新版《医院消毒卫生标准-》修订交流分享(实验部分)1课件

中华人民共和国国家标准公告2012年第13号关于批准发布《三相异步电动机试验方法》等352项国家标准和45项国家标准样品的公告国家质量监督检验检疫总局、国家标准化管理委员会批准《三相异步电动机试验方法》等352项国家标准和45项国家标准样品，现予以公布。二○一二年六月二十九日序号标准号标准名称代替标准号实施日期63

GB15982-2012

医院消毒卫生标准

GB15982-1995

2012-11-01附录A：采样及检查方法采样和检查原则；空气微生物污染检查法；物体表面微生物污染检方法；医务人员手卫生检查方法；医疗器材检查方法；消毒剂检查方法；治疗用水检查方法；紫外线灯检查方法；消毒器械检查方法；医院污水检查方法；疫点（区）消毒效果检测方法；大肠菌群检查方法；沙门菌检查方法；乙型溶血性链球菌检查方法；铜绿假单胞菌检查方法；金黄色葡萄球菌检查方法；其他目标微生物检查方法。A1采样和检查原则采样后应尽快对样品进行相应指标的检测，送检时间不得超过4h；若样品保存于0℃～4℃时，送检时间不得超过24h。不推荐医院常规开展灭菌物品的无菌检查，当流行病学调查怀疑医院感染事件与灭菌物品有关时，进行相应物品的无菌检查。常规监督检查可不进行致病性微生物检测，涉及疑似医院感染暴发、医院感染暴发调查或工作中怀疑微生物污染时，应进行目标微生物的检测。可使用经验证的现场快速检测仪器进行环境、物体表面等微生物污染情况和医疗器材清洁度的监督筛查；也可用于医院清洗效果检查和清洗程序的评价和验证。A3物体表面污染检查方法1、采样时间潜在污染区、污染区消毒后采样。清洁区根据现场情况确定。2、采样面积被采表面＜100cm2，取全部表面；被采表面≥100cm2，取100cm2。采样方法用5cm×5cm灭菌规格板放在被检物体表面，用浸有无菌PBS或生理盐水采样液的棉拭子1支，在规格板内横竖往返各涂抹5次，并随之转动棉拭子，连续采样1～4个规格板面积，剪去手接触部分，将棉拭子放入装有10mL采样液的试管中送检。门把手等小型物体则采用棉拭子直接涂抹物体采样。若采样物体表面有消毒剂残留时，采样液应含相应中和剂。3、检测方法把采样管充分振荡后，取不同稀释倍数的洗脱液1.0mL接种平皿，将冷至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基每皿倾注15mL～20mL，36℃±1℃恒温箱培养48h，计数菌落数，必要时分离致病性微生物。手、物表采样液吐温－80（2%）20g卵磷脂（0.3%）3g硫代硫酸钠（5H2O）（0.5%）7.85g蛋白胨10g氯化钠8.5gPBS1000ml最终pH7.2～7.4

手机采样方法决定检测结果！棉签涂擦法不能体现手机的无菌性！3、牙科手机：应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中，将每支手机分别置于含20mL～25mL采样液的无菌大试管（内径25mm）中，液面高度应大于4.0cm，于旋涡混合器上洗涤震荡30s以上，取洗脱液进行无菌检查。消毒后内镜采样方法取清洗消毒后内镜，采用无菌注射器抽取50mL含相应中和剂的洗脱液，从活检口注入冲洗内镜管路，并全量收集（可使用MODELBL100型蠕动泵【1.0～100.0转/min】）送检。将洗脱液充分混匀，取洗脱液1.0mL接种平皿，将冷至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基每皿倾注15mL～20mL，36℃±1℃恒温箱培养48h，计数菌落数（cfu/件）。将剩余洗脱液在无菌条件下采用滤膜（0.45μm）过滤浓缩，将滤膜接种于凝固的营养琼脂平板上（注意不要产生气泡），置36℃±1℃温箱培养48h，计数菌落数。采样前准备无菌手套，80ML容量的螺口瓶及中和剂。采样前需要瓶口酒精灯烧灼消毒。抽取中和剂，需要用50ＭＬ的一次性注射器抽取，注意无菌操作。将中和剂从内镜注水口缓缓注入，避免喷溅，注意无菌操作，手不能接触到“推柱”内侧。

同时将出水端放入螺口瓶中，注意不要污染。盖上盖子前仍酒精灯瓶口烧灼再旋紧盖子，及时送检。123456A6消毒剂检查方法1、消毒剂采样分库存消毒剂和使用中消毒液。2、消毒剂有效成分含量检查方法库存消毒剂的有效成分含量应依照《消毒技术规范》或产品企业标准进行检测；使用中消毒液的有效浓度测定可用前述方法，也可使用经国家卫生行政部门批准的消毒剂浓度试纸（卡）进行监测。3、使用中消毒液染菌量检查方法用无菌吸管按无菌操作方法吸取1.0mL被检消毒液，加入9mL中和剂中混匀；醇类与酚类消毒剂用普通营养肉汤中和，含氯消毒剂、含碘消毒剂和过氧化物消毒剂用含0.1%硫代硫酸钠中和剂，洗必泰、季铵盐类消毒剂用含0.3%（W/V）吐温80和0.3%卵磷脂中和剂，醛类消毒剂用0.3%甘氨酸中和剂，有表面活性剂的各种复方消毒剂可在中和剂中加吐温80至3%（W/V）；也可使用该消毒剂消毒效果检测的中和剂鉴定实验确定的中和剂。用无菌吸管吸取一定稀释比例的中和后混合液1.0mL接种平皿，将冷至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基每皿倾注15mL～20mL，36℃±1℃恒温箱培养72h，计数菌落数；必要时分离致病性微生物。消毒液染菌量(cfu/mL)＝平均每皿菌落数×10×稀释倍数(A.6)使用中消毒液采样液吐温－80（3%）30g卵磷脂（0.3%）3g硫代硫酸钠（5H2O）（0.5%）7.85g甘氨酸（0.5%）5g营养肉汤1000ml调节pH7.2～7.4A7治疗用水检查方法血液透析相关治疗用水按YY0572《血液透析和相关治疗用水》进行检测。1、试样应在收集后30min内进行检测，或立即放在1℃～5℃下储存，24h内检测。2、应采用倾注平板法细菌总数计数。培养基应为胰蛋白酶大豆琼脂或等价物，35℃～37℃培养48h，48h后若呈阴性可72h后再检查。也可采用膜过滤技术滤除500mL～1000mL水,并在R2A低营养琼脂培养基上,可28℃～32℃下培养5d或更长时间。3、应用鲎试剂法检查内毒素。其他治疗用水参照相关标准执行。口腔诊疗冲洗用水等。

