克隆基因的表达课件

第7章克隆基因的原核表达第7章克隆基因的原核表达basicprocessofDNArecombinationinvitro

体外DNA重组的基本步骤2.重组体的制备：将目的基因的DNA片断连接到能自我复制并带有选择性标记（如：抗菌素抗性标记）的载体分子上（DNA重组过程，需要各种工具酶的参与）3.重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。4.克隆鉴定：筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。*1.目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。

25.目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物basicprocessofDNArecombina原核生物中基因的表达操纵子↓多顺反子mRNA↓多肽转录翻译原核生物中基因的表达操纵子↓多顺反子mRNA↓多肽转录翻译真核生物中基因的表达基因↓前体mRNA↓成熟mRNA（单顺反子）↓蛋白质前体成熟蛋白质↓转录转录后加工转运，翻译翻译后加工真核生物中基因的表达基因↓前体mRNA↓成熟mRNA（单顺反表达体载体宿主第一代原核生物表达体系质粒、噬菌体细菌第二代酵母表达体系穿梭质粒酵母第三代哺乳类细胞表达体系病毒、脂质体培养细胞第四代基因直接导入DNA本身生殖细胞、体细胞、个体表达体系的发展表达体载体contents1外源基因在原核生物(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、农杆菌等)中的表达2外源基因在真核生物（酵母、植物、动物）中的表达contents1外源基因在原核生物(大肠杆菌、枯草芽孢杆1外源基因在原核细胞中的表达1.1原核生物基因表达的特点1.2外源基因在大肠杆菌中高效表达的几个必须的结构1.3几种类型的原核表达载体1.4提高基因表达效率的途径1外源基因在原核细胞中的表达1.1原核生物基因表达的特点1.1原核生物基因表达的特点①只有一种RNA聚合酶(真核细胞有三种)：催化所有RNA的合成。②基因的表达是以操纵子为单位的。③原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。④原核基因一般不含有内含子(intron)，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。⑤原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。⑥mRNA的核糖体结合位点上，含有一个起始密码子及同16S核糖体RNA3’末端碱基互补的序列，即SD序列，而真核基因则缺乏此序列。1.1原核生物基因表达的特点①只有一种RNA聚合酶(真核外源基因在原核细胞中表达的必要条件

①通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白；②

外源基因不能带有内含子，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA；③

必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达；④

外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框(openreadingframe，ORF)；⑤

利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。外源基因在原核细胞中表达的必要条件①通过表达载体将外源基因大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物*大肠杆菌是最常用的原核表达宿主菌。大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素*大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能*理想的大肠杆菌表达载体（1）稳定的遗传复制、传代能力，在无选择压力下能存在于大肠杆菌细胞内。（2）具有显性的转化筛选标记。（3）启动子的转录是可以调控的，抑制时本底转录水平较低。（4）启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程不影响表达载体的复制。（5）具备适用于外源基因插入的酶切位点。复制起始位点、筛选标志、启动子、转录终止子、核糖体结合位点和多克隆位点是构成表达载体的最基本元件。理想的大肠杆菌表达载体（1）稳定的遗传复制、传代能力，在无选1.2外源基因在大肠杆菌中高效表达的几个必须的结构转录水平翻译水平启动子转录终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数1.2外源基因在大肠杆菌中高效表达的几个必须的结构转录水平翻Ptac

=3Ptrp=11Plac启动子-35区序列-10区序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAAT

PtraATAGACATAATGTPlLTTGACA

GATACTPrecATTGATA

TATAAT1.2.1原核表达载体常用的启动子启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列

Ptac=3Ptrp=11Plac启动子-Tac启动子是由

trp的–35序列和

lacUV5（抗葡萄糖代谢阻遏的突变型大肠杆菌）的–10序列拼接而成的杂合启动子。

调控模式与lacUV5相似，但mRNA转录水平更高于

trp和lacUV5启动子（Ptac

=3Ptrp=11Plac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用tac启动子比用lacUV5启动子更优越。启动子-35区序列-10区序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAAT

（1）Tac表达系统Tac启动子是由trp的–35序列和laLac和Tac表达系统是最早建立并得到广泛应用的表达系统。大肠杆菌JM109等菌株常被选用为Lac、Tac表达系统的宿主菌。lac、tac启动子的宿主菌lac、tac启动子的宿主菌IPTG

