阿霉素耐药的乳腺癌MCF-7Adm细胞系的建立及其耐药特性

阿霉素耐药的乳腺癌MCF-7/Adm细胞系的建立及其耐药特性郑婷婷（1987-）女，山西大同人，硕士研究生，主要从事抗肿瘤天然药物方面的研究摘要：建立肿瘤耐药细胞系是研究肿瘤细胞的重要手段之一，也是探讨肿瘤多药耐药机制及其逆转的基础。该论文采用大剂量间歇诱导法诱导MCF-7细胞，建立MCF-7/Adm耐药模型；MTT法检测耐药倍数；流式细胞术检测MCF-7细胞和MCF-7/Adm细胞中阿霉素的积累量；real-timePCR检测MCF-7/Adm细胞中ABCG2、ABCC1、ABCB1基因的表达。结果显示，阿霉素抑制MCF-7和MCF-7/Adm细胞存活的IC50值分别为0.535μg/mL和173.275μg/mL，耐药倍数为324；MCF-7细胞中的阿霉素积累量较MCF-7/Adm明显高；MCF-7/Adm细胞中mRNA水平ABCB1基因表达明显上调，ABCG2和ABCC1基因表达下调。本文成功获得对阿霉素耐药的人乳腺癌耐药细胞株MCF-7/Adm，为进一步研究乳腺癌多药耐药机制及其逆转提供有利工具，并且对乳腺癌化疗药物的筛选具有一定的意义。关键词：阿霉素；乳腺癌；耐药；ABCB1中图分类号：R737.9文献识别码：A0引言乳腺癌是女性多发的恶性肿瘤之一，对妇女的身心健康造成严重威胁。据统计，世界范围内每年新增患者约200万人，死亡率呈逐年上升趋势ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>黄哲宙</Author><Year>2021</Year><RecNum>211</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[1,2]</style></DisplayText><record><rec-number>211</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">211</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>黄哲宙</author><author>陈万青</author><author>吴春晓</author><author>郑荣寿</author><author>陈建国</author><author>杨念念</author><author>王宁</author><author>张思维</author><author>郑莹</author></authors></contributors><titles><title>中国女性乳腺癌的发病和死亡现况——全国32个肿瘤登记点2021—2021年资料分析报告</title><secondary-title>肿瘤</secondary-title></titles><periodical><full-title>肿瘤</full-title></periodical><pages>435-439</pages><volume>32</volume><number>6</number><dates><year>2021</year></dates><urls></urls></record></Cite><Cite><Author>王希龙</Author><Year>2021</Year><RecNum>212</RecNum><record><rec-number>212</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">212</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>王希龙</author><author>邱文秀</author><author>贾中明</author><author>韩勇</author><author>张国强</author><author>董新军</author></authors></contributors><titles><title>乳腺癌的诊断现状及最新进展</title><secondary-title>中国综合临床</secondary-title></titles><periodical><full-title>中国综合临床</full-title></periodical><pages>787-788</pages><volume>28</volume><number>8</number><dates><year>2021</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"黄哲宙,2021#211"1,HYPERLINK\o"王希龙,2021#212"2]。目前，乳腺癌的治疗中，化疗占有十分重要的地位，尤其是对于癌细胞已经扩散的患者，化疗是主要的治疗方法。然而随着化疗药物使用时间的增长，化疗药物对肿瘤细胞的杀死作用逐渐减小，同时也会表现出对不同结构和作用机理的药物产生交叉耐受性，这种现象称为多要耐药性（multidrugresistance，MDR）ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Liu</Author><Year>2021</Year><RecNum>14</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[3]</style></DisplayText><record><rec-number>14</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">14</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Liu,F.S.