基因工程ppt第八章基因工程课件

第八章基因工程基因工程(geneticengineering)、基因克隆、DNA重组、DNA克隆、分子克隆克隆（clone）无性繁殖应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝，或其表达产物。第八章基因工程基因工程(geneticengin1基因克隆示意图基因克隆示意图2基因工程ppt第八章基因工程课件3基因工程大事记1973Cohen第一例成功的克隆实验1978Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物

1982第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用

1985第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼

基因工程大事记1973Cohen第一例成功的克隆实验41993

基因工程西红柿在美国上市1997英国罗斯林研究所多莉羊1999.9中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1%2000.6.26科学家公布人类基因组工作草图2001.2.11公布人类基因组基本信息生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程1993基因工程西红柿在美国上市5胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子Ⅷ脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体胰岛素6自然界的基因转移和重组基因重组(geneticrecombination)——整段DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进行交换,并能在新的位置上复制,转录和翻译自然界的基因转移和重组是无目的基因工程有目的自然界的基因转移和重组基因重组(geneticrecom7结合作用质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌）转化作用transformation

通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程结合作用8转导作用transduction病毒、噬菌体介导溶菌途径；溶原菌途径转导作用transduction病毒、噬菌体介导9基因工程工具酶载体重组DNA技术的基本过程真核细胞转染克隆基因的表达基因工程工具酶10工具酶限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标记、补平3′末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记末端转移酶3′末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基常用的工具酶：工具酶限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3′-5′11一把特殊的剪刀

—限制性内切酶的发现

阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖一把特殊的剪刀

—限制性内切酶的发现

阿尔伯(Arber)、121953年，Arber研究噬菌体与细菌（A、B）的关系。发现100-200个子代噬菌体中，只有1个可感染B，即其他的噬菌体在B中受到限制，唯有这一个受到修饰（甲基化）后感染成功。细菌B：在缺甲硫氨酸的培养基中，细菌死亡。原因：细菌无法对自己的DNA进行修饰。假设：限制性内切酶与修饰酶。1953年，Arber研究噬菌体与细菌（A、B）的关系。13基因工程ppt第八章基因工程课件14基因工程ppt第八章基因工程课件151967年，Smith，分析限制性内切酶的识别和切割序列，认为它由5-6个碱基组成原因：限制性酶将T7DNA切成平均长度为1000碱基的片段。识别和切割序列：中心对称的回文结构。限制性酶：HindⅡNathans：用限制性酶切割猴子SV40DNA，DNA测序。1967年，Smith，分析限制性内切酶的识别和切割序列，认16限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型命名：EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序)限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)识别17识别和切割位点回文结构4～6bp出现两种末端粘性末端粘端

平头末端平端

同工异源酶：来源不同，但能识别和切割同一位点同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端识别和切割位点18粘性末端与平头末端粘性末端与平头末端19修饰酶DNA聚合酶Ⅰ逆转录酶(reversetranscriptase)T4DNA连接酶(T4ligase)碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)末端脱氧核苷酰转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)TaqDNA聚合酶修饰酶DNA聚合酶Ⅰ20DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)的活性5′至3′的聚合活性5′→3′方向核酸外切酶活性5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性polⅠ经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段大片段（Klenow片段）：聚合活性、3′→5′外切活性常用的工具酶DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)的活性5′至3′的聚合活性21核酸外切酶活性3′→5′外切酶活性5′→3′外切酶活性核酸外切酶活性3′→5′外切酶活性22基因工程ppt第八章基因工程课件23基因工程ppt第八章基因工程课件24基因工程ppt第八章基因工程课件25末端脱氧核苷酰转移酶(TDT)末端脱氧核苷酰转移酶(TDT)26载体vectorDNA，能在宿主细胞中进行自我复制和表达克隆载体、表达载体原核载体：质粒(pBR322,pUC…）噬菌体（λ，M13）等真核载体：动物病毒载体pLXSN等载体vectorDNA，能在宿主细胞中进行自我复制和27基因工程ppt第八章基因工程课件28常用的克隆载体质粒(plasmid)—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子理想的质粒

拷贝数多;两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr)

