免疫组化(2)理论课

关于免疫组化(2)理论课第一页，共八十二页，2022年，8月28日免疫组化技术操作并不困难，虽然染色过程包括很多步骤，但只要注意一些主要问题，就能完成一张质量好的免疫组化切片。第二页，共八十二页，2022年，8月28日内容1.染色前需注意的问题2.染色中需注意的问题

3.如何进行科研设计第三页，共八十二页，2022年，8月28日免疫组化基本流程以石蜡组织为例sp法：

取材---固定---脱水---透明---浸蜡包埋---切片---烤片---染色开始，脱蜡---入水---修复---阻断内源性过氧化物酶---正常羊血清封闭---一抗---二抗---三抗---显色第四页，共八十二页，2022年，8月28日染色前需注意的问题第五页，共八十二页，2022年，8月28日一、组织和细胞标本类型：二、组织取材对病理组织还应做到以下几点：①

材部位必须是主要病变区。②必须取病灶与正常组织的交界区③必要时取远离病灶的正常组织做对照。第六页，共八十二页，2022年，8月28日三、组织固定在免疫组化中首选的固定液是10%中性缓冲福尔马林液（市售甲醛1：9稀释）为确保离体组织的抗原性，值得高度重视的是离体组织须马上固定。组织离体后固定一般不要超过15分钟，固定在常温条件下时间为8-24小时，同时还要注意的是要避免福尔马林过度固定造成的组织抗原损失第七页，共八十二页，2022年，8月28日

为确保离体组织的抗原性，值得高度重视的是离体组织须马上固定。组织离体后固定一般不要超过15分钟，固定在常温条件下时间为8-24小时，同时还要注意的是要避免福尔马林过度固定造成的组织抗原损失，有研究发现新鲜组织经过福尔马林固定一周后组织抗原丢失严重，抗原几乎不能被检出。组织同样不能长时间放置在70%的乙醇中。脱钙液对抗原破坏较为严重，所以脱钙液中酸的浓度与脱钙时间都必须尽量控制在最低的限度。第八页，共八十二页，2022年，8月28日四、组织脱水五、组织透明六、组织浸蜡及包埋六、切片

第九页，共八十二页，2022年，8月28日举例：小动物组织脱水、透明和浸蜡时间

75%乙醇30min，85%乙醇30min，95%乙醇Ⅰ1h，Ⅱ1h，Ⅲ过夜或2h；无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min；二甲苯Ⅰ15min，Ⅱ10min，Ⅲ10min；石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡Ⅲ1-2h。第十页，共八十二页，2022年，8月28日

总之，提高切片质量须注意制片过程中的每一个环节，特别是组织固定，可以说固定是高质量制片的基础，脱水更关键，只有充分的固定组织，才不会影响整个脱水、透明、浸蜡以及切片、甚至包括染色的全过程，才能制作出合格的高质量的切片。第十一页，共八十二页，2022年，8月28日七、防脱片的制备

防脱玻片的处理各个实验室间一般多采用不同的粘附剂如APES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）、HistogripTM或Poly-L-Lysine。目前通用的是Sigma公司的多聚左旋赖氨酸（Poly-L-lysine）或硅化片，不论是免疫组化还是原位杂交该粘附剂都具有极好的防脱片效果。第十二页，共八十二页，2022年，8月28日APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20-30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。第十三页，共八十二页，2022年，8月28日

HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1-2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60℃烤箱烘烤一小时，装盒备用。

Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60℃烤箱烘烤1小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。第十四页，共八十二页，2022年，8月28日八、烤片

切片在56-60℃恒温箱里烤片至少1小时才不至于脱片，迈新实验室推荐58-60℃恒温箱里烤片2小时。也有的实验室在58-60℃恒温箱里过夜烤片。但高温烤片对抗原有破坏，原因是在高温干燥条件下可以加速组织切片中抗原的氧化。第十五页，共八十二页，2022年，8月28日九、切片保存