（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）用于诱导

lac、tac启动子的转录，但由于IPTG本身具有一定的毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用IPTG

解决方法

lac

和tac启动子的转录受温度严紧调控（使用阻遏蛋白lacI的温度敏感突变株lacI（ts）。在较低温度（30℃）时外源基因表达受到抑制，在较高温度（42℃）时则开放。）乳糖替代IPTG诱导lac

和tac启动子的转录lac、tac表达系统存在的问题IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）用于诱导laIPTG诱导PGEX系列表达载体的表达原核表达载体PGEX系列带有一个“tac”强启动子，载体上还携带Laclq基因，编码Lac抑制因子，当无IPTG存在时，Lac阻遏蛋白能抑Ptac转录，保持低水平表达。加入诱导物IPTG时它可与Lac阻遏蛋白结合，导致其构象变化，起到去阻遏作用，起动转录，高效表达。GST基因IPTG诱导PGEX系列表达载体的表达原核表达载体PGEX以λ噬菌体早期基因转录启动子PL、PR

为核心构建的表达系统

PL、PR

表达系统都选用温度敏感突变体cI857(ts)

的基因产物来调控PL、PR

启动子的转录。（2）PL和PR表达系统以λ噬菌体早期基因转录启动子PL、PR为核心构建的表PL

和PR表达系统存在的问题由于PL和

PR表达系统诱导时不加化学诱导剂，成本又低廉，最初几个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用PL或

PR表达系统。但在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从30℃提高到42℃需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效果，对重组蛋白表达量有一定的影响。PL和PR表达系统存在的问题由于PL和PR表大肠杆菌T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的。pET系列载体是这类表达载体的典型代表。

pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统常用宿主细胞为大肠杆菌菌株BL21（DE3）（因为菌株BL21（DE3）的染色体能表达T7噬菌体RNA聚合酶）等。

（3）T7表达系统大肠杆菌T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这T7噬菌体基因1编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。

T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。

在细胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。常见的有化学诱导型、温度诱导型等。T7表达系统T7噬菌体基因1编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬克隆基因的表达课件克隆基因的表达课件（4）其他表达系统营养调控型、糖原调控型、pH调控型等（4）其他表达系统营养调控型、糖原调控型、pH调控型等外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的RNA混合物。过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达。1.2.2转录终止子目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2

以及T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即R外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。mRNA翻译的起始效率主要由其5’端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）通常在AUG上游3-11bp，长约3-9bp,5’UAAGGAGG3’1.2.3核糖体结合位点（RBS）外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD（UAAGGAGG）序列与16SrRNA的碱基互补性，其中以

GGAG

四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低mRNA与核糖体的结合程度一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。

紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响。如：对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍SD序列与起始密码子之间序列的影响SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而SD序列与起始密码子AUG之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约7个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低SD序列与起始密码子之间距离的影响SD序列与起始密码子AUG之间的精确距离保证了mRNA在核大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。

除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的

5’端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。

目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。起始密码子及其后续若干密码子的影响大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性。因此对外源基因表达而言，需选择宿主细胞偏爱的密码子。1.2.4密码子不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。1.2.5质粒拷贝数质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细1.3几种类型的原核表达载体1.3几种类型的原核表达载体一种典型的大肠杆菌表达载体示意图一种典型的大肠杆菌表达载体示意图TTGACA。。。。。TATAAT-3517-10PTAAGGAGG（N）8ATG（91%）GTG（8%）TTG（1%）编码序列TAATGATAGTTtetrOriRBS大肠杆菌表达载体的基本成分核糖体结合位点（与翻译有关）转录终止子TTGACA。。。。。TATAAT-3517-10PTAAG表达载体类型非融合型表达载体：---所表达的蛋白是天然完整蛋白（具有非常接近于真核细胞体内蛋白质的结构，因此表达产物的生物学功能也就更接近于生物体内天然蛋白质。但也易被细菌蛋白酶破坏）融合型表达载体：----所表达的蛋白是融合蛋白（稳定性大大增加，不易被细菌蛋白酶降解；也易于分离纯化）分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌至胞周间隙表达载体类型非融合型表达载体：---所表达的蛋白是天然完整蛋1.3.1非融合型表达载体为了在原核生物细胞中表达出非融合蛋白，可将带有起始密码ATG的真核基因插入到原核启动子和SD序列的下游，组成一个杂合的核糖体结合区，经转录翻译，得到非融合蛋白。*1.3.1非融合型表达载体为了在原核生物细胞中表达出非融PSDForeignDNA非融合型表达载体非融合基因主要元件：强启动子