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofObstetricsandGynecology,ShowChwanMemorialHospital,Changhua,Taiwan.fsliufsliu@.tw</auth-address><titles><title>Mechanismsofchemotherapeuticdrugresistanceincancertherapy--aquickreview</title><secondary-title>TaiwanJObstetGynecol</secondary-title></titles><periodical><full-title>TaiwanJObstetGynecol</full-title></periodical><pages>239-44</pages><volume>48</volume><number>3</number><edition>2021/10/03</edition><keywords><keyword>AntineoplasticAgents/therapeuticuse</keyword><keyword>DrugResistance,Multiple</keyword><keyword>DrugResistance,Neoplasm</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>Neoplasms/drugtherapy</keyword><keyword>StemCells/drugeffects</keyword></keywords><dates><year>2021</year><pub-dates><date>Sep</date></pub-dates></dates><isbn>1875-6263(Electronic) 1028-4559(Linking)</isbn><accession-num>19797012</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.1016/s1028-4559(09)60296-5</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"Liu,2021#14"3]。肿瘤细胞对化疗药物产生交叉耐药是化疗成功的主要障碍，对肿瘤的治疗极为不利，也是困扰着肿瘤学家和癌症患者的一个重大问题。MDR发生机制比较复杂，但目前ABC转运蛋白（theATP-BindingCassetteTransporters）被认为是导致MDR的主要机制之一，其在肿瘤多药耐药产生中的主要作用是将化疗药物由肿瘤细胞内泵至细胞外，降低细胞内药物浓度，从而导致MDR的产生ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Schinkel</Author><Year>2021</Year><RecNum>27</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[4]</style></DisplayText><record><rec-number>27</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">27</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Schinkel,AlfredH</author><author>Jonker,JohanW</author></authors></contributors><titles><title>MammaliandrugeffluxtransportersoftheATPbindingcassette(ABC)family:anoverview</title><secondary-title>Advanceddrugdeliveryreviews</secondary-title></titles><periodical><full-title>Advanceddrugdeliveryreviews</full-title></periodical><dates><year>2021</year></dates><isbn>0169-409X</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"Schinkel,2021#27"4]，其中与临床肿瘤治疗关系最密切的是ABCB1、ABCC1、ABCG2。建立耐药细胞系是研究肿瘤细胞的重要手段，对肿瘤的治疗具有十分重要的意义，是探讨恶性肿瘤多药耐药机制及其逆转多药耐药性的基础。本研究采用大剂量间歇诱导法诱导MCF-7细胞，建立阿霉素耐药的人乳腺癌MCF-7细胞系，并检测耐药模型较亲本株的耐药倍数，细胞内药物的积累量等参数，以及多药耐药的标志基因ABCB1、ABCC1、ABCG2的表达变化，为深入研究肿瘤耐药及多药耐药逆转提供理想的模型和实验依据。1材料与方法1.1细胞株、药物与主要试剂人乳腺癌MCF-7细胞系购于中国科学院上海细胞生物所，1640培养液购于康宁公司，胎牛血清购于Thermo公司，0.25%胰酶购于碧云天公司，四甲基偶氮唑盐（(3-(4，5-dimethylthiazol)-2，5-diphenylte-2H-tetrazoliumbromide，MTT)、二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide，DMSO）购于sigma公司，阿霉素（Adriamycin，ADR）购于生工生物公司。1.2MCF-7细胞株的培养用含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的1640培养液在37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养，以0.25%胰蛋白酶消化，3~5d传代1次，取对数生长期的细胞用于实验。