基因治疗2014-1224课件

基因治疗朱平北京大学第一医院一、基因治疗的发展由于人类的大多数疾病与基因的变异有关，随着大量致病的突变基因被发现，基因克隆技术和基因转移手段日益成熟，基因治疗被认为是治愈疾病的最佳方式。

尽管真核细胞对抗外源的DNA有很多防御机制，大片密实的异染色质成为天然的屏障，1980年代就有报告提出，病毒可以作为传递基因的工具。我们经过临床观察发现致病基因的例证：

原发性血小板增多症转化为急性髓细胞白血病的克隆演变过程（中国实验血液学杂志2012）

病例147岁，男，因“发热并全身关节疼痛”1周。几年前曾诊断为原发性血小板增多症，JAK2突变，予以羟基脲、干扰素a-2b等药物治疗。入院时轻度贫血貌，血常规：WBC1.95×109/L，RBC2.46×1012/L，HGB90g/L，PLT251×109/L。骨髓确诊急性髓细胞白血病。

对ET患者做单细胞全基因组外显子测序，发现有不同恶性细胞同时存在多种基因突变的时期，其中一个细胞群有明显的生长优势（克隆演化）。

82个恶性细胞18个突变的候选基因全世界的基因治疗Bubbleboy病毒载体Miller设计的逆转录病毒载体是第一个被用于临床试验的载体。载体用包装细胞株扩增，避免病毒产物的重组产生复制能力。加入包装信号，改良滴度，获得更多的载体。逆转录病毒(RV)

RNA病毒

优点：1）能高效感染宿主细胞

2）可整合宿主染色体，随细胞

分裂而传代；

缺点：1）携带基因容量有限；

2）影响插入点附近的基因过度

表达或失活

3）只感染正在分裂的细胞；

腺相关病毒（AAV）

需要腺病毒的帮助才可以进行复制。可以转染分裂和非分裂细胞，定点整合于宿主细胞染色体上。微小的病毒颗粒可以逃避宿主的免疫监视，不易引起免疫反应。慢病毒载体（Lentivirus）

人类免疫缺陷病毒（HIV）含三个

结构基因（gag、pol、env）和

六个调控基因（tat、rev、vpr、

vpu、nef、vif）。构建重组病毒

载体时，仅保留LTR、包装信号

和gag部分序列，病毒结构蛋白则由辅助病毒提供。

LV可在多种非分裂细胞进行高效的转染和长期稳定的基因表达，包括造血干细胞，以及终末分化的细胞，如神经元，肌肉细胞和肝细胞等。物理方法做基因转移

包括磷酸钙共沉淀、显微注射法、微粒轰击法（Particalbombardment）、电穿孔、脂质体法及利用细胞受体介导的基因转移技术。

基因的电转移基因枪三、临床开始了基因治疗早在1989NIH核准5位患者输入基因标记的TIL细胞，检测到遗传标记细胞在血液和肿瘤组织出现。这一研究证实了反转录病毒基因转移进行人类基因治疗的可行性和基本的安全性。首例基因治疗

1990年Blease,Culver和Anderson

治疗腺苷酸脱氨酶（ADA）缺陷病。

取4岁女孩患者淋巴细胞将ADA基因体外导入激活的T淋巴细胞，再输回体内，患者免疫功能明显提高。

20％ADA活性已足够避免发病。纠正的少许细胞已可缓解疾病。1、可能进行基因治疗的遗传病

以替代疗法为主

腺苷酸脱氨酶缺乏病（ADA）囊性纤维瘤（CF）血友病甲血友病乙地中海贫血血红蛋白病a抗胰蛋白血症家族性高胆固醇血症（FH）高雪病（GD）I型高血氨病白细胞粘附缺陷病（LAD）慢性肉芽肿病（CGD）亨特综合征，进行性肌营养不良。

考虑以下几个因素：

1）对致病基因有较详细的了解，能在实验室克隆出来，并在真核细胞中表达；

2）只须产生较少量的基因产物就能改善症状；

3）即使导入基因过量表达，对机体也无不良影响。

基因治疗的选择X连锁铁粒幼细胞贫血（XLSA）。XLSA系红系特异性δ-氨基γ-酮戊二酸合成酶2（ALAS-2）基因突变所致，ALAS-2基因定位于X染色体上。XLSA晚期多并发严重的继发性血色病，大量铁沉积造成成年后糖尿病、肝硬化、心肌变性等致命性并发症。患者贫血较重，不能采用放血疗法。基因治疗则有可能成为一种有前途的治疗手段。

