开合式间歇浸没植物生物反应器开发及其应用

分类号 密级UDC开合式间歇浸没植物生物反应答辩日期 答 评阅人 竺锡答辩成 陈集杜志课题来源农业部转生物新品种培育科技重大专（2009ZX08012-010B）开合式间歇浸没植物生物反应器的开发及其应用55年的历史。传统的植物组织培养方法是以琼脂为支持物应器。对加倍体半夏（Pinelliaternata(ThunbBreit.）进行了组织培养，通过对组培苗的3个重要的参数值：（1）频率5min/6h；（2）接种密度为60个/L；（3）培养基蔗糖浓度为30g/L。在此参数条件下培养半夏得到的增殖系数为35.83，叶绿素含dendrobiibuownii成苗后进行相关数据的测量与统计。其皮石斛反应器培养增殖系数为24.71，是对合式花盆中30天，达到94.44%，高于固体培养的87.78%；百合反应器培养的增：间歇浸没培养反应器；植物组织培养；浸没频率；半夏；铁皮石斛DevelopmentandapplicationofanunlockedtemporaryimmersionplantPlanttissueculturehasbeendevelopedandusedforover50years.Theconventionalpropagationtechniquesbasedonsolidorsemi-solidculture,arebothsupportedbytheagarmedia.Thiskindoftechniquesconsumlotsoftimeandlabour,soitisrelativelyhigh-cost.Withtheexpendingofplanttissuecultureindustry,conventionalpropagationtechniqueshavebeenshowingshortagestomeettheproductionrequirements.Thus,anumberofautomatedorsemi-automatedbioreactorssystemshavebeendevolopedtoreplacelabor-intensivetraditionalculturesystem.However,mostofthesebioreactorsarecomplicatedstructurallyandhigh-cost.Inthisworkwedesignedatemporaryimmerisionbioreactorwhichhassimplestructureandeasyoperationwithanublockedcover,itrunssteadilyafterassembling.ForcultivationofPinelliaternata(Thunb.)Breit.,usingthebioreactorandcomparisonoftissuecultureseedlingswithinmorphology,multiplicationrate,dryweightrate,proteincontentetc,weoptimizedthreeimportantparametersofthebioreactorasthefollowings,theimmersionfrequencyis5min/6h;theinoculumdensityis60explants/LandthesucroseconcentrationofculturemediumisThemicropropagationofHerbadendrobii,LiliumbuowniiandAnoectochilusinthisbioreactorsystemandthedatastatisticswithysisaftercomparisonwiththeconventionalpropagationwasdescribed.ThemicropropagationrateofH.dendrobiiwasfoundtobe24.71,whichwas6.55timestothosedofsolidculture.Thesurvivalrateofseedlingswas94.44percentafterdomesticationandtransplantedtothepatentflowerpotforthirtydays,whichwas87.78percenthiherthanthoseofthesolidculture.ThemicropropagationrateofL.bowniiwas12.78timesasthoseofthesolidculture,andthebulbwaslargerthanthosesinthesolidculture.ThemicropropagationrateofA.roxburghiiwasahigherthanthoseofthesolidculture,buttheseedlingwaspoorerthanthoseofsolidcultureatthelastphaseinbioreactorculture.Takingtogether,theunloackedtemporaryimmerisionbioreactorforvarietiesofplantswassuccessfullydeveloped,andthissystemishighlyautomated,withproductionofhigh-qualityseedingsinmosttissueculturesystemstested.Thistemporaryimmersionmethodcouldprovidanovelmeanforindustrialproductionofplantseedlings.However,theparametersfordifferentplantscouldbedifferent.Anditistobeoptimizedaccordingtoplantspecies.:Temporaryimmersionbioreactor;planttissueculture;immersionPinelliaternata(Thunb.)Breit.;Herba 错误！未定义书签。 