

第三十四页，共五十六页，2022年，8月28日三、实验动物的抓取和保定

大小鼠兔豚鼠犬

第三十五页，共五十六页，2022年，8月28日四、被检物的给予方式和途径1消化道染毒法1)灌胃法：是将液态、气或固态受试化合物溶于某溶剂中，配制成一定浓度，装入注射器等定量容器，经过导管注入胃内。

①该种方法特点、要求：

能准确掌握给予被检物的剂量与时间需做成一定剂型对每只动物逐一进行，工作量大，且容易造成损伤所以，一般只适用于一次给予被检物的急性毒性试验，灌胃前，动物应停食12h，否则胃的充盈程度不同，影响结果，灌胃后，至少经3h再喂食。第三十六页，共五十六页，2022年，8月28日②被检物的配制用水或经过加热的植物油配成均匀水溶液或油溶液。在水和油中均不溶的物质，可用吐温—60（tween—60）或吐温—80水溶液配成乳状液将被检物在蛋黄中研匀，逐滴加入植物油，蛋黄与油的比例为7.5：5，然后再加入适量水配成乳液也可用1～3％的淀粉液或1～3％羧甲基纤维素溶液配成悬浮液。第三十七页，共五十六页，2022年，8月28日在各种溶液中，被检物浓度可根据给予动物剂量和可能灌入的液体容积而定。小鼠0.2～0.7ml；大鼠1～4ml左右为宜，大动物一般最多不超过动物体重的2％。2)自由采食（又叫喂饲法）

指将受试物掺入饲料或饮水中，让动物自由摄入。

这种方法由于动物摄食量的变化和摄食中的损失，剂量不够精确但无上述灌胃法缺点，适用于多次给药的慢性试验中。第三十八页，共五十六页，2022年，8月28日将被检物掺入饲料中，必须注意下列问题：

被检物必须在饲料中混合均匀，在饲料中不挥发、不分解破坏；被检物不与饲料起反应，不影响饲料的感官性状和动物食欲；不降低饲料的营养价值和消化吸收率；应尽量保证掺有被检物的饲料，按设计剂量全部被试验动物摄入；动物生长发育期间，随时调整掺入数量，以保证按公斤体重计算的剂量稳定。将被检物掺入饮水的方法的基本原则与掺入饲料类似，每日饮水量小鼠约为1.5～3ml，大鼠8～15ml。在食品毒理学研究中，该方法较少采用。第三十九页，共五十六页，2022年，8月28日3)吞咽胶囊指将一定剂量的受试化学物装入药用胶囊内，强制放入到动物的舌后咽部，迫使动物咽下。

此种方法剂量准确，尤其适用于易挥发、易水解和有异味的化合物，适于兔、猫、狗等大动物。第四十页，共五十六页，2022年，8月28日2经呼吸道染毒

适于气体、粉尘、蒸汽等状态的毒物，这种方式又可分为两种类型：

2）气管注入：

是将受试物注入实验动物气管或肺内。此种类型实际上相当于对动物进行一次“手术”。1）呼入接触法：

即将受试动物置于含有一定浓度的外来化学物的染毒柜中，或其它器皿中，动物自然吸入化学物。第四十一页，共五十六页，2022年，8月28日3经皮肤染毒

主要有浸尾试验和皮肤涂药试验。其目的是鉴定化学物经皮肤吸收作用、局部刺激作用、致敏作用、光感作用等。比如化妆品安全性鉴定。第四十二页，共五十六页，2022年，8月28日五、实验动物的性别鉴别1大鼠与小鼠：

幼年时主要依肛门与生殖孔的距离区分，间距大并有毛者为雄性，小并无毛者为雌性。成年雌性在腹部还可摸到乳头，雄性卧位时可见睾丸。

2家兔：雄性生殖孔为圆形，用手指扒开可见中间有圆锥状稍向下弯的阴茎，气温高时可见到或触及睾丸。雌性生殖孔为一椭圆形间隙，呈尖叶形，上宽下窄，且距肛门较近，成年兔腹部可见乳头。第四十三页，共五十六页，2022年，8月28日六、生物材料的采集1血样的采集1）断尾采血：大、小鼠，可少量多次采血。2）眼眶后静脉丛采血：大、小鼠，中等采血量多次采血。3）心脏采血：大鼠、豚鼠、兔等，4）断头采血：大、小鼠，一次大量采血。5）摘眼球采血：大、小鼠，一次，大量6）耳缘静脉采血：兔，多次7）股静脉或股动脉采血：大鼠、兔等，一次（放血）或多次（抽血）试验。采血量较大。8）颈静脉或颈动脉采血：大鼠、兔等，多次

第四十四页，共五十六页，2022年，8月28日选择采血方法应根据实验动物品种、所需采血量、采血次数和操作条件确定。实验动物的允许采血量

━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━动物品种最大安全采血量（ml）最小致死采血量（ml）━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

小鼠0.10.3大鼠1.02.0豚鼠5.010.0家兔10.040.0━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

第四十五页，共五十六页，2022年，8月28日2血液标本的选择1）全血：采血时加入适当抗凝剂，使血液不产生凝固，含有有形成份的标本。含水约81%。常用于碳氧血红蛋白、高铁血红蛋白、硫血红蛋白、细胞培养等测定，及制备血中各种细胞和全血分析用。常用抗凝剂有：肝素、草酸钾、草酸钠、草酸铵、草酸锂、枸橼酸钠等。第四十六页，共五十六页，2022年，8月28日2）血浆：全血中加入适当抗凝剂，去除细胞成份后剩余部分的标本。含水约93%。

3）血清：是血浆中除去凝血因子纤维蛋白原的标本血清是生化分析中最常用的标本。

采血后可立即分离，可避免凝血时和运输时溶血。其中含有一种纤维蛋白原和前凝血酶。多用于血液凝固机制方面的检验，如游离血红蛋白、变性血红蛋白、纤维蛋白质的分析及血浆分析第四十七页，共五十六页，2022年，8月28日3尿液的收集

因动物不同而异。包括代谢笼法、导尿管法、输尿管引出法和膀胱瘘管法等。

4组织匀浆的制备

用器械在一定的溶液中将组织细胞磨碎，其设备为匀浆器。现用的匀浆器有玻璃匀浆器、高速组织捣碎机、超声波匀浆器等。

第四十八页，共五十六页，20