我们的基因治疗探索遗传性铁粒幼细胞贫血（老哥俩和小哥俩的故事）

张姓小哥俩铁粒幼细胞家系的SSCP图

外祖父外祖母父亲母亲哥哥弟弟正常脐血基因治疗程序患者或者监护人知情同意上报审批体外试验对患者进行含ALAS2基因的质粒表达载体直接骨髓内注射。观察患者HGB情况四、基因治疗的挫折

过度免疫反应，

发生了急性白血病

首例基因治疗的死亡病例

18岁患有先天性酶缺陷的Gelsinger不幸成为第一例基因治疗死亡病例（1999年9月17日）。

在宾西法尼亚大学接受以腺病毒为载体的基因治疗。通过肝动脉注射了大剂量的病毒载体。

注射后几小时患者体温升高达摄氏40.7℃，第二天出现昏迷。透析治疗并使用呼吸机，但肺水肿，血氧浓度降低，注射后4天死亡。

主治大夫宾西法尼亚大学Wilson解释：

给患者注射的病毒载体到达肝细胞不会大于1%。并未达到致死剂量。患者骨髓红系造血极度衰竭，可能合并有其他的遗传疾病，或者同时伴有微小病毒的感染，二者都会触发很强的免疫反应。

德国研究者将与腺病毒具有相同蛋白质外壳的病毒加入18个人类血样中，触发了强烈的补体系统的反应。认为Gelsinger接受的病毒注射剂量将会提高补体浓度并触发免疫反应。

患者在基因治疗之前曾经有胸部感染，所以补体系统可能已经致敏，病毒的外壳蛋白质可以在血循环里与抗体结合，形成复合物，激活补体，引起肝脏，肺和肾脏的血管壁的炎性反应，最终导致多器官衰竭。

腺病毒触发免疫反应

美国FDA取消了Wilson从事任何临床实验的资格。还一度停止了宾西法尼亚大学研究所的所有基因治疗临床实验，包括对黑色素瘤、乳腺癌、囊性纤维化、肌营养不良、神经胶质瘤的治疗。

Gelsinger去世是基因治疗临床研究最大打击

白血病发生也在打击基因治疗

法国方案治疗的11例患儿里，最初发现一名患儿的T细胞数显著增加，而且是单克隆增生。后被确诊为T细胞白血病，检查发现Moloney逆转录病毒载体插入了11号染色体LMO2基因的编码区，此基因的产物是血细胞早期发育所必须的。ChristofVonKalleofCincinnatiChildren'sHospitaldiscoveredthattheretroviralvectorusedintheFrenchtrialhadinsertedintomorethan40sitesinthegenomeofdifferentrepopulatingcells.IntheT-cellclonethatgrewabnormally,thevectorhadinsertedintheLMO-2oncogeneonchromosome11—ageneoriginallyidentifiedasabreakpointofatranslocationthatcausesatypeofT-cellleukemia.Theretrovirusinsertionappearedtohavecausedincreasedexpressionofthegene.

逆转录病毒载体导致了白血病

X-SCID治疗后的2到6年的时间，法国4名儿童发生白血病，英国1名儿童出现了T细胞增殖克隆。

发生白血病的原因是：

MLV的LTR使宿主细胞的原癌基因上调。γ-逆转录病毒载体自然的插入活化基因，病毒LTR区强劲的增强子可使得附近的启动子引起基因不正常的表达。

基因治疗还需要解决下列问题：

不恰当的基因整合，

外源基因引起的免疫反应，

基因载体转染效率太低，

都困扰着这一领域的发展。准妈妈怀孕8个月被查出患白血病坚持生下双胞胎2014年12月01日15:48来源:法制晚报去年年底，26岁的周洁怀孕了，还是双胞胎，这让周洁一家欣喜若狂。就在她怀孕8个月时却被查出患有白血病，这突如其来的消息让周洁备受打击。休息一会儿五、慢病毒载体带来新的希望