插 表 符号及缩写词 第一章文献综 前 传统的培养模 半固体和固体培 液体培 植物培养反应器的种 间歇浸没培养模 间歇浸没培养模式的发 间歇浸没培养反应器的种 间歇浸没培养模式的优 间歇浸没培养系统的应 间歇浸没培养系统重要参 研究目的和意 第二章间歇浸没的开合式植物生物反应器设计及组 前 间歇浸没开合式植物反应器设计及原理介 设计及各部件介 工作原理及过 间歇浸没反应器各部件定制及组 反应器各部件的定 反应器的组 间歇浸没反应器性能测 反应器参数设 反应器性能测 小结与讨 第三 间歇浸没反应器应用于半夏的参数优 前 实验材 实验方 培养基及反应器的灭 接 反应器参数的优 浸没频率的设 接种密度的设 培养基蔗糖浓度的设 培养方 数据测定方 数据统计分 结果与分 浸没频率优 不同浸没频率下增殖状况比 组培苗形态比 反应器内生长状态及丛生芽外观形 组培苗叶绿素、可溶性糖、总蛋白含量比 接种密度优 不同接种密度下增殖状况比 组培苗形态方面比 反应器内生长状态及丛生芽外观形 培养基蔗糖浓度优 培养基不同蔗糖浓度下培养增殖状况比 组培苗形态方面比 反应器内生长状态及丛生芽外观形 组培苗叶绿素、可溶性糖、总蛋白含量比 小结与讨 总 第四 间歇浸没生物反应器应用于其它植 前 实验材 实验方 培养 外植 灭菌与接 培养条 反应器参数设 铁皮石斛组培苗的栽 组合式花盆的设 工作过 用于栽培气生兰科植物的组合式花盆的实物组 炼 移 移栽后管 数据测定方法及观 组培苗数据统 铁皮石斛移栽数据统 实验数据统计分 结果与分 两种培养方式培养百 两种培养方式培养百合结果及分 反应器培养百合不同时期状态观 两种培养方式培养金线 两种培养方式培养金线莲结果与分 两种培养方式培养铁皮石斛结果分 铁皮石斛移 植株外观状 移栽后.................................................................................................................................铁皮石斛移栽后的生长状 小结与讨 总 参考文 致 附 攻 期间的研究成 插图图1.1间歇浸没反应器的商业化应用举 图2.1间歇浸没反应器设计 图2.2间歇浸没反应器工作循环 图2.3间歇浸没反应器各个部 图2.4间歇浸没反应器整体 图2.5间歇浸没反应器主体结构 图 间隙浸没反应器一个培养循环的不同阶 图 不同浸没频率下培养得到的组培苗状 图 不同浸没频率下培养得到的组培苗单株状 图 不同接种密度下培养得到的组培苗状 图 不同接种密度对组培苗中叶绿素、可溶性糖和总蛋白含量的影 图 不同培养基蔗糖浓度下培养得到的组培苗状 图 蔗糖浓度对组培苗中叶绿素、可溶性糖和总蛋白含量的影 图 用于栽培气生兰科植物的组合式花盆的设计 图 用于栽培气生兰科植物的组合式花盆的实物分解 图 用于栽培气生兰科植物的组合式花盆的实物组合 图4.4组合式花盆栽种的铁皮石斛组培 图4.5不同的培养方式得到的百合组培 图4.6百合组培苗在反应器培养情 图 两种不同的培养方式下得到的金线莲组培 图4.8金线莲组培苗在反应器生长情 图4.9不同的培养方式下的铁皮石斛组培 图 不同培养方式得到的铁皮石斛组培苗在组合式花盆中生长状 表格表3.1正交试验的因素与水平 表3.2浸没时间和间隔时间组 表3.3绘制蔗糖标准曲线各试管加入 表 不同浸没频率下培养得到的组培苗总体生长情 表3.5浸没频率对组培苗增殖影 表3.6浸没频率对组培苗外观状态影 表 浸没频率对组培苗叶绿素、可溶性糖、总蛋白含量影 表 不同接种密度下培养得到的组培苗总体生长情 表3.9接种密度对组培苗增殖影 表3.10接种密度对组培苗外观状态影 表 不同蔗糖浓度下培养得到的组培苗总体生长情 表3.12蔗糖浓度对组培苗增殖影 表 蔗糖浓度下培养得到的组培苗外观状态影 表4.1两种培养方式获得的百合组培 表4.2两种培养方式获得的金线莲组培 表4.3培养方式对铁皮石斛增殖状况比 表4.4培养方式组培苗外观状态影 表4.5铁皮石斛组培苗移栽30天前后外观状态比 表 不同培养方式得到的铁皮石斛种苗对移栽影 符号及缩写词MS-Naphthaleneaceticindolebutyrics秒hd天Ethylenediaminetetraacetic第一章文献综述前植物组织培养开始于1958年，至今已经有55年的历史。植物组织培养是利用植物离传统的培养模式半固体和固体培养4-6周需要更换新鲜培养基，以便组培苗健康的生长和分化[1]。由于高成本组织培养是一个劳动密集型的技术，劳动力的成本一般占到总成本的40%~60%，分苗和接种是主要消耗劳动力的部分[5]，也是组织培养中最的工作，且由于植物组织长的不均一性，这一过程很难被机器人所替代。同时，组培器皿的、培养基的灌装等液体培养 使用液体培养多种的植物组织，如桃树种苗[9]、小麦和棉花的胚体[1011]的实验结果表明，液体培养比固体培养更优越。在使用固体培养时，胚体的形成同的形成过程相比较，形成过程所消耗的劳动力[12]，根据Aitken–ChristieandJones的研究，形[13]，而液体培养能够提供这样的条件交换，导致培养环境容易缺氧，植物不能健长；而长期浸没于液体中的植物易玻植物培养反应器的种类器[16]，主要用于植物细胞的培养。②.喷雾式反应器，该反应器用于植物的培养，培[20]，2006年被韩国引进，用于参的组织培养，取得了良好的效果，并且培养罐的体（TIB，培养间歇浸没培养模式间歇浸没培养模式的发展.在液体培养基的底部放上组培苗支撑物，如：纸、纤维板、海绵等，培养的过组培苗能够竖直生长[26]；②.在液体培养基底部用琼脂来作为组培苗的支撑物[1]；③.利用雾化器将液体培养基生成雾状，喷施到组培苗上来提供营养[7,28]1983HarrisandMason[29]设计的倾斜式反应利用此反应器培养胡萝卜时，经过20天的培养，胡萝卜组织的鲜重是固体培养的HarrisandMason之后，很多的间歇浸没半自动培养系统被设计出来。所有的这些系①.间歇的浸没培养，和液体培养相比减少了玻璃化现象，组培苗更②.充分的气体交换，为组培苗的生长提供了充足的氧气；③.营养物质得到充足的混合和充分的利用④.限制剪切力水⑤.半自动化操作，并可以简单方便的更换新鲜⑥.减少污⑦.降低生间歇浸没培养反应器的种类整个系统在营养液驱动系统叶轮的驱动下使系统中的营养液通过输送系统进入植物Teisson等[3233]设计了一种由气泵驱动的间歇培养系统。该系统培养效果较理想，现已用于生产，其商品名称为theRecipientforAutomatedTemporaryImmersionsystem，简称为RITA®。RITA®整体的材质为有机玻璃，整个系统有上下2部分组成，上在系统运行时需要外置充气泵进行气压供给，当气体进入营养液器时，需要经过孔径为0.22um的空气过滤器对空气进行过滤除菌以防止污染，当气体进入营养液器后，另一种有代表性的间歇浸没反应器样式是由Elona等[34]设计的一种2个容器分开的T®外硅胶管在培养容器内的一端要求高于培养液液面，并且另一端连接空气过滤除菌器。这除菌的气体进入一个容器，在气压的作用下将其中的培养液通过的硅胶管输入另一个间歇浸没培养模式的优点最大化体交换营养充分的吸收）的优点，在很多种植物幼苗和体细胞胚体的培养中占有一定的优势[36]，植物的长势情况质梨[7和甘蔗[8]组培苗比半固体培养获得的组培苗适应环境能力更强，炼苗更高；养 更也更强[13]1983年HarrisandMason利用的倾斜摇摆式间歇浸没培养反应器培养葡萄长的更健康[28]TIB培养模式获得马铃薯的块茎，不需要炼苗可直接栽种到土壤中，而且很高，达到了95%以上[40]。