切片后的组织在室温下长期保存抗原可以损失。在实验中迈新实验室发现蜡块切片后，在室温下保存三个月以上，免疫组化染色结果会出现减弱或阴性情况，尤其核表达的抗原丢失更多。第十六页，共八十二页，2022年，8月28日究其原因可能与空气中的氧化作用有关，所以在实际工作可以采用蜡封切片来避免抗原损失以便长期保存，也可4℃冰箱冷藏保存，提醒科研单位在连续性课题实验中注意切片的保存。第十七页，共八十二页，2022年，8月28日染色中应注意的问题第十八页，共八十二页，2022年，8月28日一、脱蜡和水化

免疫组化的脱蜡步骤与常规H&E脱蜡步骤相同，免疫组化实验室中脱蜡需与H&E常规脱蜡分离，以保证脱蜡彻底，否则可能导致染色结果的异常。第十九页，共八十二页，2022年，8月28日二、抗体选择第二十页，共八十二页，2022年，8月28日

首先确定一抗种属来源能否适应标本来源（人或动物组织），能否适应标本处理形式（冰冻、石蜡），一抗单克隆抗体（鼠、兔）和多克隆抗体（兔、马、羊等）及二，三抗的配套连接，不同方法连接方式不同（S-P、二步法等），购买商品化抗体应尽量购买原液，质量高，保存时间长，而即用型抗体则现买现用，不可长期保存。第二十一页，共八十二页，2022年，8月28日多抗和单抗的比较

均一性，单抗的均一性很强稳定性，单抗的稳定性较差特异性，单抗的特异性强重复性，单抗的重复性好第二十二页，共八十二页，2022年，8月28日抗体的稀释方法直接测定法从以上结果分析，可以选择1:200~1:400之间的浓度

稀释浓度特异强度背景染色1:50++++++1:100++++++1:200+++++1:400+++﹣第二十三页，共八十二页，2022年，8月28日

抗体的最佳稀释度

由于各种抗体效价不同，组织中抗原强弱不一，应根据不同情况作适当的调整，以取得中等阳性稀释度为最佳，因其既适合于抗原性强和含量多的标本，也可用于抗原性弱的标本。第二十四页，共八十二页，2022年，8月28日抗体滴片技术

所滴的抗体应与切片上的组织刚好吻合。滴抗体前需把切片上的水弄干，但不能干片。要领：甩净组织周围的水。抗体滴片图示：第二十五页，共八十二页，2022年，8月28日三、抗原修复

第二十六页，共八十二页，2022年，8月28日

常规甲醛固定的石蜡切片标本在固定过程中会形成醛键，导致蛋白交联封闭了组织中的部分抗原决定簇，染色前需进行处理，打开醛键暴露抗原，增加细胞和组织的通透性，以使抗体和抗原最大限度结合，提高免疫组化检测阳性率，达到能真实反映该组织蛋白表达水平或抗原含量。抗原修复有酶消化、微波修复、高压处理等。

第二十七页，共八十二页，2022年，8月28日1、微波修复

本实验室微波修复应用最多，特点是简单、有效，主要根据微波发射高频能量，组织经微波幅射后，会加速组织内部分子高速运动，抗原可完全被暴露出来，用于浆或部分核抗原，膜抗原不用或短时间应用。在0.01MPH6.0柠檬酸缓冲液微波修复时，温度控制在95-100℃之间维持10分钟，不足或超过100℃达不到抗原修复最佳效果。第二十八页，共八十二页，2022年，8月28日第二十九页，共八十二页，2022年，8月28日子宫内膜PR染色，修复良好子宫内膜PR染色，修复不足第三十页，共八十二页，2022年，8月28日2、酶消化