以前认为逆转录病毒或者腺病毒更安全，这些病毒不感染人类，不会导致人类疾病，最早的病毒改造载体是以鼠源的白血病病毒（MurineLeukaemiaVirusMo-MLV)为基础。

现在认为，最好使用那些分子生物和病理特性都十分清晰地病毒，最好有可用的药物治疗，可以控制病毒载体可能引起的免疫和炎症反应。

方芳朱平：慢病毒载体的改进为基因治疗带来了新的希望中国实验血液学杂志2013,21（5）：1336-1339HIV改造的慢病毒载体(lenteviralvector)

提高安全性，过去2个质粒分装到4个质粒

1）表达工具和反式序列

2）组装质粒，编码形成病毒颗粒的蛋白

3）Rev序列质粒

4）编码病毒的衣壳蛋白质粒

慢病毒载体的改进慢病毒载体4个质粒一同转染到T293细胞中，使其大量增殖。最终获得大量表达质粒。转染靶细胞时仅使用表达质粒。绝缘体

Nienhuis和Rivella等分别设计了一种绝缘体（insular），位于载体中目的基因的两侧，使得慢病毒载体携带的基因插入到指定位置后，也只能表达目的基因，不会因为插入到原癌基因附近导致其激活。

六、应用慢病毒载体临床试验

1.慢病毒载体治疗HIV感染患者（Levine等）

5名患者之前接受过4到6个不等疗程的抗病毒治疗失败。他们使用的载体命名VRX496，它包含HIV的LTR全长，同时表达937碱基的反义基因。通过反义链与HIV的RNA结合，抑制HIV的复制。

输入10*109的转染T细胞，患者体内持续存在。4名观察到针对HIV的细胞免疫。4年随访中，没有发生白血病或者其他严重的与基因治疗相关的不良事件。3名患者在之后的2年时间里可以检测到转染细胞，部分病人观察到一过性的病毒负荷减低，都没有不正常的细胞增殖。

2.慢病毒载体用于地中海贫血和镰状细胞贫血

因为患者需要不断地输血治疗，因此临床观察就有必要区分是转染基因的表达还是输血治疗效果。因此Bank以及Cavazzana-Calvo等对人类β-球蛋白87位密码子进行点突变，构建LentiGlobin慢病毒载体。

3名患者加入到这个临床试验。其中2名患者基因治疗已经5年了。平均每个骨髓CD34+中可以含有0.6个载体，血红蛋白维持在9~10g/dl,大约1/3来源于Hb-βat87Q,1/3是HbE，1/3是HbF。不用输血治疗，红系增生一直保持活跃状态。3.慢病毒载体用于X连锁的肾上腺脑白质营养不良

一种致命性的中枢神经系统脱髓鞘疾病，编码ALD蛋白的ABCD1发生基因突变，缺乏ADL蛋白干扰细胞髓磷脂代谢，大多于青少年期死亡。

Cartier等对两名ALD患者做了慢病毒介导的造血干细胞（HSC）做基因治疗。

两名患者分别为7.5岁和７岁，注射G-CSF后分离外周血CD34+细胞，转染慢病毒载体（CG1711hALD），清骨髓治疗后输注。

两例患者的输入的CD34+细胞中50％和33％表达ALD蛋白。在转染的５天后蛋白就表现出酶活性。９个月或12个月CT证实这种脱髓鞘损害信号消失。

导入细胞毒T细胞，导入抑癌基因、导入反义核酸、导入HLA/B7共刺激分子、导入自杀基因、导入多药耐药基因。4.肿瘤的基因治疗类型包括：

七、改造淋巴细胞基因做免疫治疗1.淋巴细胞输注治疗的来源获得淋巴细胞自身，供者（DLI），GVHD抗原刺激淋巴细胞合成多肽，基因疫苗改造淋巴细胞转T细胞受体基因外周血采集细胞用于免疫治疗（邢艳平等LMP2混合肽负载树突状细胞与EB病毒感染患者外周血单个核细胞共培养产生识别EB病毒抗原的T细胞