SD：

ATG：第一个密码子PSDForeignDNA非融合型表达载体非融合基因主要元非融合型表达载体pKK223-3

Brosius等在哈佛大学的Gilbert实验室组建的

在大肠杆菌细胞中，它能极有效地高水平表达外源基因

它具有一个强的tac(trp-lac)启动子。这个启动子是由trp启动子的—35区、lacUV5启动子的—10区、操纵基因及S-D序列组成

非融合型表达载体pKK223-3Brosius等在哈佛大tac启动子之后是一个取自pUC8的多克隆位点（MCS）定位在启动子和S-D序列后

在MCS下游的一段DNA序列中，还包含一个很强的核糖体RNA的转录终止子，目的是为了稳定载体系统载体的其余部分由pBR322组成。

tac启动子之后是一个取自pUC8的多克隆位点（MCS）定位1.3.2融合型表达载体将外源基因与载体自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。表达融合型蛋白应非常注意其阅读框架，其阅读框应与融合的DNA片段的阅读框一致，翻译时才不至于产生移码突变。在这种结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合分子中释放并回收异源蛋白*1.3.2融合型表达载体将外源基因与载体自身的蛋白质编码基融合蛋白表达载体的构建最关键的一点：两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，为目的蛋白分离回收创造条件外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺融合蛋白表达载体的构建最关键的一点：两个蛋白编码序列应保持一PSDForeignDNA融合型表达载体融合基因PSDForeignDNA融合型表达载体融合基因常见的用于构建融合蛋白的受体蛋白谷胱甘肽转移酶（GST）：维持良好空间构象硫氧化还原蛋白（TrxA）：维持良好空间构象麦芽糖结合蛋白（MBP）：促进分泌金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA）：免疫亲和层析外膜蛋白（OmpF）：促进分泌β-半乳糖苷酶（LacZ）：免疫亲和层析泛素蛋白（Ubi）：维持良好空间构象常见的用于构建融合蛋白的受体蛋白谷胱甘肽转移酶（GST）：融合型蛋白表达载体pGEX系统由Pharmacia公司构建（已被GE公司收购）由3种载体pGEX-lXT，pGEX-2T和pGEX-3X以及一种用于纯化表达蛋白的亲和层析介质GlutathioneSepharose4B组成。含有启动子tac及lac操纵基因、SD序列、lacI阻遏蛋白基因等。与其他表达载体不同之处在于S-D序列下游是谷胱甘肽巯基转移酶基因，而克隆的外源基因则与谷胱甘肽巯基转移酶基因相连。融合型蛋白表达载体pGEX系统由Pharmacia公司构建（Ptac：适合IPTG诱导GST融合蛋白—方便纯化产物切割方便：pGEX-1T—凝血酶pGEX-2T---凝血酶pGEX-3T---X因子融合型载体----pGEX系列Ptac：适合IPTG诱导融合型载体----pGEX系列1.3.3分泌型表达载体主要元件：启动子和SD序列信号肽序列：通常位于SD序列下游，编码信号肽，可引导蛋白跨膜1.3.3分泌型表达载体主要元件：分泌型表达蛋白优点：目的蛋白稳定性高：高重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳定性大约是在细胞质中的1100倍目的蛋白易于分离目的蛋白末端完整：相当多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去*分泌型表达蛋白优点：*缺点：相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍。缺点：分泌型表达载体pinⅢ系统以pBR322为基础构建的它带有大肠杆菌中最强的启动子之一，即Ipp(脂蛋白基因)启动子在启动子的下游装有lacUV5的启动子及其操纵基因lac阻遏子的基因(1acI)也克隆在这个质粒上分泌型表达载体pinⅢ系统以pBR322为基础构建的作为分泌克隆表达载体中关键的编码信号肽的序列，是取自于大肠杆菌中分泌蛋白的基因ompa(外膜蛋白基因)。SS为信号肽序列作为分泌克隆表达载体中关键的编码信号肽的序列，是取自于大肠杆1.4提高基因表达效率的途径