其作用是以化学的方式使醛键断裂，暴露抗原决定族，增加细胞和组织的通透性，以便抗体与抗原最大限度的结合，增强特异性染色，避免非特异性染色，注意有些抗原显示必须先行消化，有些不需要反而破坏抗原性，使阳性率下降，须消化的组织或细胞抗原，也要视抗原在切片中的封闭程度而定。对某些组织抗原经一种酶消化后，可能结果仍不理想，此时可采用双消化法，消化的时间与固定的时间成反比。第三十一页，共八十二页，2022年，8月28日胰蛋白酶，用于胞浆抗原，此酶较温和，浓度及消化时间易控制，常用0.05%~0.1%,PH7.8,37℃消化20~30′或更长，微波37℃可短时消化。胃蛋白酶，用于间质抗原，常用0.2%PH2.5左右，消化20~30′或更长，消化后切片应充分洗涤，否则对组织中抗原会进行缓慢消化，破坏组织结构第三十二页，共八十二页，2022年，8月28日第三十三页，共八十二页，2022年，8月28日3、高压处理家用压力锅，大小尺寸根据需要而定，1000W电炉，多用于核抗原修复，针对微波修复多阴性，进行高压处理为阳性，如p27、p21WAP1、PR、Ki67效果好。将1500ml~3000ml的柠檬酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。第三十四页，共八十二页，2022年，8月28日

加热处理后免疫组化的染色敏感度大幅度地提高，其机理推测可能是加热打开了组织抗原因福尔马林固定所引起的抗原决定簇的交联，但机理目前仍然还不是十分清楚。第三十五页，共八十二页，2022年，8月28日第三十六页，共八十二页，2022年，8月28日4.抗原修复液的选择

加热抗原修复缓冲液有多种，如柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）,Tris(pH7-8),EDTA(pH8.0)等,目前首选柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），优点是染色背景清晰，适合于大多数抗体,Tris和EDTA两种修复液对部分抗原修复效果较强，但其染色背景同时加深，如使用不当易造成假阳性结果的判断。第三十七页，共八十二页，2022年，8月28日值得注意的是没有一种抗原修复液能适合于所有的抗体，柠檬酸缓冲液（pH6.0）可作为免疫组化常规使用的抗原修复缓冲液，但也不能除外某些抗体适用于EDTA和Tris缓冲修复液，一般抗原比较难于表达的抗体多选择EDTA和Tris缓冲修复液。第三十八页，共八十二页，2022年，8月28日四、内源性过氧化物酶的灭活

若采用过氧化物酶的检测系统，必须进行内源性过氧化物酶的封闭处理。因坏死组织、中性粒细胞及红细胞等均存在丰富的内源性过氧化物酶，其活性稳定、强，能与过氧化氢反应，可使二氨基联苯胺（DAB）还原产生棕色反应物与免疫HRP标记特异性染色相同，称之为假阳性。故应在染色前将内源酶封闭、消除，常用3%H2O2，浓度适中，过低达不到阻断作用，过高破坏细胞表面抗原，时间控制在10~15分钟。

第三十九页，共八十二页，2022年，8月28日蜕膜组织部分胞核PR阳性，血管内红细胞过氧化物酶显色第四十页，共八十二页，2022年，8月28日坏死组织着色第四十一页，共八十二页，2022年，8月28日内源性生物素—肾小管

第四十二页，共八十二页，2022年，8月28日IgG交叉反应常引起非特异性背景着色，因不同种系动物分子结构相似，抗一种动物IgG可与另一种动物IgG交叉反应，如：二抗羊抗鼠或羊抗兔血清可与人组织切片上人IgG结合，呈假阳性，用二抗同种动物正常血清封闭某些非特异性结合位点，（正常血清可提供白蛋白，与组织内非特异蛋白结合，含天然抗体中IgG的FC段与待检标本FC段结合），一般用10%正常血清封闭组织10~15分钟。五、正常血清封闭

第四十三页，共八十二页，2022年，8月28日抗体与内源性Ig交叉反应：第四十四页，共八十二页，2022年，8月28日

六、免疫组化技术掌握共同条件

1免疫组化染色中PH值和离子浓度对最终结果有影响，磷酸缓冲液（PBS）PH值中性及弱碱性条件(PH7.8)及低离子强度0.01-0.02M，有利于免疫复合物形成，而酸性条件及高离子强度有利于分解。通常采用0.01MPH7.2-7.4缓冲液作为反应环境洗涤液。