1.3耐药人乳腺癌细胞模型MCF-7/Adm的建立采用大剂量间歇诱导MCF-7细胞ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Zhou</Author><Year>2021</Year><RecNum>28</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[5]</style></DisplayText><record><rec-number>28</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">28</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Zhou,Yuan</author><author>Ling,Xian-Long</author><author>Li,Shi-Wei</author><author>Li,Xin-Qiang</author><author>Yan,Bin</author></authors></contributors><titles><title>Establishmentofahumanhepatomamultidrugresistantcelllineinvitro</title><secondary-title>Worldjournalofgastroenterology:WJG</secondary-title></titles><periodical><full-title>Worldjournalofgastroenterology:WJG</full-title></periodical><pages>2291</pages><volume>16</volume><number>18</number><dates><year>2021</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"Zhou,2021#28"5]。=1\*GB3①取对数期生长的MCF-7细胞按8×103个/孔接种于96孔板，每孔加190μL细胞悬液，培养24h后，加入终浓度为0.02、0.1、0.5、2.5、12.5(μg/mL)的阿霉素10μL/孔，设3个复孔；37℃、5%CO2条件下培养48h；加入5mg/mL的MTT10μL继续培养4h，弃去培养上清，每孔加入DMSO150μL摇床上摇10min，测定各孔的OD570值，计算阿霉素对MCF-7/细胞增殖的抑制率及IC50。其计算公式为：细胞生长抑制率（%）=[1-（实验组OD值-调零组OD值）/（对照组OD值-调零组OD值）]×100%。=2\*GB3②取MCF-7细胞接种于6㎝培养皿中，37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养，进入对数生长期后加入终浓度为0.6μg/mL的阿霉素，作用12h，弃含药培养液换不含阿霉素的培养液培养数代，待细胞生长状态良好以后，按上述方法重复，直至细胞能维持在0.6μg/mL阿霉素浓度下长期培养即成为耐药人乳腺癌细胞模型MCF-7/Adm。1.3MTT法检测MCF-7/Adm细胞系的耐药指数取对数期生长的MCF-7细胞，调整细胞密度，按每孔8×103个细胞接种于96孔板中，每孔加190μL细胞悬液，培养24h后，加入不同浓度的ADR，其终浓度分别为0、1、5、25、125、250（μg/mL），每孔总体积200μL；设对照孔为不加药物的；调零孔为不加细胞的培养液，每组设3个复孔。置于饱和湿度、37℃、5%CO2培养箱中继续培养48h，各孔加入MTT（5mg/mL）10μL，继续培养4h，弃去培养上清，每孔加入DMSO150μL摇床上摇10min，测定各孔OD570值，计算阿霉素对MCF-7/Adm细胞增殖的抑制率及IC50值、耐药指数。其计算公式为：耐药指数(RI)=耐药细胞IC50/亲本细胞IC50。1.4流式细胞术测定细胞内药物的积累量取生长状态良好的对数生长期MCF-7细胞、MCF-7/Adm细胞，分别以1×105个细胞接种于6㎝培养皿中，加RPMI1640培养液培养24h后，在培养液中加入阿霉素至终浓度为5μg/mL，培养24h后，0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，冷PBS洗涤2次，在重悬与冷PBS中，上流式细胞仪检测（激发波长488nm，反射波长575nm）。1.5实时荧光定量PCR检测MCF-7/Adm细胞中ABCG2、ABCC1、ABCB1基因的表达取对数生长期的MCF-7细胞、MCF-7/Adm细胞，分别以1×105个细胞接种于6㎝培养皿中，加RPMI1640培养液培养72h后，收集细胞。Trizol法提取总RNA，检测其浓度和纯度。经过逆转录分别得到其cDNA，用于Real-timePCR扩增。引物如表1所示，PCR体系的总体积为20μL，其中包括ddH206.4μL，上下游引物分别0.8μL，已稀释的cDNA2μL，SYRB10μL，置于实时定量PCR仪设置反应程序并进行PCR反应。设置反应条件为：预变性95℃10min，95℃15s，60℃1min，40个循环后收集荧光。采用2-ΔΔCt法分析数据。表1基因的引物序列及其扩增产物大小基因Real-timeqPCR引物序列产物大小（bp）GAPDHF：AGAAGGTCGGAGTCAACGGA227R：CTACTGGAAGATGGTGATGGGAABCG2F：TTCGCCGTCTCAACGCCATCC190R：GCCGCAGTGCCCATCACAACAABCC1F：AATGGCGGAGTTCCTGCTTAC218R：TTGATGCGGTGCTGTTGTGGABCB1F：GGAATGCGACAGGAGATAGG245R：AAGTGGTTTGCCCAGACAGC1.6统计学处理使用SPSS17.0软件统计分析，采用t检验、方差分析，资料以均数±标准差表示。2结果2.1大剂量间歇诱导出MCF-7/Adm细胞通过终浓度为0.6μg/mL的阿霉素反复间歇诱导，历时8个月成功诱导出MCF-7/Adm细胞。冻存复苏后细胞仍能稳定生长、增殖。如图1，与野生型MCF-7细胞比较，耐药细胞株MCF-7/Adm的形态发生明显变化，边缘不再呈尖角梭型，相对比较圆滑。