1、选择合适载体，提高翻译水平强启动子----提高转录水平核糖体结合位点（ATG---SD）避免产物降解：分泌/融合表达（提高其稳定性）*1.4提高基因表达效率的途径1、选择合适载体，提高翻译水2、选择合适宿主

Lac启动子----LacI菌

PL/PR--------CI857

溶源菌3、诱导表达（可减轻细胞的代谢负荷）温度诱导------PLPR/IPTG的化学诱导----Plac、Ptac4、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降解2、选择合适宿主2外源基因在真核生物中表达宿主：酵母菌、植物细胞、动物细胞等。

MCS真核或病毒的启动子Poly（A）信号终止子外源基因2外源基因在真核生物中表达宿主：酵母菌、植物细胞、动物细胞2.1外源基因在植物中的表达见第八章2.1外源基因在植物中的表达见第八章2.2外源基因在动物中的表达重组的外源基因动物细胞体外培养的动物细胞卵细胞药物、疫苗等转基因动物个体人体细胞基因治疗转染动物遗传性状改良药物筛选评价模型胚胎发育见第九章2.2外源基因在动物中的表达重组的外源基因动物细胞体外培养的summaryPTac、PLac、PTrp、PL、PR、PT7启动子、转录终止子、SD序列、偏爱密码、融合蛋白、非融合蛋白、分泌型蛋白、GST、大肠杆菌表达外源基因的优势和劣势？提高基因表达效率的途径？表达形式：融合表达、非融合表达、分泌型表达、诱导表达、pET系列表达载体、pGEX系列表达载体Tac表达体系（pGEX）、T7表达体系（pET）summaryPTac、PLac、PTrp、PL、PR、P第7章克隆基因的原核表达第7章克隆基因的原核表达basicprocessofDNArecombinationinvitro

体外DNA重组的基本步骤2.重组体的制备：将目的基因的DNA片断连接到能自我复制并带有选择性标记（如：抗菌素抗性标记）的载体分子上（DNA重组过程，需要各种工具酶的参与）3.重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。4.克隆鉴定：筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。*1.目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。

605.目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物basicprocessofDNArecombina原核生物中基因的表达操纵子↓多顺反子mRNA↓多肽转录翻译原核生物中基因的表达操纵子↓多顺反子mRNA↓多肽转录翻译真核生物中基因的表达基因↓前体mRNA↓成熟mRNA（单顺反子）↓蛋白质前体成熟蛋白质↓转录转录后加工转运，翻译翻译后加工真核生物中基因的表达基因↓前体mRNA↓成熟mRNA（单顺反表达体载体宿主第一代原核生物表达体系质粒、噬菌体细菌第二代酵母表达体系穿梭质粒酵母第三代哺乳类细胞表达体系病毒、脂质体培养细胞第四代基因直接导入DNA本身生殖细胞、体细胞、个体表达体系的发展表达体载体contents1外源基因在原核生物(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、农杆菌等)中的表达2外源基因在真核生物（酵母、植物、动物）中的表达contents1外源基因在原核生物(大肠杆菌、枯草芽孢杆1外源基因在原核细胞中的表达1.1原核生物基因表达的特点1.2外源基因在大肠杆菌中高效表达的几个必须的结构1.3几种类型的原核表达载体1.4提高基因表达效率的途径1外源基因在原核细胞中的表达1.1原核生物基因表达的特点1.1原核生物基因表达的特点①只有一种RNA聚合酶(真核细胞有三种)：催化所有RNA的合成。②基因的表达是以操纵子为单位的。③原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。④原核基因一般不含有内含子(intron)，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。⑤原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。⑥mRNA的核糖体结合位点上，含有一个起始密码子及同16S核糖体RNA3’末端碱基互补的序列，即SD序列，而真核基因则缺乏此序列。1.1原核生物基因表达的特点①只有一种RNA聚合酶(真核外源基因在原核细胞中表达的必要条件