、抗四环素基因(terr)；β-半乳糖苷酶基因(lacZ)筛选标志多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiplecloningsites,MCS)常用的克隆载体质粒(plasmid)—存在于细菌染色体外的小29基因工程ppt第八章基因工程课件30基因工程ppt第八章基因工程课件31基因工程ppt第八章基因工程课件32基因工程ppt第八章基因工程课件33常用的克隆载体λ噬菌体(λphage)基因组分三个区域：左侧区、中间区（非必需区）、右侧区DNA，替换型载体，外源DNA：9~23kb常用：EMBL系列、λgt系列、charon系列粘性质粒(cosmid)：λDNA的cos区+质粒，双链环状DNA，克隆容量：40~50kbM13噬菌体最大优点：产生单链DNA常用的克隆载体λ噬菌体(λphage)34基因工程ppt第八章基因工程课件35基因工程ppt第八章基因工程课件36基因工程ppt第八章基因工程课件37基因工程ppt第八章基因工程课件38基因工程ppt第八章基因工程课件39基因工程ppt第八章基因工程课件40cos:cohesive-endsite特点：cos:cohesive-endsite特点：41基因工程ppt第八章基因工程课件42基因工程ppt第八章基因工程课件43RFDNA:replicationalformDNA优点：RFDNA:优点：44表达载体(expressingvector)特点：带表达构件—转录和翻译所需的DNA序列大肠杆菌表达载体：含启动子—核糖体结合位点—克隆位点—转录终止信号启动子：trp-lac(tac)启动子、λ噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子核糖体结合位点(ribosome-bindingsite,RBS)：起始密码子(ATG)和SD序列转录终止序列表达载体(expressingvector)特点：带表达构45基因工程ppt第八章基因工程课件46基因工程ppt第八章基因工程课件47基因工程ppt第八章基因工程课件48哺乳动物表达载体真核表达元件：启动子/增强子—克隆位点—终止信号和加poly(A)信号哺乳动物表达载体真核表达元件：启动子/增强子—克隆位点—终止49重组DNA技术的基本过程目的基因的制备载体的选择和制备DNA分子的体外连接将外源DNA导入宿主细胞目的基因的筛选和鉴定重组DNA技术的基本过程目的基因的制备50目的基因(targetDNA)的制备目的基因（外源基因）制备基因组DNA基因文库(genomiclibrary)—存在于转化细菌中、克隆载体携带的所有基因组DNA的集合制备cDNAcDNA文库(cDNAlibrary)制备用于表达的基因片段：PCR技术、化学合成目的基因(targetDNA)的制备目的基因（外源基因）51基因工程ppt第八章基因工程课件52基因工程ppt第八章基因工程课件53基因工程ppt第八章基因工程课件54基因工程ppt第八章基因工程课件55基因工程ppt第八章基因工程课件56载体的选择和制备：λ噬菌体、粘性质粒、pUC系列、M13噬菌体DNA分子的体外连接（DNA连接酶）粘性末端连接连接效率高相同酶切末端平端连接连接效率低人工接头(linker)法同聚物接尾法载体的选择和制备：λ噬菌体、粘性质粒、pUC系列、M13噬57基因工程ppt第八章基因工程课件58基因工程ppt第八章基因工程课件59基因工程ppt第八章基因工程课件60基因工程ppt第八章基因工程课件61同聚物接尾法同聚物接尾法62将外源DNA导入宿主细胞基因工程菌HB101,JM109转化(transformation)制备感受态细胞冷的氯化钙处理，细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态感染(infaction)转导(transduction)：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程转染(transfection)：真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。将外源DNA导入宿主细胞基因工程菌HB101,JM163目的基因的筛选和鉴定(screening/selection)遗传学方法插入灭活法(insertioninactivation):抗药性标志选择

标志补救表达产物与营养缺陷互补

α-互补蓝白斑筛选免疫学方法分子杂交探针原位杂交

PCR限制性酶切图谱

目的基因的筛选和鉴定(screening/selection64基因工程ppt第八章基因工程课件65基因工程ppt第八章基因工程课件66基因工程ppt第八章基因工程课件67IPTG;X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)IPTG;X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半68基因工程ppt第八章基因工程课件69