[45]和植物材料间歇的接触液体培养基[12]是降低玻璃化的有效方法，而间歇浸没培养系璃化，这可能的原因是设置的浸没时间（15min）过长导致。6cm，所以利用间歇浸没系统培养得到的凤梨幼苗栽种后很高。另一方面间歇浸没系统中由于气体交换充分，系统培养的甘蔗组培苗比固体培养适应环境更强，炼苗更高[38]。间歇浸没培养系统的应用1.1(A)TIBs系统生产蝴蝶兰种苗[46]；(B)TIS培养系统获得土豆块茎[47]；(C)间歇浸没反应器生产咖啡豆体细胞胚体[48]；(D)间歇浸没反应器生产苹果幼苗[49]；(E)TIBs系统培养果蔗组培苗[50]；(F)RITA(A)PhalaenopsismicropropagationusingTemporaryimmersionbioreactorsTIBs;(B)PotatomicrotuberproductioninTISsystem;(C)Temporaryimmersionbioreactorsusedforthepregerminationof注：TIS为作者的间歇浸没培养系间歇浸没培养系统重要参数没频率也是不一样的。相关表的浸没频率（≥1h/6h）适宜生成块茎，比如马铃薯；低的浸没时间（≤1min/12h）促进体细胞胚体的形成，比如咖啡和橡胶[52]。rugr从对花楸树幼苗的间歇浸没培养证明了浸没频率直接影响着反应器培养效5in/30min5min/60min组培苗玻璃化现象。rthouly利用间隙浸系统培养咖啡组培苗，优化浸没频率的实6h1515min39。间歇浸没培是一种半放式培养培养过不断进行反应器内的气体交，22[41]。对于进行多数植物培养时，一般情况下蔗糖浓度偏低分化苗弱小，亡[53]；蔗糖浓度高，不但增加了生产成本，而且组培苗出现徒长现象，甚至玻璃化情况浸没培养系统，特别是TIBs和RITA系统，培养基的体积很关键。1998年Lorenzo确定TIBs50ml培养基，23.94倍[38]。然而并不是接种密度越低越好，培养液过多会稀释植物使用同样的培养系统获得了培养凤梨的最适宜的接种密度为每个外植体/200ml[34]，这种情况就需要更大体积的反应装置来获得更高的产出研究目的和意义第二章间歇浸没的开合式植物生物反应器前方式为辅。固体培养方式不但耗费大量的琼脂，而且在灌装以及时需处理大量容器，因此需要耗费大量劳动力，在种苗的扩繁转接过劳动力的消耗也是非常巨大，从而导致生产成本居高不下。液体培养方式具有操作简单、无需换容器、方便、便于大型容致培养环境容易缺氧，植物不能健长，而且长期浸没于液体中的植物易玻璃化，为96204509.8多层转动筛板式雾状流植物组织培养反应器”[55]以及专利号为物的长大，雾状的培养液被植物叶片等隔挡很难分布均匀，严重影响了植物的生长。4、间歇浸没开合式植物反应器设计及原理介绍设计及各部件介绍2.1Fig2.1Temporaryimmersion图示的反应器，设有磨砂口盖子72，并通过一块玻璃板6将储液室5和主反应室7分开，储液室的体积为1.221m3.55的侧壁上方设有进口管51，此进口管51与储液室5的内腔相通。进气管3的一端与充气泵2密封相连，另一端与进口管513上设有空气除菌器Ⅰ41m的小孔63，小孔63上连接一伸向储液室56161的口距离储液室5底部0.5m，玻璃弯管61内设置过滤网62，此过滤网62为团状的尼龙网，过滤网62的作用是主反应室7内的植物组织通过玻璃弯管61掉入液内。液底设置液口放液口处设置密封塞5334可选用滤网孔径为0.22m7的盖子73侧面设置连有硅胶管气体出口管7188可选用滤网孔径为0.22m工作原理及过程①时培养液位于储液室，当充气泵工作时在气压的推动下培养液进入主反应室，开始浸没①间歇状态间歇浸①间歇状态间歇浸没植同阶段示意②开始浸没④浸没结 ③浸没状2.2Fig2.2Workcycleoftemporaryimmersion③.按照图示及上述说明连接充气泵2和时控器1间歇浸没反应器各部件定制及组装反应器各部件的定制公司；团状铁丝球为。各个部件的分解图见图2.3。aa gh ijk2.3Fig2.3Componentsoftemporaryimmersion种入后，在其内进行培养；储液室，培养液，并在通气时提供培养液浸润外植体；b培养液顺利流动；d衔接管：通过螺丝国定在反应罐体上，反应罐体通过衔接管实现进气与出气；e硅胶管：用在主反应罐体上，是主反应罐与空气过滤除菌器相连；f力；h时控器：调节电流通断，从而控制充气泵通气与否；i塑料管：用于充气泵和反应罐体之间的连接；j充气泵连接装置：连接充气泵与反应器罐体，并可以将气体分流，调处，保证反应器无菌状态。反应器的组装2.4为反应器整体结构实物图；图2.5为该反应器的主体图（反应罐体。2.42.5Fig2.5Mainstructurediagramoftemporaryimmersion间歇浸没反应器性能测定反应器参数设定在本确定的各个部件的参数如下：①.时控器：220V/50Hz2200W，固有功率≤2④.空气过滤除菌器孔径：0.22µm/0.45⑤.各个连接口径：9①.浸没频率：5min/6h6h通电一次，将液体泵入主反应罐体浸没接种的外植体5min，每天浸没4次；反应器性能测定没阶段，见图2.6。应室浸没接种的外植体；③浸没状态，通气1.5min后，储液室中的液体全部进入到主反应约1min后，主反应室中的液体全部回流至储液室。至此一个浸没培养结束，开始间歇培养①间歇状 ②开始浸④浸没结 ③浸没状图 间隙浸没反应器一个培养循环的不同阶Fig2.6Differentstagesofacultureingcyclebytemporaryimmersion小结与讨论第三 间歇浸没反应器应用于半夏的参数优前O2CO2等气体，所以对培养液内提供碳源的糖分要求与传统培养方式有实验材料10天的丛生芽，切去叶片和较大叶柄，大小为0.5~0.8cm3实验方法培养基及反应器的灭菌将配制好的培养基灌装入1000ml的三角瓶中，每瓶放入500ml，；反应器主体接10天、长势较好的多倍体桃叶型三叶半夏丛生芽，在无菌超净台中切去叶片和较长的叶柄，大小约为0.5~0.8cm3的组织块作为外植体，每个反应器1000ml灭菌后的液体培养基倒入反应器中。完成接种。反应器参数的优化浸没频率的设定Ms+1.0mg/L6-BA+0.02mg/LNAA+30g/L蔗糖，pH5.860个/L；对影响培养结果的浸没频率进行实验，主要设定浸没时3.1Tab3.1Factorsandlevelsoforthogonal因水浸没时间 间隔时间 表3.2Tab3.2Thecombinationofimmersionandinterval浸没时序