①通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白；②

外源基因不能带有内含子，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA；③

必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达；④

外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框(openreadingframe，ORF)；⑤

利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。外源基因在原核细胞中表达的必要条件①通过表达载体将外源基因大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架基因克隆表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物*大肠杆菌是最常用的原核表达宿主菌。大肠杆菌表达外源基因的优势全基因组测序，共有4405个开放型大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素*大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能*理想的大肠杆菌表达载体（1）稳定的遗传复制、传代能力，在无选择压力下能存在于大肠杆菌细胞内。（2）具有显性的转化筛选标记。（3）启动子的转录是可以调控的，抑制时本底转录水平较低。（4）启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程不影响表达载体的复制。（5）具备适用于外源基因插入的酶切位点。复制起始位点、筛选标志、启动子、转录终止子、核糖体结合位点和多克隆位点是构成表达载体的最基本元件。理想的大肠杆菌表达载体（1）稳定的遗传复制、传代能力，在无选1.2外源基因在大肠杆菌中高效表达的几个必须的结构转录水平翻译水平启动子转录终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数1.2外源基因在大肠杆菌中高效表达的几个必须的结构转录水平翻Ptac

=3Ptrp=11Plac启动子-35区序列-10区序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAAT

PtraATAGACATAATGTPlLTTGACA

GATACTPrecATTGATA

TATAAT1.2.1原核表达载体常用的启动子启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列

Ptac=3Ptrp=11Plac启动子-Tac启动子是由

trp的–35序列和

lacUV5（抗葡萄糖代谢阻遏的突变型大肠杆菌）的–10序列拼接而成的杂合启动子。

调控模式与lacUV5相似，但mRNA转录水平更高于

trp和lacUV5启动子（Ptac

=3Ptrp=11Plac），因此在要求有较高基因表达水平的情况下，选用tac启动子比用lacUV5启动子更优越。启动子-35区序列-10区序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAAT

（1）Tac表达系统Tac启动子是由trp的–35序列和laLac和Tac表达系统是最早建立并得到广泛应用的表达系统。大肠杆菌JM109等菌株常被选用为Lac、Tac表达系统的宿主菌。lac、tac启动子的宿主菌lac、tac启动子的宿主菌IPTG

（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）用于诱导

lac、tac启动子的转录，但由于IPTG本身具有一定的毒性。从安全角度，对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合。一些国家规定在生产人用重组蛋白质的生产工艺中不能使用IPTG

解决方法

lac

和tac启动子的转录受温度严紧调控（使用阻遏蛋白lacI的温度敏感突变株lacI（ts）。在较低温度（30℃）时外源基因表达受到抑制，在较高温度（42℃）时则开放。）乳糖替代IPTG诱导lac

和tac启动子的转录lac、tac表达系统存在的问题IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）用于诱导laIPTG诱导PGEX系列表达载体的表达原核表达载体PGEX系列带有一个“tac”强启动子，载体上还携带Laclq基因，编码Lac抑制因子，当无IPTG存在时，Lac阻遏蛋白能抑Ptac转录，保持低水平表达。加入诱导物IPTG时它可与Lac阻遏蛋白结合，导致其构象变化，起到去阻遏作用，起动转录，高效表达。GST基因IPTG诱导PGEX系列表达载体的表达原核表达载体PGEX以λ噬菌体早期基因转录启动子PL、PR

为核心构建的表达系统

PL、PR

表达系统都选用温度敏感突变体cI857(ts)

的基因产物来调控PL、PR

启动子的转录。（2）PL和PR表达系统以λ噬菌体早期基因转录启动子PL、PR为核心构建的表PL

和PR表达系统存在的问题由于PL和

PR表达系统诱导时不加化学诱导剂，成本又低廉，最初几个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用PL或

PR表达系统。但在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从30℃提高到42℃需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效果，对重组蛋白表达量有一定的影响。PL和PR表达系统存在的问题由于PL和PR表大肠杆菌T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7表达系统表达目的基因的水平是目前所有表达系统中最高的。pET系列载体是这类表达载体的典型代表。

pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统常用宿主细胞为大肠杆菌菌株BL21（DE3）（因为菌株BL21（DE3）的染色体能表达T7噬菌体RNA聚合酶）等。

（3）T7表达系统大肠杆菌T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这T7噬菌体基因1编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。

