第三章微生物制药工艺技术基础课件

第一节菌种选育生物制药工艺学

第三章微生物制药技术工艺基础生物制药工艺学第三章微生物制药技术工艺基础1一、微生物的遗传和变异

遗传—保持物种的相对稳定性变异—促使新性状的产生、获得新的优良品种遗传型变异：在遗传物质水平上发生了改变，从而引起某些相应性状发生改变的特性

变异性表型变异：微生物在生活条件发生改变时，发生暂时的形态、生理等特性的改变，但随着环境条件的复原，它们又恢复了原有的特性一、微生物的遗传和变异遗传—保持物种的相对稳定性2（一）基因突变基因突变是指遗传物质（DNA或RNA）中的核苷酸顺序发生了稳定的可遗传的变化，主要包括点突变和染色体畸变两大类。1、点突变是由于DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变引起的。2、染色体畸变是指DNA大段变化（损伤）的现象，主要包括染色体结构上的变化和染色体数目的变化。（二）基因重组

指两个或多个不同性状个体的遗传基因转移到一个体细胞内，经重新组合后，造成菌种变异，形成新的遗传型个体。

（一）基因突变3二、菌种选育的经典方法

1、自然选育是一种纯种选育的方法。它利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离，筛选排除衰变型菌落，从中选择维持原有生产水平的菌株。特点：（1）能纯化、复壮菌种，稳定生产，提高平均生产水平。（2）难以选育高产突变菌株，不能使生产水平大幅度提高。二、菌种选育的经典方法1、自然选育42、诱变育种诱变育种是指人工有意识地将生物体暴露于物理的、化学的或生物的一种或多种诱变因子中，促使生物体发生突变，进而从突变体中筛选具有优良性状的突变株的过程。特点：与自然选育比较，由于引进了诱变剂处理，因而加速了菌种突变的频率，扩大了变异的幅度，从而提高了获得优良特性的突变株的几率。2、诱变育种5

物理诱变剂：紫外线、x射线、Y射线、快中子、β射线、超声波、激光诱变剂化学诱变剂：氮芥、乙烯亚胺、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、亚硝基甲基脲、亚硝酸生物诱变剂：噬菌体物理诱变剂：紫外线、x6三、现代菌种选育技术1、杂交育种：

指两个基因型不同的菌株通过接合使遗传物质重新组合，再从中分离，筛选出具有新性状的菌株。优点：能集中位于不同品种中的优良性状。缺点：只能利用已有的基因组，并不能产生新的基因。杂交进程缓慢，过程繁琐。三、现代菌种选育技术1、杂交育种：

指两个基因型不同的菌株72、原生质体融合

用脱壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体，再用融合剂（如聚乙二醇）促进原生质体发生融合，从而获得融合子，这一技术叫原生质体融合。

细胞（A+B—）

细胞（A—B+）

脱壁处理

脱壁处理

原生质体（A+B—）

原生质体（A—B+）

混合

加融合剂

原生质体融合

涂平板（原生质体再生）

形成菌落

检出重组子菌落（A+B+）

2、原生质体融合

用脱壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生83、基因工程（基因拼接技术或DNA重组技术）是指按照人的意志，将某一生物体(供体)的遗传信息在体外经人工与载体相接(重组)，构成重组DNA分子，然后转入另一生物体(受体)细胞中，使被引进的外源DNA片段在后者内部得以表达和遗传。研究和开发的趋势有：1.基因克隆产生杂合抗生素。（一旦取得了抗生素的结构基因，将基因片段送入特定性质的另一种抗生素产生菌中，即可能产生完全符合人们设计的新抗生素。）

2.基因重组获得新抗生素。

（通过两种基因型不同的菌株结合，使遗传物质重新组合，从中筛选具有新性状的菌株，其中可能有原抗生素高产株，也可能有产生新抗生素的子株。）3、基因工程（基因拼接技术或DNA重组技术）9第二节菌种保藏

定义：将有用的微生物以特定培养形态在特定的环境条件下存放，以保持种的存活、纯粹和遗传性状的稳定。条件及原理：1.

低营养2.

干燥3.隔氧4.低温降低代谢速率或使细胞处于休眠状态第二节菌种保藏定义：降低代谢速率或使细胞处于休眠状态10一、定期移植保藏法

（斜面低温保藏法）1．原理制造低温环境，降低菌种的新陈代谢活动能力。2、方法将菌种接种于所要求的培养基上、置最适温度下培养，待得到健壮的菌体后，放在4℃左右，湿度小于70％的条件下保藏．每间隔一定时间重新移植培养1次。一、定期移植保藏法（斜面低温保藏法）1．原理113、特点（1）此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏，一般可保存1～6个月左右。（2）优点：简便易行，容易推广，存活率高；缺点：菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。3、特点12二、石蜡油封藏法1、原理用液体石蜡防止或减少培养基内水分蒸发，隔绝培养物与氧的接触，降低微生物的代谢活动，推迟细胞老化，延长保存时间。2、方法在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。二、石蜡油封藏法1、原理133、特点（1）此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏，一般可保存1～2年左右。石蜡油管的转接和搬运不方便。（2）不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。3、特点14三、砂土管保藏法1、原理低温、干燥、隔氧和无营养物2、方法将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分装于小试管中，砂土的高度约1cm，121℃蒸汽灭菌1～1.5h，间歇灭菌3次。50℃烘干后经检查无误后备用。将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约2～4h，用火焰熔封管口（或用石蜡封口），置于干燥器中，在室温或4℃冰箱内保藏。三、砂土管保藏法1、原理153、特点（1）适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的细菌及酵母则不适用。（2）保藏期较长，约1～10年。效果较好，且微生物移接方便，经济简便。3、特点16四、麸皮保藏法1、原理以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然后在低温干燥条件下保存。2、方法将麸皮与水以一定的比例拌匀，装量为试管体积2/5，湿热灭菌后经冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔封，再保藏，则效果更好。四、麸皮保藏法1、原理173、特点（1）此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏期在1年以上。（2）操作简单、经济实惠，工厂较多采用。3、特点18五、冷冻真空干燥保藏法（冻干法）1、原理在较低的温度下（一15℃以下），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。经过冷冻干燥的微生物的生长和代谢活动处于极低水平，不易发生变异或死亡，因此菌种可以保存很长时间。2、方法将准备保存的新鲜斜面菌种，在无菌条件下，装入灭菌的保护剂（常用脱脂牛奶和血清），制成菌悬液，再用无菌带橡皮头的滴管将菌悬液分装到准备好的安瓿管中，-35℃下预冻15min一2h，然后进行真空于燥，最后将安瓿管真空熔封，低温避光保存。五、冷冻真空干燥保藏法（冻干法）1、原理193、特点（1）此法适用于各大类微生物。（2）此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有保护剂，保藏期一般长达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。（3）该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。3、特点20六、液氮超低温保藏法1、原理微生物在－130℃的低温下，所有的代谢活动暂时停止而生命延续，微生物菌种得以长期保存。可通过加入保护剂来降低细胞内溶液的冰点，减少冰晶对细胞的伤害。

2、方法取合适的培养物，以5～10％的甘油或二甲亚砜制成孢子悬液或菌悬液。将此悬液注入无菌的安瓿管或聚丙烯小管内，密封，在液氮超低温（－196℃）下保藏。六、液氮超低温保藏法1、原理213、特点（1）适用于各种微生物菌种的保藏。（2）保藏期一般可达到15年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。（3）优点：操作简便、高效，且可使用各种培养形式的微生物进行保藏。缺点：需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。3、特点22第三节