间隔时间 接种密度的设定Ms+1.0mg/L6-BA+0.02mg/LNAA+30g/L蔗80个/L、100个/L。培养基蔗糖浓度的设定培养方法装液 1000通气 15培养时 6030天/其中，装液量：为加入储液室中培养液的体积为1000ml；浸没频率：tmin/Th，即即接种入反应器中的外植体与培养液的体积比；通气量：15L/min，即充气泵每分钟充入每个反应器的气体的量为15L；培养时间：60天，为培养开始到培养结束所需的时间；培养液更换频率：30天/次，为每隔30天将旧的培养液在无菌状态下倒出，加入新的培数据测定方法主要包括以下几个方面：每个容器生物量（g）：为外植体在反应器内生长60天后每=干重/鲜重×100%（cm②.研磨提取：向研钵中加入80%的试剂2.5mL，放入少量的石英砂，研磨成匀浆，再加入3mL80%的试剂，继续研磨至叶片组织颜色变白，在暗处静止3~5min后转过滤后移到10mL的容量瓶中，用80%的试剂洗净研钵，液一并过滤到容量瓶中，用80%的定容到刻度。③.测定吸光度：以80%的试剂作为空白对照，测定提取液在波长663nm、645nm、652nm处的吸光度，每个样品重复测定3次。叶绿素 含量 叶绿素b含量（mg/g）=（22.28 4.67A 叶绿素总含量C（mg/g）=A652①.标准蔗糖溶液（100µg/mL）的配制：将蔗糖在80℃下烘至恒重，精确的称取100mg100mL0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度，使用时再稀释10倍。③.标准曲线制作：取6支试管，按表3.3加入试剂，摇匀，向试管中加入0.5mL蒽酮试剂、5mL10min，取出冷却至室620nm波长下测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标，蔗糖含量为横3.3Tab3.3Additionamountofeveryreagentsondrawingthesugarstandard试012345标准蔗糖溶液0蒸馏水蒽酮试剂浓硫酸555555蔗糖含量0，纸过滤，残渣用沸蒸馏水反复洗涤后过滤，滤液收集在50mL的容量瓶中，用蒸馏水定⑤.样品可溶性糖含量的测定：吸取上述提取液0.5mL，放入干净的试管中，加入1.5mL620nm⑥.结果计算可溶性糖含量

