国产实验室新型冠状病毒核酸快速检测试剂上市后多中心临床评价

国产实验室新型冠状病毒核酸快速检测试剂上市后多中心临床评价目前全球新型冠状病毒肺炎疫情仍未有效控制，我国“外防输入、内防反弹”的任务依然艰巨。核酸检测技术是新型冠状病毒（2019-nCoV）感染确诊的金标准及主要的筛查手段，在2019-nCoV的实验室诊断及疫情研判方面发挥了重要作用［1］。实时荧光定量PCR是目前应用最广泛的核酸检测方法，主要过程包括临床样本核酸提取及扩增检测步骤，通常需要4~6h，对环境条件及人员能力要求较高，灵活性及机动性不足。核酸快速检测试剂盒作为2019-nCoV核酸常规检测方法的有力补充，操作简便，不需复杂培训，结果易于判读，有利于医院发热门诊及急诊科提高筛查速度，快速分流患者［2］。我国在2020年5月已批准上市了5种2019-nCoV核酸快速检测试剂盒，本研究在3家机构开展了一项上市后多中心临床试验，通过受试者的咽拭子样本评价上述试剂盒的临床检测性能。材料与方法一、材料选取2022年11月在浙江大学医学院附属第一医院、华中科技大学同济医学院附属同济医院和中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所确诊2019-nCoV感染者及非感染者的咽拭子样本各24份，根据循环阈值（cyclethreshold，Ct）的大小分为强阳性样本（Ct值≤28）、中阳性样本（28<Ct值≤33）和弱阳性样本（Ct值>33）。评价产品为我国批准上市的5种2019-nCoV核酸快速检测试剂盒（隐去名称，使用ABCDE标注）。机构1的强阳性、中阳性、弱阳性样本和阴性样本分别为7、7、6、4份；机构2的强阳性、中阳性、弱阳性样本和阴性样本分别为6、4、8、6份；机构3的强阳性、中阳性、弱阳性样本和阴性分别为5、6、8、5份。机构3的5份样本因剩余核酸量不足，无法完成试剂盒A、B、D、E复检，部分结果未纳入一致性分析。样本采用不含有胍盐的友康非灭活病毒采样管（VTM&UTM）（MT0301）保存。本研究经过中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准（2020-208）。二、方法1.操作步骤及检测时间对比：3家机构按试剂盒说明书推荐的配套仪器及试剂盒对上述临床样本进行检测，记录样本处理时间、扩增检测时间，并由操作人员对操作步骤的复杂性及操作难易程度进行主观评价。各试剂盒之间的样本处理时间、扩增检测时间和总时长通过方差分析进行比较。试验之前对操作人员进行过相关操作培训，且每家机构均为同一人员操作，各机构所用的仪器之间在试验之前均进行校准，排除人员和仪器的干扰。样本检测结果按照各试剂盒说明书的规则进行判断复检。5种快检试剂盒的基本信息见表1。2.2019-nCoV核酸快速检测试剂盒的一致性评价：3家机构分别选取2019-nCoV感染患者及未感染者的共24份咽拭子样本建立样本盘，采用5种核酸快速检测试剂盒进行平行检测。样本盘中临床样本定性结果确定方法如下：阳性样本来自确诊2019-nCoV感染者且本次评价中有1种试剂盒检测结果为阳性的样本；阴性样本来自非感染者的咽拭子样本。不同试剂盒检测结果均与样本盘定性结果比较，分析不同试剂盒的阳性符合率、阴性符合率及总符合率。结果一、5种试剂盒对临床样本检测的阳性符合率、阴性符合率及总符合率与样本盘结果比较，试剂盒C阳性符合率最高，为98.25%，其次为试剂盒E、D和A，阳性符合率均超过90%，分别为98.18%、94.44%和92.59%，而试剂盒B的阳性符合率低于90%，为83.64%。5种试剂盒阴性符合率从高到低依次为D（100%），A、B和E（均为93.33%），C（86.67%）。5种试剂盒总符合率从高到低依次为E、C、D、A和B（表2）。二、5种试剂盒对不同强度临床样本的检出情况5种试剂盒对强阳性和中等强度阳性样本的检出率均达到100%，但对于Ct值33以上的弱阳性标本，不同试剂盒的检出能力存在明显差异，试剂盒C和E的检出能力最强，均达到95%，其余3种试剂盒的检出能力均低于90%，分别为84.21%（D）、78.95%（A）和57.14%（B），5种试剂盒对弱阳性样本的总体检出率为82.18%（表3）。