培养基第三节

培养基23一、培养基组成与成分人工配制的适合于不同微生物生长、繁殖和积累代谢产物的营养基质。碳源、氮源、无机盐、微量元素、水、生长因素、前体、诱导剂或刺激剂、抑制剂例：高氏培养基（培养放线菌）：

可溶性淀粉2克，硝酸钾0.1克，磷酸氢二钾0.05克，氯化钠0.05克，硫酸镁0.05克，硫酸亚铁0.001克，琼脂2克，水100毫升。一、培养基组成与成分24（一）碳源：提供微生物生长繁殖所需的能源，构成细胞和抗生素的碳骨架。1．碳水化合物：单糖，多糖，多聚糖（蔗糖、乳糖、淀粉、糊精等）2．脂肪：油（脂肪）水解脂肪酶

甘油（脂肪酸）溶解氧C02+H20

（一）碳源：提供微生物生长繁殖所需的能源，构成细胞和抗生素的253．有机酸有机酸或它们的盐也能作为微生物的碳源。注意！有机酸的利用常会使pH上升。CH3COONa+O2→2CO2+H2O+NaOH3．有机酸26（二）氮源：主要用于构成菌体细胞物质，如氨基酸、蛋白质、核酸等和含氮的目的产物如青霉素、链霉素等抗生素。1、无机氮源（快速利用N源）：铵盐（如氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵），硝酸盐（如硝酸钠、硝酸钾）和氨水等。特点：（1）分解快，能被微生物迅速利用；（2）引起pH变化。(NH4)2S04→2NH3+H2S04生理酸性物质NaNO3+4H2→NH3+2H20+NaOH生理碱性物质（二）氮源：主要用于构成菌体细胞物质，如氨基酸、蛋白质、核272、有机氮源（慢速利用氮源）：花生饼粉，黄豆饼粉，玉米浆，玉米蛋白粉，蛋白胨，酵母膏。在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌体吸收后再进一步分解代谢．最终用于合成菌体细胞物质和含氮的目的产物。2、有机氮源（慢速利用氮源）：花生饼粉，黄豆饼粉，玉米浆，28（三）无机盐、微量元素：

微生物在生长繁殖和合成目的产物的过程中，需要某些无机盐和微量元素作为其生理活性物质的组成或代谢的调节物。P、S（可构成细胞物质）Mg、Fe（可作为酶的组成成分或维持酶活性）K、Na（调节细胞渗透压）Cu、Zn、Mn（作为酶的辅基和激活剂）（三）无机盐、微量元素：微生物在生长繁殖和合成目的产物的29（四）水：

（1）构成生物体的成分；（2）培养基的组成部分；（3）参与代谢反应；（4）作为代谢反应介质；（5）作为物质传递介质；（6）良好的热导体。（四）水：（1）构成生物体的成分；30（五）生长因素：生长因素：有些微生物即使在具有合适的水分、碳源、氮源、无机盐等的条件下，还不能生长或生长不好，但如果加入少量微生物生长所必需的有机物质，则生长良好。通常把这些特殊的营养物质称为生长因素。

1．维生素：是辅酶的组成成分；2．氨基酸：有些生物不能合成某种氨基酸；3．嘌呤和嘧啶：构成核酸和辅酶。（五）生长因素：生长因素：有些微生物即使在具有合适的水分31（六）前体

在微生物合成抗生素过程中，有些化合物能被微生物直接利用来构成抗生素分子结构的一部分，而化合物本身的结构设没有大的变化，这些物质称为抗生素的前体。（六）前体在微生物合成抗生素过程中，有些化合物能被微生物32（七）诱导物或刺激剂：

所谓诱导物是指一些具有调节抗生素生物合成能力的小分子物质。如：β－吲哚乙酸是金霉素生物合成的刺激物；甲硫氨酸和亮氨酸是头孢菌素的刺激剂。（七）诱导物或刺激剂：所谓诱导物是指一些具有调节抗生素生33（八）抑制剂：在次级代谢产物发酵生产过程中，往往抑制某一代谢途径，就会使另一代谢途径活跃。如加入二乙基巴比妥盐可抑制利福霉素B以外其他利福霉素的生成，从而增加利福霉素B的含量和产量。（八）抑制剂：在次级代谢产物发酵生产过程中，往往抑制某一34二、培养基的种类

（一）按来源分类：1、合成培养基（1）所用原料的化学成分明确、稳定；（2）实验重现性好、低泡；（3）适用于研究菌种基本代谢和过程的物质变化；（4）营养单一，价格昂贵，不适用于大规模工业生产。二、培养基的种类（一）按来源分类：352、天然培养基（天然的动植物产品）（1）营养丰富，适合于微生物的生长繁殖和目的产物的合成。（2）组成培养基的原料来源丰富，价格低廉，适用于工业生产。（3）组分复杂，不易重复，若对原料质量等方面不加控制会严重影响生产的稳定性。2、天然培养基（天然的动植物产品）36（二）按状态分类：

固体培养基：适用于菌种的分离和保存；半固体培养基：（琼脂用量为0.5～0.8％）主要用于鉴定菌种、观察细菌运动特征及噬菌体的效价测定等；液体培养基：（水80％～90％），是发酵工业大规模使用的培养基，它有利于氧和物质的传递。

（二）按状态分类：固体培养基：适37（三）按用途分类：

1．孢子培养基供菌种繁殖孢子的固体培养基。能使菌体迅速生长，产生较多优质孢子并不易引起菌种发生变异。例如：高氏培养基（三）按用途分类：1．孢子培养基382．种子培养基指一、二级种子罐的培养基和摇瓶培养基。主要含有容易被利用的碳源、氮源、无机盐等，使孢子很快发芽、生长以及大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮和使各种有关的初级代谢酶的活力提高。赤霉素产生菌种子培养基：葡萄糖1.5%,糊精1.0%,花生粉1.5%,MgSO4·7H2O0.1%,KH2PO40.1%,消泡剂0.2%2．种子培养基393．发酵培养基发酵培养基可供菌种生长、繁殖和合成产物。发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。玉米淀粉7.0％，饴糖2.5％，豆饼粉0.3％，花生粉1.0％，MgSO4·7H2O0.07％，KH2PO40.14％，消沫剂0.05％，α-淀粉酶0.05％3．发酵培养基40三、影响培养基质量的因素

（一）原材料质量的影响：玉米浆、黄豆粉、花生饼粉、蛋白胨、淀粉、糊精品种、产地、加工方法、储藏条件

三、影响培养基质量的因素（一）原材料质量的影响：41（二）水质的影响地质（地区）（地貌）、季节、处理方法（漂白粉、沉淀剂、消毒剂）和环境水源质量的主要考虑参数包括pH、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。

（二）水质的影响42（三）灭菌操作灭菌操作不当不仅会减少培养基中有效的营养成分，还会产生一些有毒物质，给发酵带来不利的影响。蛋白质在高温下变性，维生素在高温下失活葡萄糖与含氨基的物质反应形成5-羟甲基糖醛和棕色的类黑精（焦化），对微生物有一定的毒性（三）灭菌操作43（四）培养基粘度的影响粘度是培养基物性的重要指标之一，它直接影响氧的传递、营养成分、无机盐、生长因子等的扩散，从而影响细胞的呼吸、营养成分的吸收，最终导致影响目标产物的形成。“稀配方”：（1）中间补料；（2）精料发酵、基础原料液体化；（3）补加无菌水（四）培养基粘度的影响粘度是培养基物性的重要指标之一，它直44第四节