C VS VS—测定时所取提取液体积，mLNaOH，研磨2min，再加60%碱性乙醇，研磨5min。然后用60%碱性乙醇将研磨好的样品无损地洗入50ml容量瓶中，定容摇匀后静置片刻，取部分浸提液离心10min(3500rpm)1ml50ml60%碱性乙醇稀释并定容，摇匀后即可比实验记录数据根据下式处理总蛋白含量

（1.45 0.74A W数据统计分析结果与分析浸没频率优化不同浸没频率下增殖状况比较从表3.4可以看出，单从浸没时间分析，浸没时间为1min与浸没时间为5或10min最高，其次是12h，最低为3h，差异显著，每个容器的块茎数方面也有类似的结果，但是6h和12h之间的差异不显著，这也说明间隔时间为6h组培苗的长势更好。从生物量看，实验组A5最佳，并与其它实验组显著差异；从块茎数看，实验组A5、表 不同浸没频率下培养得到的组培苗总体生长情Tab3.4TheoverallgrowthsituationoftheexplantsunderthedifferentimmersionggFdEdDcDfEbeDbaAaAbBaAcCaaAcCaA

显著性差异

每个容器块茎数（个

显著性差异（gA9，说明反应器培养的浸没时间为6h比较适宜半夏组培苗的增殖；又而A5和A8明显优于A2，说明浸没时间6和10min比浸没时间1min更有利于半夏组培苗的增殖。而不同浸没频3.5hGhGaAeDgFaAgFfEaA

平均鲜重

显著性分F

显著性分 干物率

显著性分FfEeDaAaAbAaAcBcBaAdCdCaAbBaAaAdCcBaA组培苗形态比较（cm（cm（cmmm3h、6h12h5min10min时优于浸没A1，差异显著；当间隔时间为6h时，组培苗各形态指标A5A8，A8优于3.6浸FFFF没频率cDdcDdeDdcDdDeDDcDddDcaAaAaAaAaaAaAacDBbcCdaAb变差，在培养过A3最先出现枯叶现象，其次是A2，最后是A3，说明间隔时间长，min，组培苗的形态A5优于A6，差异不显著，A6优于A4差异显著，培养过A4在35min/3h，组培苗浸没在10min时，随着间隔时间的增加，组培苗的长势越来越好，培养中的观察发现，A7A8均出现不同程度的玻璃化现象从浸没频率分析，当浸没频率为5min/6h，组培苗的长势最好反应器内生长状态及丛生芽外观形3.19种不同的浸没频率下外植体在间歇浸没反应器内生长60天后的状态，从图中可以看出A1到A4丛生芽生长较差；A5到A9丛生芽生长旺盛，丛生芽数量最多，充满整个反应器，其中最好的为A5。说明低浸没时间下该反应器培养半夏效果较差。从图 不同浸没频率下培养得到的组培苗状A1:1min/3h;A2:1min/6h;A3:1min/12h;A4:5min/3h;A5:5min/6h;A6:5min/12h;A7:10min/3h;A8:10min/6h;A9:10min/12hA1:1min/3h;A2:1min/6h;A3:1min/12h;A4:5min/3h;A5:5min/6h;A6:5min/12h;A7:10min/3A8:10min/6h;A9:10min/12 图 不同浸没频率下培养得到的单株组培苗状A1:1min/3h;A2:1min/6h;A3:1min/12h;A4:5min/3h;A5:5min/6h;A6:5min/12h;A7:10min/3h;A8:10min/6h;A9:10min/12hFig3.2SituationofplantletsobtainedunderdifferentimmersionA1:1min/3h;A2:1min/6h;A3:1min/12h;A4:5min/3h;A5:5min/6h;A6:5min/12h;A7:10min/3h;A8:10min/6h;A9:10min/12h组培苗叶绿素、可溶性糖、总蛋白含量比较是A3（0.993mg/g）并无明显差异。这说明浸没频率的不同对组培苗叶绿素的含量并没有mg/gmg/g（10min）下，植物体内蛋白的合成和富集随着间歇时间的增加逐渐增加，可能的原因是表 浸没频率对组培苗中叶绿素、可溶性糖、总蛋白含量的影aAeEEaAeEfEbBeEhGaAdDgFaAaAaAaAaAcCaAcCbBbBbbBbB