bp—1534—994—

695—515—377—237

ABCM

bpAB70基因工程ppt第八章基因工程课件71基因工程ppt第八章基因工程课件72克隆基因的表达载体有转录、翻译的元件；密码子通用原核表达体系

原核表达载体的标准合适的筛选标志强启动子翻译控制序列多克隆位点克隆基因的表达载体有转录、翻译的元件；密码子通用73融合蛋白（fusionprotein,包涵体）表达的蛋白质或多肽的N末端由原核DNA编码，C末断由克隆的真核DNA编目。大肠杆菌表达体系的不足缺乏转录后加工机制，只能表达cDNA缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化融合蛋白形成包涵体，复性后才有活性很难表达大量的可溶性蛋白融合蛋白（fusionprotein,包涵体）74基因工程ppt第八章基因工程课件75真核表达体系转染方法磷酸钙沉淀DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染；人造膜显微注射筛选标志tk-NeorG418瞬时转染目的基因不整合进宿主基因组稳定转染目的基因整合进宿主基因组真核表达体系转染方法76tk-细胞突变株筛选转染细胞胸苷激酶（tk）TTP：从头合成（氨甲喋呤阻断），补救合成HAT选择（H：次黄嘌呤；A：氨甲喋呤；T：胸苷）tk+：生长tk-+带tk基因的质粒：生长tk-细胞突变株筛选转染细胞胸苷激酶（tk）77药物筛选转染细胞neor新霉素：细菌抗生素，干扰原核生物蛋白质合成G418：干扰原核、真核生物neo：磷酸转移酶，使G418失活neo与目的基因连锁,转染药物筛选转染细胞neor78目的基因的定点诱变及其应用基因定点诱变技术基因定点诱变技术的应用目的基因的定点诱变及其应用基因定点诱变技术79基因工程ppt第八章基因工程课件80基因工程ppt第八章基因工程课件81基因工程ppt第八章基因工程课件82基因工程ppt第八章基因工程课件83基因工程ppt第八章基因工程课件84演讲完毕，谢谢观看！演讲完毕，谢谢观看！85第八章基因工程基因工程(geneticengineering)、基因克隆、DNA重组、DNA克隆、分子克隆克隆（clone）无性繁殖应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝，或其表达产物。第八章基因工程基因工程(geneticengin86基因克隆示意图基因克隆示意图87基因工程ppt第八章基因工程课件88基因工程大事记1973Cohen第一例成功的克隆实验1978Genentech公司人胰岛素世界上第一种基因工程蛋白药物

1982第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用

1985第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼

基因工程大事记1973Cohen第一例成功的克隆实验891993

基因工程西红柿在美国上市1997英国罗斯林研究所多莉羊1999.9中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1%2000.6.26科学家公布人类基因组工作草图2001.2.11公布人类基因组基本信息生物技术工程：基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程1993基因工程西红柿在美国上市90胰岛素人生长激素干扰素白细胞介素2粒细胞集落刺激因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子红细胞生成素EPO组织纤溶酶原激活剂生长激素促生长素抗血友病因子Ⅷ脱氧核糖核酸酶葡糖脑苷脂酶鼠单克隆抗体胰岛素91自然界的基因转移和重组基因重组(geneticrecombination)——整段DNA在细胞内或细胞间,甚至不同物种间进行交换,并能在新的位置上复制,转录和翻译自然界的基因转移和重组是无目的基因工程有目的自然界的基因转移和重组基因重组(geneticrecom92结合作用质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌）转化作用transformation

通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程结合作用93转导作用transduction病毒、噬菌体介导溶菌途径；溶原菌途径转导作用transduction病毒、噬菌体介导94基因工程工具酶载体重组DNA技术的基本过程真核细胞转染克隆基因的表达基因工程工具酶95工具酶限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标记、补平3′末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记末端转移酶3′末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基常用的工具酶：工具酶限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3′-5′96一把特殊的剪刀

—限制性内切酶的发现

阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖一把特殊的剪刀

—限制性内切酶的发现

阿尔伯(Arber)、971953年，Arber研究噬菌体与细菌（A、B）的关系。发现100-200个子代噬菌体中，只有1个可感染B，即其他的噬菌体在B中受到限制，唯有这一个受到修饰（甲基化）后感染成功。细菌B：在缺甲硫氨酸的培养基中，细菌死亡。原因：细菌无法对自己的DNA进行修饰。假设：限制性内切酶与修饰酶。1953年，Arber研究噬菌体与细菌（A、B）的关系。98基因工程ppt第八章基因工程课件99基因工程ppt第八章基因工程课件1001967年，Smith，分析限制性内切酶的识别和切割序列，认为它由5-6个碱基组成原因：限制性酶将T7DNA切成平均长度为1000碱基的片段。识别和切割序列：中心对称的回文结构。限制性酶：HindⅡNathans：用限制性酶切割猴子SV40DNA，DNA测序。1967年，Smith，分析限制性内切酶的识别和切割序列，认101限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型命名：EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序)限制性核酸内切酶(restrictionenzyme)识别102识别和切割位点回文结构4～6bp出现两种末端粘性末端粘端

平头末端平端

同工异源酶：来源不同，但能识别和切割同一位点同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端识别和切割位点103粘性末端与平头末端粘性末端与平头末端104修饰酶DNA聚合酶Ⅰ逆转录酶(reversetranscriptase)T4DNA连接酶(T4ligase)碱性磷酸酶(alkalinephosphatase)末端脱氧核苷酰转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)TaqDNA聚合酶修饰酶DNA聚合酶Ⅰ105DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)的活性5′至3′的聚合活性5′→3′方向核酸外切酶活性5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性polⅠ经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段大片段（Klenow片段）：聚合活性、3′→5′外切活性常用的工具酶DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ)的活性5′至3′的聚合活性106核酸外切酶活性3′→5′外切酶活性5′→3′外切酶活性核酸外切酶活性3′→5′外切酶活性107基因工程ppt第八章基因工程课件108基因工程ppt第八章基因工程课件109基因工程ppt第八章基因工程课件110末端脱氧核苷酰转移酶(TDT)末端脱氧核苷酰转移酶(TDT)111载体vectorDNA，能在宿主细胞中进行自我复制和表达克隆载体、表达载体原核载体：质粒(pBR322,pUC…）噬菌体（λ，M13）等真核载体：动物病毒载体pLXSN等载体vectorDNA，能在宿主细胞中进行自我复制和112基因工程ppt第八章基因工程课件113常用的克隆载体质粒(plasmid)—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子理想的质粒