灭菌及染菌防治

染菌对抗生素生产过程的危害：（1）消耗培养基的营养成分；（2）使培养条件如溶氧、粘度发生变化；（3）有的杂菌会分泌一些对抗生素产生菌有毒或能使抗生素降解失活的物质，从而造成抗生素产量大幅度下降；（4）影响后道工序的正常生产、影响产品外观及内在质量；（5）如果污染了噬菌体，不仅引起产生菌自溶，而且还会迅速大面积蔓延，严重威胁抗生素的生产。第四节

灭菌及染菌防治染菌对抗生素生产过程的危害：45一、灭菌的理论和技术灭菌是指用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备中所有生命物质的技术或工艺过程。（一）物理灭菌射线灭菌热灭菌（湿热和干热）过滤除菌一、灭菌的理论和技术灭菌是指用化学或物理的方法杀灭或去除物46射线灭菌1、方法：通常用紫外线、高能量的电磁波或粒子辐射灭菌。其中以紫外线最常用。2、原理：紫外线的作用光谱与细菌体内核酸的吸收光谱相一致，DNA链上核苷酸的碱基因此具有强烈的吸收紫外线的能力，引起DNA结构形式的变化而导致死亡。3、特点：紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，但其穿透力极低，只能用于表面灭菌。对真菌孢子的杀灭能力不大。主要用来进行一定空间内空气的灭菌（如无菌室等）。射线灭菌47干热灭菌

1、方法：包括火焰灭菌和热空气灭菌，常用的干热空气灭菌是利用电热或者红外线在一定设备内对各种用具物品进行杀菌。生产上常用的干热灭菌的条件是160℃，时间1－2h。2、原理：高温时微生物各种与温度有关的氧化过程速率增快。3、特点：时间长、耗热量大，应用不广。一般用于灭菌后要求保持干燥状态的物料。干热灭菌48湿热灭菌1、方法：直接用加压湿蒸汽进行物料或设备容器的灭菌。用蒸汽将物料升温到115－140℃保持一定时间，可杀死各种微生物。常用的灭菌条件是120℃，20－30min。2、原理：在高温及有水分存在的条件下，微生物细胞中的蛋白质极易凝固而引起微生物的死亡。3、特点：经济，快速，适用于大量培养基及发酵设备的灭菌。湿热灭菌49介质过滤除菌对培养液中某此不耐热的成分可采用过滤除菌法。发酵过程中所用的大量无菌空气也是用过滤除菌法。介质过滤除菌50（二）化学灭菌

1、定义：化学药剂灭菌是通过药剂与微生物细胞接触而发生诸如蛋白质变性等作用而达到杀灭微生物的目的。2、灭菌用化学药剂必须具备以下四个条件：（1）杀菌谱广。有效浓度低且杀灭微生物的速度快。（2）性质稳定，易溶于水且可在常温下使用。（3）基本上不受有机物、酸、碱和其他物理化学因素的影响。（4）无腐蚀性，无毒或低毒，使用安全。（二）化学灭菌

1、定义：化学药剂灭菌是通过药剂与微生物细胞513、常用的化学药剂：乙醇、甲醛、苯扎溴铵（新洁尔灭）、戊二醛、环氧乙烷、漂白粉和苯酚（石炭酸）等。4、用途：化学灭菌主要用来进行皮肤表面、器具及无菌区域的灭菌，很少用于培养基的灭菌。3、常用的化学药剂：乙醇、甲醛、苯扎溴铵（新洁尔灭）、戊二醛52二、培养基及有关设备的灭菌

（一）实罐灭菌（分批灭菌）

分批灭菌是将配制好的培养基投入发酵罐中，经过间接蒸汽预热后，直接通入饱和蒸汽使培养基和设备一起灭菌。流程：培养基预热培养基灭菌冷却二、培养基及有关设备的灭菌（一）实罐灭菌（分批灭菌）53第三章微生物制药工艺技术基础课件54注意事项：1．培养基预热：80～90℃。避免产生冷凝水造成培养基稀释。2．培养基灭菌：120～130℃，保温30min。各路蒸汽进口要畅通，防止逆流，罐内液体翻动要剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度。排汽量不宜过大，以节约蒸汽用量。3．冷却：灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却水冷却，避免罐压迅速下降，产生负压而抽吸外界空气。注意事项：55（二）空罐灭菌空罐灭菌即发酵罐罐体的灭菌。空罐灭菌一般维持罐压1.5×105～2.0×105Pa，罐温125～130℃，30～45min，直接蒸汽法。灭菌后为避免罐压急速下降造成负压，要等到经过灭菌的无菌培养基输入罐内后，才可以开冷却水冷却。（二）空罐灭菌空罐灭菌即发酵罐罐体的灭菌。56（三）连续灭菌培养基通过连续灭菌装置，进行快速这续加热灭菌，并快速冷却，再立即输入预先经过空罐灭菌后的发酵罐中。流程：培养基预热连续灭菌维持灭菌温度冷却（三）连续灭菌培养基通过连续灭菌装置，进行快速这续加热灭菌57第三章微生物制药工艺技术基础课件58注意事项：1．培养基预热：60一75℃，避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。2．连续灭菌：连续灭菌的温度一般以126一132℃为宜。3．维持灭菌温度：利用维持罐使料液在灭菌温度下保持5—7min，以达到灭菌的目的。4．冷却：采用冷水喷淋时，喷淋前冷却管内应充满填料。注意事项：59特点：（1）连续灭菌的时间短、温度较高。培养基受到的破坏较少，故质量较好。连续灭菌时蒸汽负荷均衡一致。（2）不足之处是所需设备较多，操作较麻烦，染菌的机会也相应增多。特点：60（四）发酵附属设备及管路的灭菌

发酵附属设备有总空气过滤器、管道、计量罐、补料罐等。（四）发酵附属设备及管路的灭菌

发酵附属设备有总空气过滤器、61三、空气过滤除菌（一）介质除菌的机制

1．沉降作用2．截留作用3．惯性碰撞4．扩散现象5．静电吸附三、空气过滤除菌（一）介质除菌的机制62（二）空气过滤介质1、要求：能耐高温、高压，不易被油水污染。且成本低、易更换。2、常用的空气过滤介质：棉花、活性炭、玻璃棉、超细玻璃纤维纸、石棉滤板等。3、新型过滤介质：膜过滤器。（二）空气过滤介质1、要求：能耐高温、高压，不易被油水污染。63（三）空气过滤除菌的工艺过程

主要目的：1、提高压缩前空气的质量去除压缩空气中所带的油和水3、获得无菌空气（三）空气过滤除菌的工艺过程

主要目的：64第三章微生物制药工艺技术基础课件65第五节

发酵过程控制一、发酵过程的主要控制参数与代谢变化物理参数：1．温度（℃）发酵整个过程或不同阶段中所维持的温度。酶反应速率、氧在培养液中的溶解度与传递速率、菌体生长速率和产物合成速率2．压力（Pa）发酵过程中发酵罐维持的压力,一般维持在0.2×105~0.5×105Pa。保证纯种的培养,间接影响菌体代谢。第五节