叶绿素含

显著性分F

显著性分F

总蛋白含

显著性分F接种密度优化不同接种密度下增殖状况比较从表3.8每个容器的生物量（g）方面，生物量由高到低的实验组依次为显著。从每个反应器所得到的块茎数（个）方面，块茎数由多到少的实验组依次是B3>B4>B2>B5>B1，在F=0.05和F=0.01均差异显著。实验组B1生物量高于B4和B5，而B1表 不同接种密度下培养得到的组培苗总体生长情每个容器生物 显著性差异 每个容器块茎 显著性差异（个cCeDbBcBaAaAdCbBCdC表3.9（g）和增殖系数方面，1到5依次递减，干物率（%）方面最高。说明接种密度低1（0个外植体L，平均每个外植体得到的营养物质多，生长旺盛；但是从空间和营养物质的利用率方面考虑，实验组3（60个外植体/）最后得到表 接种密度下培养得到的组培苗增殖影aAaAaAbBaAbBbBcBcCcCAcCdD

平均鲜 显著性分析

增殖系

显著性分析 干物 显著性分析组培苗形态方面比较外观状态比较测定了组培苗的叶片的长、宽，以及叶柄的长、直径，从表3.10中可以3（60个/的接种密度较适宜反表 接种密度下培养得到的组培苗外观状态影 叶 叶 叶柄 频宽频宽51长51径5bBbBcbBbBBbBaAaAaAaAbbBcCcCcBdD反应器内生长状态及丛生芽外观形从图3.3中可以直观的看出，实验组3组培苗充满了整个反应器的空间，而其它实验组中的组培苗叶片少而且出现枯黄长势较差。直观的印证了上述的数据统计。图 不同接种密度下培养得到的组培苗状Fig3.3StatementsofplantletsobtainedunderdifferentinoculationB1:20explantsper1L;B2:40explantsper1L;B3:60explantsper1L;B4:80explantsper1组培苗叶绿素、可溶性糖、总蛋白含量比较4g34mg/g）与实验组4差异较小，叶绿素含量最低的是实验组1（0.995mg/g）与实验组34有明显差异，而与2和5差异较小。说明反应器接种密度的不同对于培养的组培苗叶图3.4不同接种密度对组培苗中叶绿素、可溶性糖和总蛋白含量的影响Chlorophyllcontentunitismg/g;solublesugarcontentunitis%;proteincontentunitis培养基蔗糖浓度优化培养基不同蔗糖浓度下培养增殖状况比较g/L表 不同蔗糖浓度下培养得到的组培苗总体生长情eeEdDdDbBaAaAbBccC