野生型MCF-7细胞之间接触比较紧密，而耐药细胞株MCF-7/Adm之间间隙比较大，排列比较松散。在培养过程中发现，耐药细胞株MCF-7/Adm消化时间较野生型稍长。A：诱导前的MCF-7细胞B：诱导成功的MCF-7/Adm细胞图1MCF-7细胞及MCF-7/Adm细胞的形态观察（×200）2.2ADM对MCF-7和MCF-7/Adm细胞毒性作用及耐药指数的检测不同浓度的ADM作用于MCF-7和MCF-7/Adm细胞48h后，如图2所示，ADM对MCF-7和MCF-7/Adm细胞的抑制率都随着ADM浓度的升高而增大，但ADM对MCF-7细胞的抑制作用明显比MCF-7/Adm的强，0.02μg/mL的ADM已经对MCF-7细胞产生抑制作用，但ADM浓度增加为50倍即1μg/mL时，对MCF-7/Adm几乎没有抑制作用。与MCF-7细胞相比，MCF-7/Adm细胞对ADM有明显的耐药性（表2），MCF-7/Adm细胞的耐药指数RI为324倍(P<0.01)。图2阿霉素对MCF-7和MCF-7/Adm细胞增殖抑制作用（48h）表2MCF-7和MCF-7/Adm细胞对阿霉素的敏感性药物IC50值（μg/mL）耐药指数MCF-7细胞MCF-7/ADM细胞阿霉素（ADM）0.535±0.01173.275±1.323242.3MCF-7和MCF-7/Adm细胞内阿霉素药物蓄积量的测定用终浓度为5μg/mL的ADM处理MCF-7细胞和MCF-7/Adm细胞24h后，流式细胞术检测MCF-7和MCF-7/Adm细胞内阿霉素荧光强度，结果显示MCF-7细胞内ADM的荧光强度明显比MCF-7/Adm高，分别为98.6%和51.4%。说明MCF-7/Adm细胞内的阿霉素蓄积量明显低于MCF-7细胞，进一步说明MCF-7/Adm细胞较MCF-7细胞对阿霉素产生耐药性。A：诱导前的MCF-7细胞B：诱导成功的MCF-7/Adm细胞图3MCF-7和MCF-7/Adm细胞内阿霉素荧光强度2.4Real-timePCR检测MCF-7/Adm细胞中多药耐药的标志基因ABCG2、ABCC1、ABCB1的表达Real-timePCR结果显示，与敏感细胞株MCF-7相比，MCF-7/Adm细胞内ABCG2、ABCB1和ABCC1基因的表达有明显差异，其中ABCG2和ABCC1在耐药细胞中表达水平下调，而ABCB1在耐药细胞中表达水平上调。图4MCF-7和MCF-7/Adm细胞内基因ABCG2、ABCC1、ABCB1的表达3讨论目前肿瘤的多药耐药性仍被视为化疗中的最大障碍。各种肿瘤细胞获得耐药性的机制，都可能成为今后化疗的靶点ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>韩宜男</Author><Year>2021</Year><RecNum>24</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[6]</style></DisplayText><record><rec-number>24</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">24</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>韩宜男</author><author>钱江</author></authors></contributors><titles><title>肿瘤干细胞及其耐药性机制研究</title><secondary-title>中国眼耳鼻喉科杂志</secondary-title></titles><periodical><full-title>中国眼耳鼻喉科杂志</full-title></periodical><pages>123-125</pages><volume>12</volume><number>2</number><dates><year>2021</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"韩宜男,2021#24"6]。因此，深入研究肿瘤细胞耐药性机制的产生，寻找关键的靶点，进而针对靶点设计逆转肿瘤细胞多药耐药性的药物，为降低癌症死亡率和提高治愈率增加希望ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Saraswathy</Author><Year>2021</Year><RecNum>53</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[7]</style></DisplayText><record><rec-number>53</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">53</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Saraswathy,M.</author><author>Gong,S.</author></authors></contributors><auth-address>DepartmentofBiomedicalEngineeringandWisconsinInstitutesforDiscovery,UniversityofWisconsin-Madison,WI53715,USA.