发酵过程控制一、发酵过程的主要控制参数与代谢变化663．搅拌转速（r／min）搅拌转速是指搅拌器在发酵过程中的转动速度，通常以每1min的转数来表示。它的大小与氧在发酵液中的传递速率与发酵液的均匀性有关。4．搅拌功率（kw）指搅拌器搅拌时所消耗的功率，常指每1m3发酵液所消耗的功率（kw／m3）。它的大小与氧容量传递系数有关。3．搅拌转速（r／min）675．空气流量［V／（V·min），简称VVM］每1min内每单性体积发酵液通入空气的体积，也是需氧发酵的控制参数。与氧的传递和其他控制参数有关。一般控制在0.5～1.0V／（V·min）范围内。6．粘度（Pa·s）粘度大小可以作为细胞生长或细胞形态的一项标志，也能反映发酵罐中菌丝分裂过程的情况。通常用表观粘度表示之：它的大小可改变氧传递的阻力，又可表示相对菌体浓度。5．空气流量［V／（V·min），简称VVM］687．浊度（％）浊度是能及时反映单细胞生长状况的参数，对某些产品的生产是极其重要的参数。8.料液流量（L／min）这是控制流体进料的参数。7．浊度（％）69化学参数：1．pH（酸碱度）发酵液的pH是发酵过程中各种产酸和产碱的生化反应的综合结果。它是发酵工艺控制的重要参数之一。它的高低与菌体生长和产物合成有着重要的关系。化学参数：1．pH（酸碱度）702．基质浓度（g或mg％）这是发酵液中糖、氮、磷等重要营养物质的浓度。它们的变化对产生菌的生长和产物的合成有着重要的影响，也是提高代谢产物产量的重要控制手段。在发酵过程中，必须定时测定糖（还原糖和总糖）、氮（氨基氮或氨氮）等基质的浓度。2．基质浓度（g或mg％）713．溶解氧浓度［10-6（ppm）或饱和度（％）］溶解氧是需氧菌发酵的必备条件。利用溶氧浓度的变化，可了解产生菌对氧利用的规律，反映发酵的异常情况，也可作为发醉中间控制的参数及设备供氧能力的指标。溶氧浓度一般用绝对含量（10-6）来表示、有时也用在相同条件下，氧在培养液中饱和浓度表示。3．溶解氧浓度［10-6（ppm）或饱和度（％）］724．产物的浓度[μg（u）／ml]这是发酵产物产量高低或合成代谢正常与否的重要参数，也是决定发酵周期长短的根据。5．废气中的氧浓度（Pa）废气中的氧含量与产生菌的摄氧率和供氧系数有关。从废气中的O2的含量可以算出产生菌的摄氧率和发酵罐的供氧能力。4．产物的浓度[μg（u）／ml]736．废气中的CO2浓度（％）废气中的CO2就是产生菌呼吸放出的CO2。测定它可以算出产生菌的呼吸熵，从而了解产生菌的呼吸代谢规律。其他化学参数：DNA、RNA、生物合成的关键酶等。6．废气中的CO2浓度（％）74生物参数：1．菌丝形态丝状菌发酵过程中菌丝形态的改变是生化代谢变化的反映。一般都以菌丝形态作为衡量种子质量、区分发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化和决定发酵周期的依据之一。生物参数：1．菌丝形态752．菌体浓度菌体浓度简称菌浓，是控制微生物发酵的重要参数之一。大小和变化速度对菌体的生化反应都有影响（表观粘度、溶氧浓度）。在生产上，常常根据菌体浓度来决定适合的补料量和供氧量，以保证生产达到顶期的水平。2．菌体浓度76（发酵液的菌体量和单位时间的菌浓、溶氧浓度、糖浓度、氮浓度和产物浓度等的变化值）计算

（菌体的比生长速率、氧比消耗速率、糖比消耗速率、氮比消耗速率和产物比生产速率）（控制产生菌的代谢、决定补料和供氧工艺条件）

研究发酵动力学（发酵液的菌体量和单位时间的菌浓、溶氧浓度、糖浓度、氮浓度和77发酵过程中的代谢变化1．菌体生长阶段（菌体生长期或发酵前期）碳源、氮源进行分解代谢：碳源、氮源和磷酸盐等营养物质不断被消耗，浓度明显减少。菌体进行合成代谢：菌浓明显增加、摄氧率不断增大，溶氧浓度不断下降。发酵过程中的代谢变化1．菌体生长阶段（菌体生长期或发酵前期782．产物合成阶段（产物分泌期或发酵中期）这个阶段主要是合成抗生素。以碳源和氮源的分解代谢和产物的合成代谢为主，尚有合成菌体细胞物质的代谢存在，但不是主要的。由于存在抗生素合成和菌体合成两条代谢途径，外界环境的变化很容易影响这个阶段的代谢，破源、氮源和磷酸盐等营养物质的浓度必须控制在一定的范围内，发酵条件也要严格控制，才能促使产物不断地被合成。2．产物合成阶段（产物分泌期或发酵中期）793．菌体自溶阶段（菌体自溶期或发酵后期）

菌体衰老，细胞开始自溶，氨氮含量增加，pH上升，产物合成能力衰退，生产速率下降。发酵到此期必须结束。3．菌体自溶阶段（菌体自溶期或发酵后期）80二、温度的影响与控制（一）温度对发酵的影响：1、影响各种酶反应的速率和蛋白质的性质。（1）在一定范围内，随着温度的升高，酶反应速率也增加，但有一个最适温度，超过这个温度，酶的催化活力就下降。温度对菌体生长的酶反应和代谢产物合成的酶反应的影响不同。如产黄青霉菌体的最适生长温度为30℃，青霉素合成的最适温度为24.7℃。二、温度的影响与控制（一）温度对发酵的影响：81（2）温度还能改变菌种代谢产物的合成方向，影响多组分次级代谢产物的组分比例。如在高浓度Cl-和低浓度Cl-的培养基中利用金霉素链霉菌NRRLB-1287进行四环素发酵，30℃以下时合成的金霉素增多，达35℃时就只产四环素，而金霉素合成几乎停止。

如黄曲霉产生的多组分黄曲霉毒素，在20℃、25℃和30℃发酵所产生的黄曲霉毒素G1与B1比例分别为3：1、1：2和1：1。（2）温度还能改变菌种代谢产物的合成方向，影响多组分次级代谢822、影响发酵液的物理性质。发酵液的粘度、基质和氧在发酵液中的溶解度和传递速率、某些基质的分解和吸收速率等。2、影响发酵液的物理性质。83（二）影响发酵温度变化的因素：产热的因素：生物热（Q生物）和搅拌热（Q搅拌）；散热的因素：蒸发热（Q蒸发）、辐射热（Q辐射）和显热（Q显）。发酵热：Q发酵[kJ／（m3．h）]Q发酵＝Q生物＋Q搅拌－Q蒸发－Q辐射－Q显。（二）影响发酵温度变化的因素：产热的因素：生物热（Q生物）和841．生物热（Q生物）：产生菌在生长繁殖过程中产生的热能。生物热的大小，随菌种和培养基成分不同而变化。生物热的大小还随培养时间不同而不同。1．生物热（Q生物）：产生菌在生长繁殖过程中产生的热能。852．搅拌热（Q搅拌）：搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间的摩擦所产生的热量。3．蒸发热（Q蒸发）：空气进入发酵罐与发酵液广泛接触后，引起水分蒸发所需的热能。4．辐射热（Q辐射）：由于罐外壁和大气间的温度差异而使发酵液中的部分热能通过罐体向大气辐射的热量。