T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。

在细胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬茵体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录达到很高的水平。常见的有化学诱导型、温度诱导型等。T7表达系统T7噬菌体基因1编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬克隆基因的表达课件克隆基因的表达课件（4）其他表达系统营养调控型、糖原调控型、pH调控型等（4）其他表达系统营养调控型、糖原调控型、pH调控型等外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的RNA混合物。过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达。1.2.2转录终止子目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2

以及T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即R外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。mRNA翻译的起始效率主要由其5’端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）通常在AUG上游3-11bp，长约3-9bp,5’UAAGGAGG3’1.2.3核糖体结合位点（RBS）外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD（UAAGGAGG）序列与16SrRNA的碱基互补性，其中以

GGAG

四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低mRNA与核糖体的结合程度一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。

紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响。如：对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍SD序列与起始密码子之间序列的影响SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而SD序列与起始密码子AUG之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约7个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低SD序列与起始密码子之间距离的影响SD序列与起始密码子AUG之间的精确距离保证了mRNA在核大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。

除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的

5’端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。

目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。起始密码子及其后续若干密码子的影响大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性。因此对外源基因表达而言，需选择宿主细胞偏爱的密码子。1.2.4密码子不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。1.2.5质粒拷贝数质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细1.3几种类型的原核表达载体1.3几种类型的原核表达载体一种典型的大肠杆菌表达载体示意图一种典型的大肠杆菌表达载体示意图TTGACA。。。。。TATAAT-3517-10PTAAGGAGG（N）8ATG（91%）GTG（8%）TTG（1%）编码序列TAATGATAGTTtetrOriRBS大肠杆菌表达载体的基本成分核糖体结合位点（与翻译有关）转录终止子TTGACA。。。。。TATAAT-3517-10PTAAG表达载体类型非融合型表达载体：---所表达的蛋白是天然完整蛋白（具有非常接近于真核细胞体内蛋白质的结构，因此表达产物的生物学功能也就更接近于生物体内天然蛋白质。但也易被细菌蛋白酶破坏）融合型表达载体：----所表达的蛋白是融合蛋白（稳定性大大增加，不易被细菌蛋白酶降解；也易于分离纯化）分泌型表达载体：----产物可跨膜分泌至胞周间隙表达载体类型非融合型表达载体：---所表达的蛋白是天然完整蛋1.3.1非融合型表达载体为了在原核生物细胞中表达出非融合蛋白，可将带有起始密码ATG的真核基因插入到原核启动子和SD序列的下游，组成一个杂合的核糖体结合区，经转录翻译，得到非融合蛋白。*1.3.1非融合型表达载体为了在原核生物细胞中表达出非融PSDForeignDNA非融合型表达载体非融合基因主要元件：强启动子

SD：

ATG：第一个密码子PSDForeignDNA非融合型表达载体非融合基因主要元非融合型表达载体pKK223-3

Brosius等在哈佛大学的Gilbert实验室组建的

在大肠杆菌细胞中，它能极有效地高水平表达外源基因

它具有一个强的tac(trp-lac)启动子。这个启动子是由trp启动子的—35区、lacUV5启动子的—10区、操纵基因及S-D序列组成

非融合型表达载体pKK223-3Brosius等在哈佛大tac启动子之后是一个取自pUC8的多克隆位点（MCS）定位在启动子和S-D序列后

在MCS下游的一段DNA序列中，还包含一个很强的核糖体RNA的转录终止子，目的是为了稳定载体系统载体的其余部分由pBR322组成。

tac启动子之后是一个取自pUC8的多克隆位点（MCS）定位1.3.2融合型表达载体将外源基因与载体自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。表达融合型蛋白应非常注意其阅读框架，其阅读框应与融合的DNA片段的阅读框一致，翻译时才不至于产生移码突变。在这种结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于N端，异源蛋白位于C端。通过在DNA水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合分子中释放并回收异源蛋白*1.3.2融合型表达载体将外源基因与载体自身的蛋白质编码基融合蛋白表达载体的构建最关键的一点：两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，为目的蛋白分离回收创造条件外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺融合蛋白表达载体的构建最关键的一点：两个蛋白编码序列应保持一PSDForeignDNA融合型表达载体融合基因PSDForeignDNA融合型表达载体融合基因常见的用于构建融合蛋白的受体蛋白谷胱甘肽转移酶（GST）：维持良好空间构象硫氧化还