菌落总数检验操作规程

菌落总数检验操作规程目的：该操作规程用于标准公司产品及原料的活菌数量检验操作。范围：该操作规程适用于公司要求检查该项的产品和原料的菌落总数检验责任人：微生物检验员，QC内容：技术依据及原理菌落总数计数承受平板菌落计数法，这是活菌计数方法之一。该方法以在琼脂平板上，样品经过处理在肯定条件下培育后，所得1ml〔1g〕检发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。在进展本法测定时，必需严格按本法规定的条件操作，以免产生试验误差。材料、仪器、试剂的预备及根本要求无菌室2.4m，应采光良好、避开潮湿、远离厕所所及污染区，有缓冲间〔2、操作间组成。操作间与缓冲间之间应有样品传递窗〔箱，出入操作间和缓冲间的门不应直对。弧形，无缝隙，不留死角。操作间内不得安装下水道。300缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯〔2～2.5W/m3〕,紫外线杀菌灯距试验台面高度1m，70µW·cm-2〔1m，不符合要求的紫外线杀菌灯应即使更换。温度、湿度无菌室内温度和相对湿度直接影响紫外线杀菌灯的杀菌效果，18～26℃，相对湿度40～60%。操作间或净化工作台的干净空气应保持对4.9Pa。10000100醇灯、打火机、大小橡皮乳头等。缓冲间缓冲间应有洗手盆，无菌衣、帽、口罩、拖鞋等。缓冲间内不应放置培育箱和其他杂物。干净级别及检查方法通常承受尘粒数及浮游菌落或沉降菌数测定法。干净级别≥0.5µm尘埃数/m3空气≥05µm尘埃数/m3空气活微生物数〔个〕/m3100级 ≤3500 ≤0 ≤510000级 ≤350000 ≤2023 ≤100沉降菌数测定303〔经30～35℃48。以无菌方式〔或经传递箱〕移3030～35℃培育箱倒置培育48小时，取出检查，3个平板平均菌落数不超过1个。100效及中效过滤器应依据检测状况，必要时予以更换处理。干净级别 100级 ≤110000级 ≤3100000级 ≤100.1%苯扎溴铵溶液或其他消毒302.2 其他设备 净化工作台恒温培育箱36℃±1℃30℃±1℃冰箱2℃～5℃恒温水浴箱46℃±1℃匀桨〔8000～10000r/min和氏震荡器恒温枯燥〔250～300℃〕高压蒸汽灭菌器〔定期检定〕菌落计数器、显微镜〔1500X〕PetrifilmTM物天平〔0.1g；pHpHpH玻璃器皿锥形瓶〔250ml、500m、培育皿〔90mm、量筒100ml吸管1ml(具0.01ml10ml(具0.1ml0.5cm2cm2121℃30用。用具大小橡皮乳头〔放入干净带盖的容器中，并应定期用75%乙醇溶液浸泡。〔洗净后配套，用牛皮纸包严〕灭菌，备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌〔12cm〕试验记录纸等。试液消毒液0.1%〔5%〔配碘酊或碘伏溶液。稀释剂和试剂1000ml121℃15min。1mol/L〔NaOH40g1000ml1mol/L盐酸〔HCl90ml1000ml磷酸盐缓冲液：500ml175ml1mol/LpH7.2，1000ml1.25ml1000ml，分装于适宜容器中，121℃15培育基平板计数琼脂〔Platecountagar,PCA〕培育基2.7.1 成分胰蛋白胨5.0g酵母浸膏2.5g葡萄糖1.0g琼脂15.0g蒸馏水1000mlpH 7.0±0.22.7.2 pH15培育基制备留意事项：承受枯燥培育基，按说明配制，应对灭菌后的培育基pH原料应选择，琼脂凝固力应测定，以确定配制时琼脂用量。试剂规格应为化学纯以上。配制的培育基不应有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。2／3，以免灭菌时溢出。包装时，塞子必需塞紧，以免松动或脱落造成染菌。培育基配制后应在2小时内灭菌，避开细菌生殖。溶化的培育基应一次用完，开启后不宜再用。或微波炉加热。供试品抽样、保存及检验量抽样〔2的倍量〔以备复试〕伤、明显裂开的包装不得作为样品。需再抽样检验。保存内污染菌因保存不妥引起致死，损伤或生殖。不得作为供试品。检验程序检验样品检验样品1010倍系列稀释2个～3个适宜样品匀液各取1ml分别参加无菌培育皿内每皿中参加15ml～20ml培育36148h±2h计算各平板菌落数计算菌落总数报告检验步骤试验前预备〔1nl10ml量筒、稀释剂等移至无菌室内。每次试验所用物品必需事先打算，预备足够用量，避开操作中出入操作间。编号后将全部外包装〔牛皮纸〕去掉。开启无菌室紫外灯和空气过滤器，并使其工作不低于30分钟。0.1%苯扎溴铵溶液其他适宜消毒液洗手或用乙醇棉球擦手，穿无菌衣、帽、口罩、手套。〔也可用乙醇棉〕擦拭供试品瓶、供试品的稀释称取25g样品置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌匀桨仪或匀浆杯内，1min～2min，1﹕10〔此时一般操作为：左手执试10ml免灯焰将供试液中菌细胞杀灭。加完稀释剂，试管塞马上塞上。1ml1101ml1﹕100101ml310〔此时，一般左手执平皿，将盖半开，右手执吸管，注皿时，将1ml无残留液体，防止反流到吸管尖端部1ml白比照。102.5cm，反复吸吹约至刻度，在沿其次级稀释管的内壁靠近液面〔勿接触液面〕缓慢吹出全部试液〔吸管内应无粘附或残留物，然后将吸管放入消毒缸内。4.4.2.615ml～20ml46℃〔46℃±1℃恒温水浴箱中保温〕以顺时针或逆时针方向快速旋转平皿，留意，混匀时切勿将培育基溅到皿边及皿盖上，置操作台上待凝。培育36℃±1℃48h±2h。假设样品中可能36℃±1℃48h±2h。菌落计数一般将平板置菌落计数器上或从平板的反面直接可用肉眼点计，必要时用显〔colony-forming,CFU〕表示。30CFU300CFU菌落数应承受两个平板的平均数。平板作为该稀释度的菌落数；假设片状菌落不到平板的一半，而其余一半2，代表一个平板菌落数。数。结果表述菌落总数的计算方法数的平均值，再将平均值乘以相应稀释度，作为每克中菌落总数结果。假设有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内，按式〔1〕计算：N=ΣC/(n+0.1n)d„„„„ (1)1 2式中：N——样品中菌落数ΣC——平板〔含适宜范围菌落数的平板〕菌落数之和n1n——其次个适宜稀释度平板上的菌落数2d——稀释因子〔第一稀释度〕例如稀释度1：100〔第一稀释度〕1：1000〔其次稀释度〕菌落数232，24433，35N=ΣC/(n1+0.1n2)d=〔232+244+33+35〕/[2+0.1×2]×10-2=544/0.022=24727250002.×104300数，其他平板可计为多不行计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数