2．搅拌热（Q搅拌）：搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之86（三）温度的控制：1．最适温度的选择最适发酵温度是既适合菌体的生长、又适合代谢产物合成的温度。最适生长温度与最适生产温度往往是不一致的。最适发酵温度还随菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段而改变。理论上，整个发醉过程中不应只选一个培养温度，而应该根据发酵的不同阶段，选择不同的培养温度。（三）温度的控制：1．最适温度的选择87

2.温度的控制夹套冷却蛇管2.温度的控制88三、pH的影响与控制

（一）发酵pH的影响在发酵过程中，pH变化决定于所用菌种的特性、培养基配比和发酵条件。pH的变化会引起各种酶活力的改变，影响菌对基质的代谢速度，甚至改变菌的代谢途径及细胞结构。三、pH的影响与控制（一）发酵pH的影响89（二）发酵过程pH的控制

（二）发酵过程pH的控制

901、根据菌种特性和培养基性质，选择适当的培养基成分和配比，有些成分可在中间补料时补充调节。例如，在青霉素发酵中，根据产生菌的代谢需要用改变加糖率来控制pH，比固定加糖率而以酸或碱来调节pH可增产青霉素25％。1、根据菌种特性和培养基性质，选择适当的培养基成分和配比，有912、加入适量的缓冲剂，以控制培养基pH的变化。常用的缓冲剂有碳酸钙、磷酸盐等。其中碳酸钙使用最普遍。其中和反应为：2、加入适量的缓冲剂，以控制培养基pH的变化。923、在发酵过程出现pH过高或过低的情况时，可以直接加入酸或碱类物质加以调节。无机酸碱调节pH最方便、省事，但也是最无奈的办法。生理酸碱性物质调节pH最困难，不易把握，但只要对症，效果最佳。3、在发酵过程出现pH过高或过低的情况时，可以直接加入酸或碱93四、溶氧浓度的变化和控制

（一）发酵过程中溶氧浓度变化规律四、溶氧浓度的变化和控制（一）发酵过程中溶氧浓度变化规律94（二）发酵异常时溶氧变化造成异常变化的原因：耗氧或供氧出现了异常因素或发生了障碍。

（1）污染好气性杂菌。（2）染噬菌体。（3）呼吸减弱，菌丝自溶。（4）菌体代谢发生异常现象。（5）某些设备或工艺控制发生故障或变化。（二）发酵异常时溶氧变化95（三）溶氧浓度的控制供氧方面，主要是设法提高氧传递的推动力和设备的通气效率，如调节搅拌转速或通气速率来控制供氧。需氧方面，控制补料速度（最适菌浓）。调节温度、液化培养基、中间补水、添加表面活性剂（三）溶氧浓度的控制供氧方面，主要是设法提高氧传递的推动力和96五、泡沫的影响与控制（一）泡沫的性质及对发酵的影响泡沫的性质：发酵液液面上的泡沫，气相所占的比例特别大，与液体有较明显的界限，如发酵前期的泡沫；发酵液中的泡沫，又称流态泡沫，分散在发酵液中，比较稳定，与液体之间无明显的界限。五、泡沫的影响与控制（一）泡沫的性质及对发酵的影响97泡沫对发酵的影响：起泡：发酵罐的装料系数减小，氧传递系数减小等。泡沫过多：造成大量逃液，发酵液从排气管路或轴封逃出而增加染菌机会等。严重时：通气搅拌也无法进行，菌体呼吸受到阻碍，导致代谢异常或菌体自溶。泡沫对发酵的影响：98（二）影响泡沫消长的因素1、与通气搅拌的剧烈程度，特别是高速的搅拌及大空气流量有关2、与培养基配比及原材料组成有关3、与菌种、种子质量、菌丝阶段和接种量有关（二）影响泡沫消长的因素1、与通气搅拌的剧烈程度，特别是高速99（三）泡沫的消除机械消沫靠机械引起的强烈振动或压力的变化促使气泡破裂。

罐内消沫法：在搅拌轴上方装消沫桨，通过消沫桨转动打碎泡沫。罐外消沫法：将泡沫引出罐外，通过喷嘴的加速作用或利用离心力来消除泡沫。优点：不需加入外界物料，可节省原料，减少污染杂菌的机会。缺点：消沫效果不理想，仅可作为辅助的消沫方法。（三）泡沫的消除机械消沫100消沫剂消沫（化学消沫）消沫机理：（1）当泡沫的表层存在着极性的表面活性物质而形成双电层时，加入另一种具有相反电荷的表面活性剂，以降低其机械强度，进而促使泡沫破裂。（2）当泡沫的液膜具有较大的表面粘度时，可加入某些分子内聚力较小的物质，以降低液膜的表面粘度，从而促使液膜的液体流失而使泡沫破裂。消沫剂消沫（化学消沫）101理想的消沫剂，应具备下列条件：（1）必须是表面活性物质，且具有较低的表面张力。（2）在气—液界面上具有足够大的铺展系数，才能迅速发挥消泡作用。（一定的亲水性）（3）在水中溶解度极小，以保持其具有持久的消泡或抑泡性能。（4）无毒、能耐高温灭菌、对设备无腐蚀性、不干扰其他参数的测定、不妨碍氧的传递、对发酵、提炼及抗生素的质量和产量无影响。（5）成本低、来源广。理想的消沫剂，应具备下列条件：102常用的消沫剂，主要有天然油脂类，高碳醇、脂肪酸和酯类，聚醚类，硅酮类4大类。（1）天然油脂类：玉米油、米糠油、豆油、松子油、菜子油、鱼油、猪油等。优点：来源比较丰富，价格比较低廉，在发酵中不仅用于消沫，还可以作为供产生菌利用的碳源和中间控制的手段。缺点：分子中无亲水基，在发泡介质中难铺展，消泡活性差。并且油的成本和折粮单耗都比较高且用量大，已逐渐被合成消沫剂取代。常用的消沫剂，主要有天然油脂类，高碳醇、脂肪酸和酯类，聚醚类103（2）高碳醇和酯类：十八醇、聚乙二醇、苯乙酸酯类（苯乙酸乙酯、苯乙酸丁酯、苯乙酸月桂醇酯）、苯乙醇、苯乙醇油酸酯等。多适用于丝状真菌发酵。（2）高碳醇和酯类：十八醇、聚乙二醇、苯乙酸酯类（苯乙酸乙酯104（3）聚醚类。

优点：性能稳定、使用简便、易控制、用量少、成本低。（3）聚醚类。105聚氧丙烯甘油：亲水性差，在发沫介质中溶解度小。抑泡性能优于消泡性能。适用于稀薄发酵液，添加于培养基中。聚氧乙烯氧丙烯甘油：亲水性好，在发沫介质中易铺展，消沫能力强。相应的溶解度大，消沫活性持续时间短。适用于粘稠发酵液的消沫。聚氧丙烯甘油：亲水性差，在发沫介质中溶解度小。抑泡性能优于消106（4）硅酮类：聚二甲基硅氧烷及其衍生物。适用于微碱性细菌发酵。（4）硅酮类：聚二甲基硅氧烷及其衍生物。107消沫剂消沫优缺点：优点：效果好，较机械消沫作用迅速，尤其是化学合成消沫剂用量少。缺点：消沫剂使用不当时对菌的生长代谢有干扰；发酵过程中经常添加消沫剂增加原材料单耗；设备不严密时增加染菌机会；残留的消沫剂可能造成提炼上的麻烦。消沫剂消沫优缺点：108消沫剂的增效：（1）加载体增效，即用情性载体（如矿物油、植物油等）将消沫剂溶解分散，达到增效的目的。（2）消沫剂的并用增效，取各个消沫剂的优点进行互补，达到增效。（3）乳化消沫剂增效。消沫剂的增效：109（四）泡沫控制