</auth-address><titles><title>Differentstrategiestoovercomemultidrugresistanceincancer</title><secondary-title>BiotechnolAdv</secondary-title></titles><periodical><full-title>BiotechnolAdv</full-title></periodical><edition>2021/06/27</edition><dates><year>2021</year><pub-dates><date>Jun22</date></pub-dates></dates><isbn>1873-1899(Electronic) 0734-9750(Linking)</isbn><accession-num>23800690</accession-num><urls><related-urls><url>/pubmed/23800690</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>S0734-9750(13)00110-9[pii] 10.1016/j.biotechadv.2021.06.004</electronic-resource-num><language>Eng</language></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"Saraswathy,2021#53"7]。肿瘤耐药细胞株的建立是研究MDR发生机制和逆转策略的重要手段。可以说，目前已知的MDR机制几乎都首先在耐药细胞株中发现，而后在临床病人中得到证实的ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Watson</Author><Year>2021</Year><RecNum>15</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[8]</style></DisplayText><record><rec-number>15</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">15</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Watson,M.B.</author><author>Lind,M.J.</author><author>Cawkwell,L.</author></authors></contributors><auth-address>CancerBiologyProteomicsGroup,PostgraduateMedicalInstituteoftheUniversityofHull,Hull,UK.</auth-address><titles><title>Establishmentofin-vitromodelsofchemotherapyresistance</title><secondary-title>AnticancerDrugs</secondary-title></titles><periodical><full-title>AnticancerDrugs</full-title></periodical><pages>749-54</pages><volume>18</volume><number>7</number><edition>2021/06/22</edition><keywords><keyword>AntineoplasticAgents/administration&dosage/pharmacokinetics/pharmacology</keyword><keyword>CellCultureTechniques/methods</keyword><keyword>CellLine,Tumor</keyword><keyword>DrugResistance,Neoplasm</keyword><keyword>Humans</keyword><keyword>Models,Biological</keyword><keyword>Neoplasms/drugtherapy/physiopathology</keyword><keyword>Phenotype</keyword><keyword>ReproducibilityofResults</keyword></keywords><dates><year>2021</year><pub-dates><date>Aug</date></pub-dates></dates><isbn>0959-4973(Print) 0959-4973(Linking)</isbn><accession-num>17581296</accession-num><urls></urls><electronic-resource-num>10.1097/CAD.0b013e3280a02f43</electronic-resource-num><remote-database-provider>NLM</remote-database-provider><language>eng</language></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"Watson,2021#15"8]。国内外学者们用药物递增诱导法建立了多种耐药肿瘤细胞株，以深入研究肿瘤耐药的机制。体外建立耐药细胞株作为研究肿瘤细胞MDR机制的重要工具至今已有20多年的历史，已产生多种诱导耐药，建立耐药细胞系的方法ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[HYPERLINK\o"Zhou,2021#28"5,HYPERLINK\o"Watson,2021#15"8,HYPERLINK\o"Li,2021#29"9]。