中国实验血液学杂志

2008，16（2）:392-396）诱导T淋巴细胞和NK细胞

EBV-淋巴瘤中国人多见。迄今没有很好的治疗方法。我们发现许多母子体细胞存在微嵌合状态，给一批确诊EBV相关淋巴瘤输注母亲淋巴细胞，一周左右获得明显临床症状及病毒学指标的改善，无一例发生明显GVHD。

大剂量母亲淋巴细胞输注（NIMA）可作为一种有效治疗儿童EB病毒相关淋巴瘤的有效手段。

2.用母亲淋巴细胞输注的“NIMA”

疗法BCAAtypicalTlymphocyteinfiltration(Hematoxylin-eosinstain;originalmagnification20×10)ImmunohistochemistrystaindemonstratestumorcellsexpressingCD3(originalmagnification20×10)Insituhybridization:EBER(+)实时定量PCR检测InDel多态性位点：

13/46(28%母子对可以检出)ChildMother

美国血液学年会报告，BLOOD2010发表。

2.寻找并且人工合成相应的抗原多肽激活淋巴细胞

已经应用的抗原肽包括：

白血病HLA相关肽：BCR/ABL，PML/RARa，NPM1；

次要组织相容抗原肽ACC1HA1；

病毒抗原混合肽：CMV，EBV。

我们在不同B淋巴瘤亚基因家族的IgHV编码基因上找到了12个高亲和力的抗原９肽。用抗原9肽刺激的CTL输注给接种淋巴瘤的小鼠，CTL可以特异性识别和杀灭表达同样IgHV亚家族淋巴瘤。

（LiuH,CaiP,LiuHX,WangJL,LiuQ,ZhuP.Vaccinationwithimmunoglobulinframeregion-derivednonapeptideelicitscellularimmuneresponseagainstlymphomainhumanleukocyteantigen-A2.1transgenicmice.LeukLymphoma.2011Sep;52(9):1795-802.）

用这些抗原9肽刺激获得的CTL输注给接种淋巴瘤的小鼠，CTL可以特异性识别和杀灭表达同样IgHV亚家族淋巴瘤。

鼠脾脏细胞Elispot结果

实验组PBS+BSA组PBS组（LiuHui

etal.LeukLymphoma.2011Sep;52(9):1795-802.）

Pentamertest判断特异性淋巴细胞的数量

确定抗肿瘤淋巴细胞克隆，

用基因扫描方式分析了T细胞克隆的TCR特征，

克隆TCR片段，

组装完整的TCR在淋巴细胞表面表达，

大量扩增改造的淋巴细胞

输注给患者。

3.转TCR基因改造淋巴细胞做免疫治疗TCR转基因改造方法：T细胞受体基因扫描（genescan)和T细胞受体基因谱型图（Spectrotyping)抗TCRBV的单克隆抗体分离淋巴细胞（FACS）HLA/epitope/Pentamer(tetramer)T细胞γ-干扰素分泌水平（ELISpot）T细胞杀伤功能（FATAL）FR1CDR1FR3FR2CDR3CDR2DJC正常人T细胞受体β链可变区(TCRBV)

24家族克隆分布

TCRBV24基因家族流式细胞分析TCR24家族流式细胞术寻找杀伤细胞克隆确定单克隆T淋巴细胞

我们获得一个白血病病例T细胞优势克隆的

1条关键的TCRBV序列和3条TCRAV序列

患者优势T细胞克隆为TCRBV13.1

优势T细胞克隆得到TCRA1,TCRA10和TCRA243个序列,转染淋巴细胞后组成了改造淋巴细胞表面的TCRαβ2聚体。

TCRAV1家族测序图TCRAV10家族测序图TCRAV24家族测序图

将患者疾病相关T细胞克隆的TCRαβ序列克隆到基因载体。用电转移法转染正常T细胞和Jurkat细胞,培养并扩增。获得能够识别肿瘤特异性抗原肽的转基因CTL细胞。

转TCR基因淋巴细胞转T细胞受体基因改造的一例

移植后白血病体内供者的淋巴细胞

（XingHai-zhouetal.Clin.Lab.2014;60）Clin.Lab.2014;60ORIGINALARTICLE

DonorLymphocytesmayAcquireCytolyticSpecificitytoDonor’sEngraftedHematopoieticCellsafteraHemato