1、减少泡沫形成的机会。调整培养基中的成分；改变某些物理化学参数；改变发酵工艺。2、消除已形成的泡沫。机械消沫；消沫剂消沫。（四）泡沫控制

1、减少泡沫形成的机会。110第一节菌种选育生物制药工艺学

第三章微生物制药技术工艺基础生物制药工艺学第三章微生物制药技术工艺基础111一、微生物的遗传和变异

遗传—保持物种的相对稳定性变异—促使新性状的产生、获得新的优良品种遗传型变异：在遗传物质水平上发生了改变，从而引起某些相应性状发生改变的特性

变异性表型变异：微生物在生活条件发生改变时，发生暂时的形态、生理等特性的改变，但随着环境条件的复原，它们又恢复了原有的特性一、微生物的遗传和变异遗传—保持物种的相对稳定性112（一）基因突变基因突变是指遗传物质（DNA或RNA）中的核苷酸顺序发生了稳定的可遗传的变化，主要包括点突变和染色体畸变两大类。1、点突变是由于DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变引起的。2、染色体畸变是指DNA大段变化（损伤）的现象，主要包括染色体结构上的变化和染色体数目的变化。（二）基因重组

指两个或多个不同性状个体的遗传基因转移到一个体细胞内，经重新组合后，造成菌种变异，形成新的遗传型个体。

（一）基因突变113二、菌种选育的经典方法

1、自然选育是一种纯种选育的方法。它利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离，筛选排除衰变型菌落，从中选择维持原有生产水平的菌株。特点：（1）能纯化、复壮菌种，稳定生产，提高平均生产水平。（2）难以选育高产突变菌株，不能使生产水平大幅度提高。二、菌种选育的经典方法1、自然选育1142、诱变育种诱变育种是指人工有意识地将生物体暴露于物理的、化学的或生物的一种或多种诱变因子中，促使生物体发生突变，进而从突变体中筛选具有优良性状的突变株的过程。特点：与自然选育比较，由于引进了诱变剂处理，因而加速了菌种突变的频率，扩大了变异的幅度，从而提高了获得优良特性的突变株的几率。2、诱变育种115

物理诱变剂：紫外线、x射线、Y射线、快中子、β射线、超声波、激光诱变剂化学诱变剂：氮芥、乙烯亚胺、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝基胍、亚硝基甲基脲、亚硝酸生物诱变剂：噬菌体物理诱变剂：紫外线、x116三、现代菌种选育技术1、杂交育种：

指两个基因型不同的菌株通过接合使遗传物质重新组合，再从中分离，筛选出具有新性状的菌株。优点：能集中位于不同品种中的优良性状。缺点：只能利用已有的基因组，并不能产生新的基因。杂交进程缓慢，过程繁琐。三、现代菌种选育技术1、杂交育种：

指两个基因型不同的菌株1172、原生质体融合

用脱壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体，再用融合剂（如聚乙二醇）促进原生质体发生融合，从而获得融合子，这一技术叫原生质体融合。

细胞（A+B—）

细胞（A—B+）

脱壁处理

脱壁处理

原生质体（A+B—）

原生质体（A—B+）

混合

加融合剂

原生质体融合

涂平板（原生质体再生）

形成菌落

检出重组子菌落（A+B+）

2、原生质体融合

用脱壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生1183、基因工程（基因拼接技术或DNA重组技术）是指按照人的意志，将某一生物体(供体)的遗传信息在体外经人工与载体相接(重组)，构成重组DNA分子，然后转入另一生物体(受体)细胞中，使被引进的外源DNA片段在后者内部得以表达和遗传。研究和开发的趋势有：1.基因克隆产生杂合抗生素。（一旦取得了抗生素的结构基因，将基因片段送入特定性质的另一种抗生素产生菌中，即可能产生完全符合人们设计的新抗生素。）

2.基因重组获得新抗生素。

（通过两种基因型不同的菌株结合，使遗传物质重新组合，从中筛选具有新性状的菌株，其中可能有原抗生素高产株，也可能有产生新抗生素的子株。）3、基因工程（基因拼接技术或DNA重组技术）119第二节菌种保藏

定义：将有用的微生物以特定培养形态在特定的环境条件下存放，以保持种的存活、纯粹和遗传性状的稳定。条件及原理：1.

低营养2.

干燥3.隔氧4.低温降低代谢速率或使细胞处于休眠状态第二节菌种保藏定义：降低代谢速率或使细胞处于休眠状态120一、定期移植保藏法

（斜面低温保藏法）1．原理制造低温环境，降低菌种的新陈代谢活动能力。2、方法将菌种接种于所要求的培养基上、置最适温度下培养，待得到健壮的菌体后，放在4℃左右，湿度小于70％的条件下保藏．每间隔一定时间重新移植培养1次。一、定期移植保藏法（斜面低温保藏法）1．原理1213、特点（1）此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏，一般可保存1～6个月左右。（2）优点：简便易行，容易推广，存活率高；缺点：菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。3、特点122二、石蜡油封藏法1、原理用液体石蜡防止或减少培养基内水分蒸发，隔绝培养物与氧的接触，降低微生物的代谢活动，推迟细胞老化，延长保存时间。2、方法在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面上，石蜡油层高出斜面顶端1cm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。二、石蜡油封藏法1、原理1233、特点（1）此法广泛适用于各大类微生物菌种的中期保藏，一般可保存1～2年左右。石蜡油管的转接和搬运不方便。（2）不适用于保藏某些能分解烃类的菌种。3、特点124三、砂土管保藏法1、原理低温、干燥、隔氧和无营养物2、方法将砂与土分别洗净、烘干、过筛，按一定比例分装于小试管中，砂土的高度约1cm，121℃蒸汽灭菌1～1.5h，间歇灭菌3次。50℃烘干后经检查无误后备用。将待保藏的菌株制成菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约2～4h，用火焰熔封管口（或用石蜡封口），置于干燥器中，在室温或4℃冰箱内保藏。三、砂土管保藏法1、原理1253、特点（1）适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的细菌及酵母则不适用。（2）保藏期较长，约1～10年。效果较好，且微生物移接方便，经济简便。3、特点126四、麸皮保藏法1、原理以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然后在低温干燥条件下保存。2、方法将麸皮与水以一定的比例拌匀，装量为试管体积2/5，湿热灭菌后经冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔封，再保藏，则效果更好。四、麸皮保藏法1、原理1273、特点（1）此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏期在1年以上。（2）操作简单、经济实惠，工厂较多采用。3、特点128五、冷冻真空干燥保藏法（冻干法）1、原理在较低的温度下（一15℃以下），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。经过冷冻干燥的微生物的生长和代谢活动处于极低水平，不易发生变异或死亡，因此菌种可以保存很长时间。2、方法将准备保存的新鲜斜面菌种，在无菌条件下，装入灭菌的保护剂（常用脱脂牛奶和血清），制成菌悬液，再用无菌带橡皮头的滴管将菌悬液分装到准备好的安瓿管中，-35℃下预冻15min一2h，然后进行真空于燥，最后将安瓿管真空熔封，低温避光保存。五、冷冻真空干燥保藏法（冻干法）1、原理1293、特点（1）此法适用于各大类微生物。（2）此法的主要保藏措施是低温、干燥、缺氧、有保护剂，保藏期一般长达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。（3）该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。3、特点130六、液氮超低温保藏法1、原理微生物在－130℃的低温下，所有的代谢活动暂时停止而生命延续，微生物菌种得以长期保存。可通过加入保护剂来降低细胞内溶液的冰点，减少冰晶对细胞的伤害。