三、5种快速检测试剂盒检测时间比较按照说明书在3家机构评估5种核酸快速检测试剂盒的样本平均处理时间和平均扩增时间。试剂盒A、C和E的样本平均处理时间较短，分别为（3.00±3.46）、（2.33±0.58）和（2.33±1.15）min，试剂盒D的样本处理时间最长，为（16.33±2.31）min。平均扩增时间最短的试剂盒为试剂盒A，由短至长依次为D、B、E和C，差异有统计学意义（P均<0.01）（表4）。5种试剂盒从样本处理到扩增完成的平均总时长在32.33~65.33min。四、5种试剂盒的复检情况分析3家机构按照试剂盒说明书的规则判断是否需要复检，对5种试剂盒的复检情况进行统计分析发现，试剂盒A和B的复检率高于10%，分别为15.28%（11/72）和12.50%（9/72），试剂盒C复检率最低，为6.94%（5/72），试剂盒D和E的复检率分别为9.72%（7/72）和8.33%（6/72）。讨论本研究发现我国批准的5种2019-nCoV核酸快速检测试剂盒的阳性符合率总体较好，说明快检试剂可发挥快速、灵活的优势，为发热门诊、急诊等患者提供有效检测手段。5种核酸快速检测试剂盒对强阳性及中等强度阳性样本的符合率100%，但对弱阳性样本，筛查效果差异较大。国外研究报道同类产品的阳性符合率均不高，美国MesaBiotech公司的Accula的阳性符合率仅为68.0%［3］；美国雅培公司的IDNow的阳性符合率为78.8%［4］，提示我国2019-nCoV快速检测试剂盒的阳性符合率总体上优于国外产品。本研究结果显示不同试剂盒的阳性符合率与PCR上样量无相关性，不同试剂盒阳性符合率差异较大的原因可能与试剂盒的检测技术原理不同，引物、探针设计和扩增体系存在差异有关，造成对弱阳性样本的检出能力不同［5,

6］。需要说明的是，本研究中采用的冻存临床样本，包括一定数量的弱阳性样本，样本冻融过程中也会引起一定的降解，因此弱阳性样本的数量可能多于临床实际情况。本研究结果提示，在应用2019-nCoV核酸快速检测试剂盒前，应对整个快速检测系统进行性能验证，确保其检测限达到≤500拷贝/ml的水平［7］，并应注意采用弱阳性质控品进行质控，监测是否存在假阴性问题。本研究发现部分试剂盒的阴性符合率未达到100%，有4种试剂盒在2个检测机构出现了假阳性结果。由于本研究采用的样本是剩余样本，分析在使用快检试剂盒进行核酸提取和扩增过程中可能存在阳性扩增产物污染，包括在样本提取中实验室环境、对照品及质控品的交叉污染［8］。因此，在使用核酸快检试剂盒时，应注意临床实验室的环境清洁和消毒，避免样品间交叉污染，并妥善保存和处理对照品及质控品，避免假阳性的结果出现。另外，5种快检试剂盒之间的检测原理存在差异，引物设计引起的非特异性扩增也有可能导致检测结果假阳性［9］，但还需进一步验证。在检测时间方面，5种核酸快检试剂盒明显快于常规核酸检测试剂，大约30~60min即可完成从样本提取、核酸扩增和结果判读全过程。上述快检试剂盒的检测时间与国外多数核酸快速检测产品耗时相当，但长于国外少数快检产品，如雅培的IDNow检测系统（5~13min）。相较于传统实时定量PCR检测方法，更短的检测时间对于发热门诊和急诊患者的快速筛查、发现并控制疫情非常重要。本研究还发现5种快检试剂盒均有不同程度的复检率，主要原因包括单靶标阳性和质控异常，这对于临床结果的确认和检测周转时间影响较大，可能是由于试剂盒采用的不同靶标基因的扩增效率不同，相互竞争所致［10］。另外这5种试剂盒都是双靶标检测试剂，每个靶标基因的扩增效率不同，多个靶标之间相互竞争，可能会引起单靶标阳性结果［8，10］，可通过进一步优化核酸扩增反应体系来降低复检率。建议临床实验室应备有至少另外一种2019-nCoV核酸检测试剂，用于复查单靶标阳性标本，确保检测结果的及时性和准确性。此外，由于本研