拷贝数多;两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr)

、抗四环素基因(terr)；β-半乳糖苷酶基因(lacZ)筛选标志多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiplecloningsites,MCS)常用的克隆载体质粒(plasmid)—存在于细菌染色体外的小114基因工程ppt第八章基因工程课件115基因工程ppt第八章基因工程课件116基因工程ppt第八章基因工程课件117基因工程ppt第八章基因工程课件118常用的克隆载体λ噬菌体(λphage)基因组分三个区域：左侧区、中间区（非必需区）、右侧区DNA，替换型载体，外源DNA：9~23kb常用：EMBL系列、λgt系列、charon系列粘性质粒(cosmid)：λDNA的cos区+质粒，双链环状DNA，克隆容量：40~50kbM13噬菌体最大优点：产生单链DNA常用的克隆载体λ噬菌体(λphage)119基因工程ppt第八章基因工程课件120基因工程ppt第八章基因工程课件121基因工程ppt第八章基因工程课件122基因工程ppt第八章基因工程课件123基因工程ppt第八章基因工程课件124基因工程ppt第八章基因工程课件125cos:cohesive-endsite特点：cos:cohesive-endsite特点：126基因工程ppt第八章基因工程课件127基因工程ppt第八章基因工程课件128RFDNA:replicationalformDNA优点：RFDNA:优点：129表达载体(expressingvector)特点：带表达构件—转录和翻译所需的DNA序列大肠杆菌表达载体：含启动子—核糖体结合位点—克隆位点—转录终止信号启动子：trp-lac(tac)启动子、λ噬菌体PL启动子、T7噬菌体启动子核糖体结合位点(ribosome-bindingsite,RBS)：起始密码子(ATG)和SD序列转录终止序列表达载体(expressingvector)特点：带表达构130基因工程ppt第八章基因工程课件131基因工程ppt第八章基因工程课件132基因工程ppt第八章基因工程课件133哺乳动物表达载体真核表达元件：启动子/增强子—克隆位点—终止信号和加poly(A)信号哺乳动物表达载体真核表达元件：启动子/增强子—克隆位点—终止134重组DNA技术的基本过程目的基因的制备载体的选择和制备DNA分子的体外连接将外源DNA导入宿主细胞目的基因的筛选和鉴定重组DNA技术的基本过程目的基因的制备135目的基因(targetDNA)的制备目的基因（外源基因）制备基因组DNA基因文库(genomiclibrary)—存在于转化细菌中、克隆载体携带的所有基因组DNA的集合制备cDNAcDNA文库(cDNAlibrary)制备用于表达的基因片段：PCR技术、化学合成目的基因(targetDNA)的制备目的基因（外源基因）136基因工程ppt第八章基因工程课件137基因工程ppt第八章基因工程课件138基因工程ppt第八章基因工程课件139基因工程ppt第八章基因工程课件140基因工程ppt第八章基因工程课件141载体的选择和制备：λ噬菌体、粘性质粒、pUC系列、M13噬菌体DNA分子的体外连接（DNA连接酶）粘性末端连接连接效率高相同酶切末端平端连接连接效率低人工接头(linker)法同聚物接尾法载体的选择和制备：λ噬菌体、粘性质粒、pUC系列、M13噬142基因工程ppt第八章基因工程课件143基因工程ppt第八章基因工程课件144基因工程ppt第八章基因工程课件145基因工程ppt第八章基因工程课件146同聚物接尾法同聚物接尾法147将外源DNA导入宿主细胞基因工程菌HB101,JM109转化(transformation)制备感受态细胞冷的氯化钙处理，细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态感染(infaction)转导(transduction)：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程转染(transfection)：真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。将外源DNA导入宿主细胞基因工程菌HB101,JM1148目的基因的筛选和鉴定(screening/selection)遗传学方法插入灭活法(insertioninactivation):抗药性标志选择

标志补救表达产物与营养缺陷互补

α-互补蓝白斑筛选免疫学方法分子杂交探针原位杂交

PCR限制性酶切图谱

目的基因的筛选和鉴定(screening/se