第四十五页，共八十二页，2022年，8月28日2.PBS洗涤技术（1）洗涤的目的①保证离子浓度和PH值。②减少非特异反应（抗体不可靠很纯）（2）方法：洗三次，每次5分钟。第四十六页，共八十二页，2022年，8月28日3、抗体最佳孵育温度及时间（一抗孵育）湿盒孵育，以防抗体的蒸发和干片。室温25℃或37℃孵育45~1h或更长时间或转4℃过夜。通过预实验，选择合适稀释度，孵育时间与其成正比。孵育时避免干燥，否则会使抗体活性减低或消失。第四十七页，共八十二页，2022年，8月28日

胞浆着色一抗过浓或交叉反应：p63（乳腺）第四十八页，共八十二页，2022年，8月28日七、正确设计实验对照

第四十九页，共八十二页，2022年，8月28日免疫组化染色结果分析的质量取决于正确使用各种对照，进行常规免疫组化鉴别诊断需设阴性（空白）、阳性、自身、Vimentin阳性对照。

1阴性对照

不含靶抗原的组织切片与待检切片进行同样处理，结果应呈阴性。用PBS替代第一抗体，即空白对照。第五十页，共八十二页，2022年，8月28日2阳性对照

用已证实含有靶抗原组织切片与待检标本进行同样处理进行免疫组化染色，结果应为阳性，阳性对照达到目的有两点：

(1)预期得到阴性结果，必须有阳性对照，对肿瘤鉴别诊断较为重要，当病理形态诊断与免疫组化结果相反时，需用类似肿瘤标本（已知阳性片）作阳性对照。

(2)证明染色技术可靠性，即阴性可靠性，它不是由于标本处理使细胞内抗原丧失，方法错误、技术不熟练造成假阴性。第五十一页，共八十二页，2022年，8月28日阳性对照的标本

1、多组织切片

2、“腊肠”“春卷”切片

3、组织芯片

4、阑尾2mm第五十二页，共八十二页，2022年，8月28日第五十三页，共八十二页，2022年，8月28日3自身对照

根据组织内有不同细胞，抗原成分复杂特点，抗体只作用于一种细胞或某种抗原，阴性部位可作为阳性自身对照，应阳性部位可作被检部位阳性对照，如区别血管源性和非血管源性肿瘤，用第八因子相关抗原检测，血管可作阳性对照，正常上皮可作检测角蛋白自身对照。此对照用途广，要在结果阳性、阴性分明，背景清晰情况下才能作自身对照。第五十四页，共八十二页，2022年，8月28日举例：Vimentin阳性对照

Vimentin在免疫组化中作为阳性对照是由Battifora提出，他提出在每次实验中增加Vimentin染色作为对照，目的是观察组织经福尔马林固定后预期抗原表达的敏感性，按福尔马林固定后抗原损伤的程度来进行分析。第五十五页，共八十二页，2022年，8月28日Vimentin几乎在任何组织中都有表达，尤其优选于活检组织中的免疫组化染色观察。在与上皮组织相连接的间质中存在着大量的血管Vimentin可阳性表达，如果在同一张切片的间质中出现Vimentin染色微弱或部分区域变弱的情况，表明是过度固定导致抗原破坏。所以在每批次实验中应常规加入Vimentin染色，用于指导观察福尔马林固定后抗原表达敏感性情况。第五十六页，共八十二页，2022年，8月28日第五十七页，共八十二页，2022年，8月28日Vimentin染色结果第五十八页，共八十二页，2022年，8月28日八、IHC结果的呈现方式常用的显色体系为辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase，HRP）、碱性磷酸酶（Alkalinephasphotase,AP）和葡萄糖氧化酶（Glucoseoxidase,GOD）。常用显色剂有AEC－砖红色

NBT/BCIP－蓝紫色

DAB－棕黄色或棕褐色

第五十九页，共八十二页，2022年，8月28日

HRP的特点是：（1）酶催化的底物H2O2是特异的，所形成的产物易于观察；（2）反应过程和沉淀物是稳定的。其余反应是非特异的，可用各种电子供体介导，所以选用不同的电子供体可使终产物呈现不同的颜色，如AEC、DAB。第六十页，共八十二页，2022年，8月28日DAB显色原理DABdiaminobenzidine二氨基联苯胺