显著性差异

每个容器块茎数（个

显著性差异%，%，%，3.12eEdDcCdDbBcCaAaAbBbBcbBcCaA

平均鲜 显著性分析

增殖系

显著性分析 干物 显著性分析组培苗形态方面比较表3.133析显示和其它组之间存在显著的差异。在叶片长、叶片宽方面1、2、、5之间无12优于4、45优于、2，同样存在显著差异。表 蔗糖浓度下培养得到的组培苗外观状态影 叶 叶 叶柄 浓宽浓宽51长51径5BbBcCbBbBbBcCaAaAaAaAcBbBcCBbBcCbB反应器内生长状态及丛生芽外观形图 不同培养基蔗糖浓度下培养得到的组培苗状C1:10g/L;C2:20g/L;C3:30g/L;C4:40g/L;C5:50Fig3.5StatementsofplantletsobtainedunderdifferentmediumsucroseC1:10g/L;C2:20g/L;C3:30g/L;C4:40g/L;C5:50组培苗叶绿素、可溶性糖、总蛋白含量比较的增加而增加，并且在培养过观察到随着蔗糖浓度的增加叶片长出的时间延长，可能是低糖迫使叶片提前生长以通过光合作用来提供营养，培苗生长的需求，蔗糖浓度图 蔗糖浓度对组培苗中叶绿素、可溶性糖和总蛋白含量的影叶绿素含量单位为mg/g；可溶性糖含量单位为%；总蛋白含量单位为Fig3.6Effectsofmediumsucroseconcentrationonchlorophyll,solublesugarandproteinChlorophyllcontentunitismg/g;solublesugarcontentunitis%;proteincontentunitis%（10/增加到30/）组培苗中可溶性糖含量也随之增加，从3（30/L）增加到5（50/L）组培苗中可溶性糖含量逐渐减少，从图3.6中也可以直观的看出在3的位置可溶性糖含量达到一个最大峰值。差异较小；其次是实验组C2，的是实验组C1。说明培养基蔗糖浓度从30g/L增加到50小结与讨论浸没频率是间歇浸没反应器培养半夏组培苗的一个重要的参数。从增殖情况看，增殖系数最高的可以达到36，最低的只有6，相差了5倍多，合适的浸没频率能够促进半夏组培苗的生长与分化；从宏观的组培苗的外观形态方面可以直观的比较出不同浸没频率下生长的组培苗的优与劣；从微观成分含量上，除叶绿素的含量各实验组之间没有显著的差别外，可溶性糖和总蛋白含量情况与组培苗的外观形态情况均呈正相关。通过对上述几个方面的比较最后得出最适合间歇浸没反应器培养半夏的浸没频率为5min/6h。接种密度的不同直接影响着对间歇浸没反应器空间和培养基的利用率，而且组培苗间隔的浸泡在培养液中，组培苗在吸收营养的同时也会向培养液中排出代谢产物，这些代谢产物对组培苗的生长和分化有促进或者抑制作用。接种密度低时，虽然增殖率较高，但是总生物量和块茎数较低，对培养条件的利用率不高。从微观成份含量上，不同实验组之间差异并不大，说明各实验组的组培苗健康情况并无很大差别。综合培养条件的利用率和组培苗的健康状况，间歇浸没反应器培养半夏组培苗最优的接种密度是60个/。养基蔗糖浓度是30g/L。总60天，对组培苗的增殖情况、外观状态以及3种重要成分的统计比较，最后得出间歇浸没培养系统进行半夏组织快繁，较优的浸没频率是5min/6h60个/，较优的培养基蔗糖浓度是30/第四章间歇浸没生物反应器应用于其它植物前实验材料实验方法培养基①.铁皮石斛培养基配方：1/2Ms(1/2大量、1/2Ca、2倍有机)+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+香蕉100g/L，pH6.2；②.百合培养基配方：Ms+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L，pH③.金线莲培养基配方：Ms+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L，pH5.8对照组为固体培养，培养基是在实验组的基础上加入5.5g/L外植体灭菌与接种种60个。每种植物接种3个反应器，共180个外植体。按照预先设定好的程序参数进行培养条件培养环境反应器参数设定100060个浸没频5min/615培养基更换频30天/培养时60天/90铁皮石斛组培苗的栽培组合式花盆的设计11图 用于栽培气生兰科植物的组合式花盆的设计Fig4.1Thecombinedflowerpotdesignforcultivationaerialorchidaceous工作过程、当营养液由于蒸发和植物的吸收消耗而导致液面低于空心凸部232用于栽培气生兰科植物的组合式花盆的实物组a下图。其中，图4.2是将用矿泉水瓶高度的1/3处切开一分为二，做成外盆A和内盆B，4.3AB组合在一起的组合式花盆图。其中，a为水位控制小孔，b为进气小孔，c为渗水小孔（在矿泉水瓶盖上凿出的5个小孔。a图 用于栽培气生兰科植物的组合式花盆的实物分解 图 用于栽培气生兰科植物的组合式花盆的实物组合炼2~32~3苗；炼苗完成后洗净小苗根部培养基，然后用0.1%多菌灵15min移4.4A4.4B将10棵炼苗后的铁皮石斛小苗栽种到松鳞中（如图4.4C。反应器和固体培养的组培苗各栽ABC斛对水分的需求。ABC4.4Fig4.4TheprocessofusingcombinedflowerpotcultureDendrobium移栽后管理将移栽好的铁皮石斛放在用遮阴度70%%数据测定方法及观察组培苗数据统计培养周期为60天，测量数据，①生物量（g）：外植体在反应器内生长90天后三个反应三个反应器中产生的组培苗数目的平均值，对照组为30个组培瓶中的总组培苗数除以3而（mm（cm外植体在反应器或者组培瓶中生90天后，各随机抽取10株组培苗，每株再随机选择3条根，测量其长度，计算平均值。培养周期为60天，测量数据同上述（1）中①、②、③；④④株高（cm：外植体在（cmmm4、5叶片之间的茎段的直径，计算平均值；⑥根长（cm90天后，各随机10株组3条根，测量其长铁皮石斛移栽数据统计存活率（存活率=存活铁皮石斛苗数/原有总苗数×%）；，抽取三次计算平均值。（cm（mm测量从顶端起第4、5叶片之间的茎段的直径（mm），计算平均值。实验数据统计分析实验数据采用Excel2003、Spss13.0专业版软件进行统计分析结果与分析两种培养方式培养百合两种培养方式培养百合结果及分析有较大差别。反应器培养下每个容器的生物量可达到815.62g，是对照组固体培养（176.474.1Tab4.1ComparisonofLilyplantletsundertwokindsoftissue