细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素检查包括两种方法：凝胶法：系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。光度测定法：浊度法/显色基质法

供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。

细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。细菌内毒素国家标准品（RSE）系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。细菌内毒素工作标准品(CSE)系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。细菌内毒素标准品：

细菌内毒素检查用水：系指内毒素含量小于0.015EU／ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度侧定法）且对内毒素试验无干扰作用的灭菌注射用水。试验所用的器皿：需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上)去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。供试品溶液的制备：一般要求供试品溶液的pH值在6.0～8.0的范围内。对于过酸、过碱或本身有缓冲能力的供试品，需调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，可使用酸、碱溶液或适宜的缓冲液调节pH值。酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。

确定最大有效稀释倍数（MVD）

最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数(1→MVD)，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD:MVD=cL/λ式中L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度c=λ/L；λ为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度〔EU/ml),或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。计算举例：当L以EU/ml表示时，则C等于1.0ml/ml

适用于供试品为溶液状态，并且规定限值为应小于xxEU/ml。例：计算限值为2.0EU/ml，使用灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂进行检验，则

MVD=1.0ml/ml2.0EU/ml÷0.25EU/ml=8倍

鲎试剂灵敏度复核试验

：在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。

结果判断：将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转l80°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。

当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效．按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。

λc＝lg-1（∑X/4)式中

X为反应终点浓度的对数值（lg）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。

当λc在0.5λ～2λ(包括0.5λ～2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。内毒素浓度2λλ0.5λ0.25λ阴性对照终点鲎试剂

λ平行管

λ

0.5λ

0.5λλc=lg-1（(lgλ+lgλ+lg0.5λ+lg0.5λ)/4)=0.707λ

干扰试验

：按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

表1凝胶法干扰试验溶液的制备编号内毒素浓度/被加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液——————2B2λ/供试品溶液供试品溶液12λ421λ440.5λ480.25λ4C2λ/检查用水检查用水12λ421λ440.5λ480.25λ4D无/检查用水——————2

注：A为供试品溶液；B为干扰试剂系列；C鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）:Es=lg-1（∑Xs/4）Et=lg-1（∑Xt:/4）式中XsXt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（lg）。当Es在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）及Et在0.5Es～2Es（包括0.5Es和2Es）时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。内毒素浓度

2.0λλ0.5λ0.25λ终点供试品阴性对照（溶液A）

内毒素/供试品溶液（系列溶液B）

λλλλ内毒素/检查用水（系列溶液C）λλ2.0λ2.0λ阴性对照（溶液D）

Es=lg-1(ΣXs/4)=λEt=lg-1(ΣXt/4)=1.41λ

凝胶限度试验

：按表2制备溶液A、B、C和D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。

表2凝胶限度试验溶液的制备编号内毒素浓度／被加入内毒家的溶液平行管数A无／供试品溶液2B2λ／供试品溶液2C2λ／检查用水2D无／检查用水2注：A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照。

结果判断

：保温60分钟±2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。

供试品溶液供试品阳性对照阳性对照阴性对照

若溶液A的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定；若溶液A的两个平行管均为阳性，判定供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定；否则判定供试品不符合规定。供试品溶液供试品阳性对照阳性对照阴性对照供试品溶液供试品阳性对照阳性对照阴性对照符合规定不符合规定供试品溶液供试品阳性对照阳性对照阴性对照须复试供试品溶液供试品阳性对照阳性对照阴性对照复试时，供试品溶液需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判供试品符合规定；否则判供试品不符合规定。

凝胶半定量试验

：本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。按表3制备溶液A、B、C和D。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。表3凝胶半定量试验溶液的制备编号内毒素浓度/被加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液检查用水1——22——24——28——2B2λ/供试品溶液12λ2C2λ/检查用水检查用水12λ221λ240.5λ280.25λ2D无/检查用水——————2注：A为不超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液。从通过干扰试验的稀释倍数开始用检查用水稀释至1倍、2倍、4倍和8倍，最后的稀释倍数不得超过MVD；B为2λ浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照）；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。

结果判断

若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，系列溶液C的反应终点浓度的几何平均值在0.5λ～2λ之间，试验有效。系列溶液A中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以λ，为每个系列的反应终点浓度，所有平行管反应终点浓度的几何平均值即为供试品溶液的内毒素浓度[按公式cE=lg-1（∑X/2）]。如果检验时采用的是供试品的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。

如试验中供试品溶液的所有平行管均为阴性，应记为内毒素浓度小于λ（