阿霉素（adriamycin，ADM）是目前临床上应用较为广泛的抗肿瘤药物，抗瘤谱较广，主要适用于急性白血病，对急性淋巴细胞白血病及粒细胞白血病、乳腺癌、肉瘤、肺癌、膀胱癌等都有一定疗效ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>CH</Author><Year>2021</Year><RecNum>32</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[10]</style></DisplayText><record><rec-number>32</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">32</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"size="100%">LinR</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">，ShiN个L，WangCH</style></author></authors></contributors><titles><title>Invitrostudyofanti-cancerdrugdoxorubicininPLGA-basedmicroparticles</title><secondary-title>Biomaterials</secondary-title></titles><periodical><full-title>Biomaterials</full-title></periodical><pages>4476-4485</pages><volume>26</volume><dates><year>2021</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"CH,2021#32"10]。它是一种蒽环类抗生素，主要是通过进入细胞核固定在拓扑异构酶Ⅱα-DNA复合体上，影响细胞增值，达到杀伤肿瘤细胞的目的，对各种生长周期的肿瘤细胞都有一定的杀伤作用ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Myers</Author><Year>1977</Year><RecNum>33</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[11]</style></DisplayText><record><rec-number>33</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">33</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Myers,CharlesE</author><author>McGuire,WilliamP</author><author>Liss,RobertH</author><author>Ifrim,Ina</author><author>Grotzinger,Karen</author><author>Young,RobertC</author></authors></contributors><titles><title>Adriamycin:theroleoflipidperoxidationincardiactoxicityandtumorresponse</title><secondary-title>Science</secondary-title></titles><periodical><full-title>Science</full-title></periodical><pages>165-167</pages><volume>197</volume><number>4299</number><dates><year>1977</year></dates><isbn>0036-8075</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"Myers,1977#33"11]。研究表明，肿瘤化疗过程中长期使用阿霉素会导致肿瘤细胞对其产生耐药性，而且已经有很多阿霉素耐药细胞株构建成功的例子，所以本课题用阿霉素诱导乳腺癌细胞MCF-7，建立可靠的肿瘤细胞多药耐药性模型。本研究采用大剂量间歇诱导法与临床周期性化疗相似，更好地模拟临床上化疗后患者出现的耐药现象，它对肿瘤多药耐药性的研究更有意义。经过此方法成功诱导得到MCF-7/Adm耐药株，其耐药指数为324。其细胞形态较野生型MCF-7细胞发生明显变化，而且在培养过程中也发现耐药株生长也相对缓慢，胰酶消化时间也较野生型稍长。MTT结果提示两株细胞对ADM的敏感性存在着显著的差异（P<0.01）。0.02μg/mL的ADM已经对MCF-7细胞产生抑制作用，但ADM浓度增加为50倍即1μg/mL时，对MCF-7/Adm几乎没有抑制作用，提示MCF-7/Adm细胞对ADM产生了显著的耐药性。流式细胞术检测结果显示耐药株内阿霉素浓度明显降低，这进一步说明耐药细胞株构建成功。Real-timePCR结果显示耐药细胞内ABCB1基因表达上调，而ABCC1基因和ABCG2基因表达下调。初步推断其产生耐药性与ABCB1基因表达上调有关，ABCB1导致肿瘤多药耐药主要是将化疗药物由肿瘤细胞内泵至细胞外，降低细胞内药物浓度，从而导致MDR的产生ADDINEN.CITEADDINEN.CITE.DATA[HYPERLINK\o"Kapoor,2021#36"12]。至于另外两种耐药相关基因表达下调的原因尚不清楚，尚需进一步研究。考虑到肿瘤多药耐药的分子机制非常复杂，是基因突变、相关蛋白的表达、各种酶介导、干细胞靶点表达缺失等多因素，多步骤综合作用的结果ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Holohan</Author><Year>2021</Year><RecNum>101</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[13]</style></DisplayText><record><rec-number>101</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="edvwtsfwo9p5diefr5s5rrz8pxxevfrdwp2d">101</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