氧化聚合吲哚胺多聚体

氧化环化苯乙肼聚合体第六十一页，共八十二页，2022年，8月28日DAB显色的优点：背景清晰，阳性物鲜艳易辨；切片可脱水透明故适合于照相及半永久保存。缺点：容易氧化，需新鲜配置；有一定的致癌性，注意防护。第六十二页，共八十二页，2022年，8月28日AEC显色的优缺点AEC（3-amino-9-ethyl-carbazole）即为3-氨基-9-乙基咔唑优点：室温下较稳定，较安全缺点：不能进行脱水等处理，且时间长易褪色，不宜照相。第六十三页，共八十二页，2022年，8月28日NBT/BCIP染色NBT（硝基蓝四氮唑）＋BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐）是AP的最佳底物组合之一，显色反应产物为蓝紫色。ASO-AP+BCIPPH=9.5BCI-OH+Pi

BCI-OH+NBT

蓝紫色

ASO

等位基因特异的寡核苷酸第六十四页，共八十二页，2022年，8月28日免疫组化标准化照片CK10CD44v6ER第六十五页，共八十二页，2022年，8月28日

应用免疫组化进行科研设计第六十六页，共八十二页，2022年，8月28日1、采用新抗体，这是最简单的方法

2、旧抗体新用途

3、采用新方法（如量子点免疫荧光技术）

4、同时应用多种抗体进行普通免疫染色或双重免疫染色研究两种或两种以上的抗原协同表达，只要选用合理，也会获得新发现。第六十七页，共八十二页，2022年，8月28日思考题

以检测肝细胞癌组织某一蛋白的表达为例，说说怎样进行实验且实验结果理想？第六十八页，共八十二页，2022年，8月28日双重和多重标记染色的意义在同一组织或细胞切片上，同时或先后显示两种或两种以上的抗原成分或其它物质，即为双重或多重标记。采取该方法能同时观察不同抗原或分泌其它物质的各类细胞、组织之间的相互关系，以及抗原物质在细胞内合成、转运及代谢的途径，把形态和功能研究更好地结合起来。第六十九页，共八十二页，2022年，8月28日免疫组化的双重染色技术可用于显示某组织中的两种不同的抗原采用经亲和层析纯化并生物素化的二抗与链霉菌素－卵白素－过氧化物酶和链霉菌素－卵白素－碱性磷酸酶交联，其敏感性和特异性均较高。采用两种不同的底物/色素/酶系统包括BCIP/NBT碱性磷酸酶和AEC/过氧化物酶，前者显色为紫黑色，后者为深红色。采用两种不同激发波长的量子点如QD605、QD545，前者显色为橙红色，后者为深绿色第七十页，共八十二页，2022年，8月28日第七十一页，共八十二页，2022年，8月28日注意事项选择双重染色的一抗时，应避免两种一抗的定位（胞核、胞浆、胞膜）重复。选择的两种抗体的抗原修复的方法（高压、微波修复抗原或酶消化等）应尽量相同。在进行双重染色之前，必须首先对所选择的一抗分别进行单独染色的预实验。预实验的操作条件必须与双染时的实验条件相同。观察实验结果，抗体定位正确后，再进行双染实验。实验前要脱蜡彻底，实验中要冲洗充分，严格控制操作步骤，尽量避免非特异性背景着色。第七十二页，共八十二页，2022年，8月28日一、检测PCNA抗原的表达可用免疫组织化学方法如S-P法检测大肠癌组织中的抗原表达

以检测人大肠癌组织中PCNA抗原和酸性粘液为例第七十三页，共八十二页，2022年，8月28日二、AB染色检测粘液的性质在动物体和人体中的各种腺体及许多器官组织都能制造或分泌粘液物质，由于物质中含酸基的不同,而又分为中性粘液物质(neutralmucosubs