FF量bBbBbFF量bBbBbBbAaAaAaAaA（4.45两种培养模式下得到的百合组培苗的鳞茎大小（直径，反应器培养下的鳞茎直径在①②①②4.5①—反应器培养；②—固体培Fig4.5TwospeciesofLilytissueculture反应器培养百合不同时期状态观察4.6显示了在第2、4、6、8周时百合组培苗在反应器内的生长情况。从图可以看出，接2周后反应器中的外植体开始膨大形成愈伤组织，在经过两周的生长百合组培苗快速繁殖，已经几乎要铺满整个反应室的底部，叶片翠绿生长旺盛。4周后更换培养基，再经2周的培养组培苗已经充满了整个反应器，叶片数和株高4周时明显增加。①②③④①②③④4.6①培养2周②培4周③培养6周8 ④eight两种培养方式培养金线莲两种培养方式培养金线莲结果与分个容器生物量是93.57g，两者无明显差异，每个容器的种苗数（个）方面固体培养多出反植株比较健壮。反应器培养的增殖系数是3.56，固体培养获得的增殖系数为2.31，差异明显；在植株高度（cm）方面，固体培养获得的金线莲组培苗平均株高是5.506cm，反应器培养方式得到的组培苗的株高是4.135cm，两者差异显著。综合以上比较说明反应器培养能够获得的组培苗，但是组培苗相比较固体培养的养出、更优质的金线莲组培苗，代替传统劳动密集型的固体培养模式。4.2FFFF式 量 aA bB①②①②4.7不同的培养方式得到的金线莲组培苗反应器培养金线莲不同时期状态观①①②③④4.82周4周6周8①twoweeks;②fourweeks;③sixweeks;④eight可以看出接种2周后金线莲茎节部分长出黄绿色小芽，再经过2周的培养，小芽长成了茎两种培养方式培养铁皮石斛结果分生物量（1381.96g）是固体培养（202.17g）的6.84倍；每个容器种苗数方面（个4.3Tab4.3Effectofdifferentculturemethodson 数bBbBbBaAaAaA，的长度（cm）方面，固体培养的组培苗平均根长为3.749cm1.3cm，两者差异显著，可能的原因是铁皮石斛是气生兰科植物，反应器在培养的过能够给植物提供充足的空气，而固体培养过空气不流通，在缺少空气的情况下刺激铁4.4Tab4.2Effectofdifferentculturemethodsoncomparisonofappearancewithin培养方式株高

aAbB aAaA

根长①①①②②图 不同的培养方式下得到的铁皮石斛组培①—反应器培养；②—固体培Fig4.9TwospeciesofDendrobiumtissueculture铁皮石斛移栽植株外观状态组合式花盆中生长30天后与移栽前相比植株高度（cm）都有所增加，但是方差分析上无显著性差异；茎段的直径（mm）30自身的物质，因此植株的茎变细。4.530种苗获得方式株高茎直径030aa种苗获得方式株高茎直径030aaAAaaAA0反应器培30aaAAaaAA 移栽后表4.6给出了两种铁皮石斛组培苗移栽到组合式花盆中生长30天后的情况，其中固体培养的组培苗为87.78%，反应器培养的组培苗为94.44%，两者在F=0.05和F=0.01上均差异显可以说明反应器培养的铁皮石斛组培苗适应环境的能力更表 不同培养方式得到的铁皮石斛种苗对移栽影响Tab4.6ComparisonofsurvivalratebetweentwokindsofDendrobiumF种苗获得方 存活率 固体培 反应器培 铁皮石斛移栽后的生长状态30天后率较高，枯叶也较多，而反应器培养的组培苗生长较健康。这也印证了上述①①②培图 不同培养方式得到的铁皮石斛组培苗在组合式花盆中生长状①移栽完成开始培养;②移栽后30Fig4.10twokindsofDendrobiumseedlingsgrowingintheflowerpotfor30①beginningculture;②cultureafter30小结与讨论总总浸没频 5min/6接种密 60个培养基蔗糖浓度30g/L在此参数条件下培养半夏得到的增殖系数为35.83，叶绿素含量为1.141mg/g，可溶平均叶柄的长度为4.666cm，叶片长度1.557cm，叶片宽度1.305cm。30天后的也高于固体培养，证明了该反应器得到的组培苗对环境的适应能力更强。参考文献MaeneL,DeberghP.Liquidmediumadditionstoestablishedtissueculturestoimproveelongationandrootinginvivo[J].Plantcell,tissueandorganculture,1985,5(1):23-33.SluisC,WalkerK.Commercializationofplanttissueculturepropagation[J].Intl.Assoc.PlantTissueCult.Newsl,1985,472-12.罗光明,杨雅琴.半夏的快速繁殖与胚状体诱导[J].江西中医学院学报2003(2):59-SimontonW,RobackerC,KruegerS.Aprogrammablemicropropagationapparatususingcycledliquidmedium[J].Plantcell,tissueandorganculture,1991,27(2):211-218.ChuI.Economic 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