Holohan,Caitriona</author><author>VanSchaeybroeck,Sandra</author><author>Longley,DanielB</author><author>Johnston,PatrickG</author></authors></contributors><titles><title>Cancerdrugresistance:anevolvingparadigm</title><secondary-title>NatureReviewsCancer</secondary-title></titles><periodical><full-title>NatureReviewsCancer</full-title></periodical><pages>714-726</pages><volume>13</volume><number>10</number><dates><year>2021</year></dates><isbn>1474-175X</isbn><urls></urls></record></Cite></EndNote>[HYPERLINK\o"Holohan,2021#101"13]，需进一步深入研究。总之，本研究成功建立了一种人乳腺癌耐阿霉素的细胞株MCF-7/Adm，为进一步研究乳腺癌多药耐药性的机制及耐药性逆转的药物提供有利工具，并且对抗乳腺癌化疗药物的筛选具有重要的意义。参考文献ADDINEN.REFLIST[1]黄哲宙,陈万青,吴春晓,等.中国女性乳腺癌的发病和死亡现况—全国32个肿瘤登记点2021—2021年资料分析报告[J].肿瘤,2021,32(6):435-439.[2]王希龙,邱文秀,贾中明,等.乳腺癌的诊断现状及最新进展[J].中国综合临床,2021,28(8):787-788.[3]LiuFS.Mechanismsofchemotherapeuticdrugresistanceincancertherapy--aquickreview[J].TaiwanJObstetGynecol,2021,48(3):239-244.[4]SchinkelAH,JonkerJW.Mammaliandrugeffluxtransportersoftheatpbindingcassette(abc)family:Anoverview[J].AdvancedDrugDeliveryReviews,2021,64(22):138-155.[5]ZhouY,LingXL,LiSW,elat.Establishmentofahumanhepatomamultidrugresistantcelllineinvitro[J].WorldJournalofGastroenterology,2021,16(18):2291-2297.[6]韩宜男,钱江.肿瘤干细胞及其耐药性机制研究[J].中国眼耳鼻喉科杂志,2021,12(2):123-125.[7]SaraswathyM,GongS.Differentstrategiestoovercomemultidrugresistanceincancer[J].BiotechnolAdv,2021,31(8):1873-1899.[8]WatsonMB,LindMJ,CawkwellL.Establishmentofin-vi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咖啡店创业计划书第一部分：背景在中国，人们越来越爱喝咖啡。随之而来的咖啡文化充满生活的每个时刻。无论在家里、还是在办公室或各种社交场合，人们都在品着咖啡。咖啡逐渐与时尚、现代生活联系在一齐。遍布各地的咖啡屋成为人们交谈、听音乐、休息的好地方，咖啡丰富着我们的生活，也缩短了你我之间的距离，咖啡逐渐发展为一种文化。随着咖啡这一有着悠久历史饮品的广为人知，咖啡正在被越来越多的中国人所理解。第二部分：项目介绍第三部分：创业优势目前大学校园的这片市场还是空白，竞争压力小。而且前期投资也不是很高，此刻国家鼓励大学生毕业后自主创业，有一系列的优惠政策以及贷款支持。再者大学生往往对未来充满期望，他们有着年轻的血液、蓬勃的朝气，以及初生牛犊不怕虎的精神，而这些都是一个创业者就应具备的素质。大学生在学校里学到了很多理论性的东西，有着较高层次的技术优势，现代大学生有创新精神，有对传统观念和传统行业挑战的信心和欲望，而这种创新精神也往往造就了大学生创业的动力源泉，成为成功创业的精神基础。大学生创业的最大好处在于能提高自己的潜力、增长经验，以及学以致用;最大的诱人之处是透过成功创业，能够实现自己的理想，证明自己的价值。第四部分：预算1、咖啡店店面费用咖啡店店面是租赁建筑物。与建筑物业主经过协商，以合同形式达成房屋租赁协议。协议资料包括房屋地址、面积、结构、使用年限、租赁费用、支付费用方法等。租赁的优点是投资少、回收期限短。预算10-15平米店面，启动费用大约在9-12万元。2、装修设计费用咖啡店的满座率、桌面的周转率以及气候、节日等因素对收益影响较大。咖啡馆的消费却相对较高，主要针对的也是学生人群，咖啡店布局、格调及采用何种材料和咖啡店效果图、平面图、施工图的设计费用，大约6000元左右3、装修、装饰费用具体费用包括以下几种。(1)外墙装饰费用。包括招牌、墙面、装饰费用。(2)店内装修费用。包括天花板、油漆、装饰费用，木工、等费用。(3)其他装修材料的费用。玻璃、地板、灯具、人工费用也应计算在内。整体预算按标准装修费用为360元/平米，装修费用共360*15=5400元。4、设备设施购买费用具体设备主要有以下种类。(1)沙发、桌、椅、货架。共计2250元(2)音响系统。共计450(3)吧台所用的烹饪设备、储存设备、洗涤设备、加工保温设备。共计600(4)产品制造使用所需的吧台、咖啡杯、冲茶器、各种小碟等。共计300净水机，采用美的品牌，这种净水器每一天能生产12l纯净水，每一天销售咖啡及其他饮料100至200杯，价格大约在人民币1200元上下。咖啡机，咖啡机选取的是电控半自动咖啡机，咖啡机的报价此刻就应在人民币350元左右，加上另外的附件也不会超过120