2、方法取合适的培养物，以5～10％的甘油或二甲亚砜制成孢子悬液或菌悬液。将此悬液注入无菌的安瓿管或聚丙烯小管内，密封，在液氮超低温（－196℃）下保藏。六、液氮超低温保藏法1、原理1313、特点（1）适用于各种微生物菌种的保藏。（2）保藏期一般可达到15年以上，是目前公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。（3）优点：操作简便、高效，且可使用各种培养形式的微生物进行保藏。缺点：需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。3、特点132第三节

培养基第三节

培养基133一、培养基组成与成分人工配制的适合于不同微生物生长、繁殖和积累代谢产物的营养基质。碳源、氮源、无机盐、微量元素、水、生长因素、前体、诱导剂或刺激剂、抑制剂例：高氏培养基（培养放线菌）：

可溶性淀粉2克，硝酸钾0.1克，磷酸氢二钾0.05克，氯化钠0.05克，硫酸镁0.05克，硫酸亚铁0.001克，琼脂2克，水100毫升。一、培养基组成与成分134（一）碳源：提供微生物生长繁殖所需的能源，构成细胞和抗生素的碳骨架。1．碳水化合物：单糖，多糖，多聚糖（蔗糖、乳糖、淀粉、糊精等）2．脂肪：油（脂肪）水解脂肪酶

甘油（脂肪酸）溶解氧C02+H20

（一）碳源：提供微生物生长繁殖所需的能源，构成细胞和抗生素的1353．有机酸有机酸或它们的盐也能作为微生物的碳源。注意！有机酸的利用常会使pH上升。CH3COONa+O2→2CO2+H2O+NaOH3．有机酸136（二）氮源：主要用于构成菌体细胞物质，如氨基酸、蛋白质、核酸等和含氮的目的产物如青霉素、链霉素等抗生素。1、无机氮源（快速利用N源）：铵盐（如氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵），硝酸盐（如硝酸钠、硝酸钾）和氨水等。特点：（1）分解快，能被微生物迅速利用；（2）引起pH变化。(NH4)2S04→2NH3+H2S04生理酸性物质NaNO3+4H2→NH3+2H20+NaOH生理碱性物质（二）氮源：主要用于构成菌体细胞物质，如氨基酸、蛋白质、核1372、有机氮源（慢速利用氮源）：花生饼粉，黄豆饼粉，玉米浆，玉米蛋白粉，蛋白胨，酵母膏。在微生物分泌的蛋白酶作用下，水解成氨基酸，被菌体吸收后再进一步分解代谢．最终用于合成菌体细胞物质和含氮的目的产物。2、有机氮源（慢速利用氮源）：花生饼粉，黄豆饼粉，玉米浆，138（三）无机盐、微量元素：

微生物在生长繁殖和合成目的产物的过程中，需要某些无机盐和微量元素作为其生理活性物质的组成或代谢的调节物。P、S（可构成细胞物质）Mg、Fe（可作为酶的组成成分或维持酶活性）K、Na（调节细胞渗透压）Cu、Zn、Mn（作为酶的辅基和激活剂）（三）无机盐、微量元素：微生物在生长繁殖和合成目的产物的139（四）水：

（1）构成生物体的成分；（2）培养基的组成部分；（3）参与代谢反应；（4）作为代谢反应介质；（5）作为物质传递介质；（6）良好的热导体。（四）水：（1）构成生物体的成分；140（五）生长因素：生长因素：有些微生物即使在具有合适的水分、碳源、氮源、无机盐等的条件下，还不能生长或生长不好，但如果加入少量微生物生长所必需的有机物质，则生长良好。通常把这些特殊的营养物质称为生长因素。

1．维生素：是辅酶的组成成分；2．氨基酸：有些生物不能合成某种氨基酸；3．嘌呤和嘧啶：构成核酸和辅酶。（五）生长因素：生长因素：有些微生物即使在具有合适的水分141（六）前体

在微生物合成抗生素过程中，有些化合物能被微生物直接利用来构成抗生素分子结构的一部分，而化合物本身的结构设没有大的变化，这些物质称为抗生素的前体。（六）前体在微生物合成抗生素过程中，有些化合物能被微生物142（七）诱导物或刺激剂：

所谓诱导物是指一些具有调节抗生素生物合成能力的小分子物质。如：β－吲哚乙酸是金霉素生物合成的刺激物；甲硫氨酸和亮氨酸是头孢菌素的刺激剂。（七）诱导物或刺激剂：所谓诱导物是指一些具有调节抗生素生143（八）抑制剂：在次级代谢产物发酵生产过程中，往往抑制某一代谢途径，就会使另一代谢途径活跃。如加入二乙基巴比妥盐可抑制利福霉素B以外其他利福霉素的生成，从而增加利福霉素B的含量和产量。（八）抑制剂：在次级代谢产物发酵生产过程中，往往抑制某一144二、培养基的种类

（一）按来源分类：1、合成培养基（1）所用原料的化学成分明确、稳定；（2）实验重现性好、低泡；（3）适用于研究菌种基本代谢和过程的物质变化；（4）营养单一，价格昂贵，不适用于大规模工业生产。二、培养基的种类（一）按来源分类：1452、天然培养基（天然的动植物产品）（1）营养丰富，适合于微生物的生长繁殖和目的产物的合成。（2）组成培养基的原料来源丰富，价格低廉，适用于工业生产。（3）组分复杂，不易重复，若对原料质量等方面不加控制会严重影响生产的稳定性。2、天然培养基（天然的动植物产品）146（二）按状态分类：

固体培养基：适用于菌种的分离和保存；半固体培养基：（琼脂用量为0.5～0.8％）主要用于鉴定菌种、观察细菌运动特征及噬菌体的效价测定等；液体培养基：（水80％～90％），是发酵工业大规模使用的培养基，它有利于氧和物质的传递。

（二）按状态分类：固体培养基：适147（三）按用途分类：

1．孢子培养基供菌种繁殖孢子的固体培养基。能使菌体迅速生长，产生较多优质孢子并不易引起菌种发生变异。例如：高氏培养基（三）按用途分类：1．孢子培养基1482．种子培养基指一、二级种子罐的培养基和摇瓶培养基。主要含有容易被利用的碳源、氮源、无机盐等，使孢子很快发芽、生长以及大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮和使各种有关的初级代谢酶的活力提高。赤霉素产生菌种子培养基：葡萄糖1.5%,糊精1.0%,花生粉1.5%,MgSO4·7H2O0.1%,KH2PO40.1%,消泡剂0.2%2．种子培养基1493．发酵培养基发酵培养基可供菌种生长、繁殖和合成产物。发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。玉米淀粉7.0％，饴糖2.5％，豆饼粉0.3％，花生粉1.0％，MgSO4·7H2O0.07％，KH2PO40.14％，消沫剂0.05％，α-淀粉酶0.05％3．发酵培养基150三、影响培养基质量的因素

（一）原材料质量的影响：玉米浆、黄豆粉、花生饼粉、蛋白胨、淀粉、糊精品种、产地、加工方法、储藏条件

三、影响培养基质量的因素（一）原材料质量的影响：151（二）水质的影响地质（地区）（地貌）、季节、处理方法（漂白粉、沉淀剂、消毒剂）和环境水源质量的主要考虑参数包括pH、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。

（二）水质的影响152（三）灭菌操作灭菌操作不当不仅会减少培养基中有效的营养成分，还会产生一些有毒物质，给发酵带来不利的影响。蛋白质在高温下变性，维生素在高温下失活葡萄糖与含氨基的物质反应形成5-羟甲基糖醛和棕色的类黑精（焦化），对微生物有一定的毒性（三）灭菌操作153（四）培养基粘度的影响粘度是培养基物性的重要指标之一，它直接影响氧的传递、营养成分、无机盐、生长因子等的扩散，从而影响细胞的呼吸、营养成分的吸收，最终导致影响目标产物的形成。“稀配方”：（1）中间补料；（2）精料发酵、基础原料液体化；（3）补加无菌水（四）培养基粘度的影响粘度是培养基物性的重要指标之一，它直154第四节

灭菌及染菌防治

染菌对抗生素生产过程的危害：（1）消耗培养基的营养成分；（2）使培养条件如溶氧、粘度发生变化；（3）有的杂菌会分泌一些对抗生素产生菌有毒或能使抗生素降解失活的物质，从而造成抗生素产量大幅度下降；（4）影响后道工序的正常生产、影响产品外观及内在质量；（5）如果污染了噬菌体，不仅引起产生菌自溶，而且还会迅速大面积蔓延，严重威胁抗生素的生产。第四节

灭菌及染菌防治染菌对抗生素生产过程的危害：155一、灭菌的理论和技术灭菌是指用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备中所有生命物质的技术或工艺过程。（一）物理灭菌射线灭菌热灭菌（湿热和干热）过滤除菌一、灭菌的理论和技术灭菌是指用化学或物理的方法杀灭或去除物156射线灭菌1、方法：通常用紫外线、高能量的电磁波或粒子辐射灭菌。其中以紫外线最常用。2、原理：紫外线的作用光谱与细菌体内核酸的吸收光谱相一致，DNA链上核苷酸的碱基因此具有强烈的吸收紫外线的能力，引起DNA结构形式的变化而导致死亡。3、特点：紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，但其穿透力极低，只能用于表面灭菌。对真菌孢子的杀灭能力不大。主要用来进行一定空间内空气的灭菌（如无菌室等）。射线灭菌157干热灭菌

1、方法：包括火焰灭菌和热空气灭菌，常用的干热空气灭菌是利用电热或者红外线在一定设备内对各种用具物品进行杀菌。生产上常用的干热灭菌的条件是160℃，时间1－2h。2、原理：高温时微生物各种与温度有关的氧化过程速率增快。3、特点：时间长、耗热量大，应用不广。一般用于灭菌后要求保持干燥状态的物料。干热灭菌158湿热灭菌1、方法：直接用加压湿蒸汽进行物料或设备容器的灭菌。用蒸汽将物料升温到115－140℃保持一定时间，可杀死各种微生物。常用的灭菌条件是120℃，20－30min。2、原理：在高温及有水分存在的条件下，微生物细胞中的蛋白质极易凝固而引起微生物的死亡。3、特点：经济，快速，适用于大量培养基及发酵设备的灭菌。湿热灭菌159介质过滤除菌对培养液中某此不耐热的成分可采用过滤除菌法。发酵过程中所用的大量无菌空气也是用过滤除菌法。介质过滤除菌160（二）化学灭菌

1、定义：化学药剂灭菌是通过药剂与微生物细胞接触而发生诸如蛋白质变性等作用而达到杀灭微生物的目的。2、灭菌用化学药剂必须具备以下四个条件：（1）杀菌谱广。有效浓度低且杀灭微生物的速度快。（2）性质稳定，易溶于水且可在常温下使用。（3）基本上不受有机物、酸、碱和其他物理化学因素的影响。（4）无腐蚀性，无毒或低毒，使用安全。（二）化学灭菌

1、定义：化学药剂灭菌是通过药剂与微生物细胞1613、常用的化学药剂：乙醇、甲醛、苯扎溴铵（新洁尔灭）、戊二醛、环氧乙烷、漂白粉和苯酚（石炭酸）等。4、用途：化学灭菌主要用来进行皮肤表面、器具及无菌区域的灭菌，很少用于培养基的灭菌。3、常用的化学药剂：乙醇、甲醛、苯扎溴铵（新洁尔灭）、戊二醛162二、培养基及有关设备的灭菌

（一）实罐灭菌（分批灭菌）

分批灭菌是将配制好的培养基投入发酵罐中，经过间接蒸汽预热后，直接通入饱和蒸汽使培养基和设备一起灭菌。流程：培养基预热培养基灭菌冷却二、培养基及有关设备的灭菌（一）实罐灭菌（分批灭菌）163第三章微生物制药工艺技术基础课件164注意事项：1．培养基预热：80～90℃。避免产生冷凝水造成培养基稀释。2．培养基灭菌：120～130℃，保温30min。各路蒸汽进口要畅通，防止逆流，罐内液体翻动要剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度。排汽量不宜过大，以节约蒸汽用量。3．冷却：灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却水冷却，避免罐压迅速下降，产生负压而抽吸外界空气。注意事项：165（二）空罐灭菌空罐灭菌即发酵罐罐体的灭菌。空罐灭菌一般维持罐压1.5×105～2.0×105Pa，罐温125～130℃，30～45min，直接蒸汽法。灭菌后为避免罐压急速下降造成负压，要等到经过灭菌的无菌培养基输入罐内后，才可以开冷却水冷却。（二）空罐灭菌空罐灭菌即发酵罐罐体的灭菌。166（三）连续灭菌培养基通过连续灭菌装置，进行快速这续加热灭菌，并快速冷却，再立即输入预先经过空罐灭菌后的发酵罐中。流程：培养基预热连续灭菌维持灭菌温度冷却（三）连续灭菌培养基通过连续灭菌装置，进行快速这续加热灭菌167第三章微生物制药工艺技术基础课件168注意事项：1．培养基预热：60一75℃，避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。2．连续灭菌：连续灭菌的温度一般以126一132℃为宜。3．维持灭菌温度：利用维持罐使料液在灭菌温度下保持5—7min，以达到灭菌的目的。4．冷却：采用冷水喷淋时，喷淋前冷却管内应充满填料。注意事项：169特点：（1）连续灭菌的时间短、温度较高。培养基受到的破坏较少，故质量较好。连续灭菌时蒸汽负荷均衡一致。（2）不足之处是所需设备较多，操作较麻烦，染菌的机会也相应增多。特点：170（四）发酵附属设备及管路的灭菌

发酵附属设备有总空气过滤器、管道、计量罐、补料罐等。（四）发酵附属设备及管路的灭菌

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