454测序平台介绍

课程对象：核酸生产中心员工

课程目的：帮助授课对象了解454测序平台的大致工作原理学习方式：阅读、自学参考课时：1小时温馨提示：完成本课程的学习有4个条件：1、浏览完所有的页面；

2、达到测试分数线；3、浏览完所有的交互页面；4、在学习中途或完成学习后需要退出课程时，请务必点击学习界面右上角的“退出”按钮退出。12课程简介第一页，共32页。课程大纲1.454测序平台概述2.454文库制备操作流程简介3.454乳化PCR流程简介4.454测序仪操作和数据质控简介5.454的主要项目应用第二页，共32页。1.1454测序系统概述2005年，454生命技术公司（后被Roche诊断收购）推出基于焦磷酸测序法的高通量测序仪GS20System，此举被认为是第二代测序技术进入商品化应用的开端。从2005年至2011年，Roche/454先后推出了GS20，GSFLX，GSFLXTitanium，GSJunior，GSFLX+等测序仪和试剂版本，数据读长，产能和质量不断上升。目前华大基因所用的454测序仪为2011年中推出的GSFLX+测序平台。第三页，共32页。1.2GSFLX+测序仪系统表现GXFLX+测序仪测序试剂版本XL+XLR70最大读长可达1000bp可达600bp读长期望700bp450bp数据产出~85%数据量来自读长>500bpread~85%数据量来自读长>300bpread~45%数据量来自读长>700bpread~25%数据量来自读长>500bpread通量700Mb450MbRead产出1MShotgunreads1MShotgunreads运转周期23小时10小时第四页，共32页。2.0454测序实验流程概述DNA文库制备（4小时）乳化PCR/模板富集（1天）测序（2小时准备，10/23小时上机）第五页，共32页。2.1454快速DNA文库制备流程末端修复加A接头连接磁珠选择第六页，共32页。2.1.1雾化法打断基因组DNA如图所示的雾化打断杯，在一个标准大气压（15psi，101.3kPa）氮气雾化打断1分钟，回收打断后DNA并用QIAGEN纯化柱进行纯化。雾化第七页，共32页。2.1.2DNA的末端修复和加A末端修复

加A依赖T4DNA聚合酶的5’-3’聚合酶活性，5’-3’外切酶活性和3’-5’外切酶活性补平DNA片段的末端。依靠T4PNK酶使得被修复末端5’端磷酸化。依靠TaqDNA聚合酶使平末端加A第八页，共32页。2.1.3接头连接和片段选择接头连接纯化和片段选择经过末端修复和加A步骤后的DNA片段和带有T尾的Y型分子接头连接形成连接产物，连接产物在AmpureXP磁珠和经过特殊处理的盐溶液共同作用下进行纯化，并筛选掉片段大小低于650bp的DNA片段。第九页，共32页。2.2454快速DNA文库质控

依赖固定在454接头上的FAM荧光标记分子，测定文库的荧光强度，并同线性的标准品浓度曲线进行回归分析判定分子浓度。TFAM依靠高灵敏度的Agilent2100DNAHS芯片判定PCR-free的DNA文库片段大小分布，尽可能减少650bp以下的小片段对测序的不利影响。第十页，共32页。2.3454扩增子文库实验流程蓝色序列：454的A,B测序引物序列红色序列：4碱基的文库key序列用于区分样品和对照序列金色序列：MID（即index）序列，用于区分不同样品绿色序列：研究目标区域（如16SrRNA基因可变区，HLA）上下游的保守序列依照上述图示设计融合引物并对基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物使用1.6倍AgencourtAmpureXPbeads纯化，即获得所需的扩增子文库用于后续测序。第十一页，共32页。3.1454乳化PCR实验流程概述乳化反应体系制备（2小时）PCR（9小时）模板磁珠富集（5小时）通过将固定了测序引物的微珠掺入PCR体系，并和矿物油混合并高速震荡，获得“油包水”的乳化PCR反应体系，理想的乳化PCR反应体系中，每个水滴都是一个仅含有一个微珠和一条模板的独立PCR体系，经过50个循环的扩增后，每个微珠都将生成数十万条固定化的单克隆模板，用于后续的富集和测序。第十二页，共32页。3.2通过高速震荡制备乳化PCR体系使用QIAGEN组织匀浆机高速震荡使得水相的PCR体系和矿物油充分混合形成油包水的乳化PCR体系。高倍显微镜下混合完成的乳化PCR体系第十三页，共32页。3.3乳化PCR扩增

将乳化的PCR体系等体积分装至96孔板（100μL/孔），在PCR仪上过夜扩增。一般每4个PCR板回收得到的模板珠可满足一个454测序RUN。第十四页，共32页。3.4模板珠的富集空载珠富集磁珠模板珠磁力架使用固定有测序引物的富集磁珠和扩增成功的模板磁珠进行杂交，并通过磁力回收富集磁珠-模板珠混合物，并通过氢氧化钠变性使得回收的模板珠和富集磁珠分离，得到纯度较高的富集珠用于测序。第十五页，共32页。4.1454测序仪的结构试剂区用户界面化学反应和成像区主输液系统第十六页，共32页。4.2454测序芯片的结构454测序芯片上均匀分布有直径为29微米的微孔，而乳液PCR所用微珠直径为20微米，这样的设计可保证每个微孔最多会装载一颗模板微珠。第十七页，共32页。4.3454测序芯片的制备5minPPiaseBeads5minEnzymeBeadPostlayer10minDNABeadsAndPackingBeads5minEnzymeBeadsPrelayer5minBB2第十八页，共32页。4.4454测序芯片的装载第十九页，共32页。4.5测序试剂的装载第二十页，共32页。4.6测序模式选择测序试剂版本选择测序芯片模式选择第二十一页，共32页。4.7454测序反应原理每合成1分子的核苷酸，即释放1分子焦磷酸（PPi），后者和过硫胺（APS）在硫酸化酶（Sulfurylase）催化下释放出ATP，ATP提供能量使得荧光素（luciferin）在酶催化下氧化并释放出光信号被CCD识别，从而完成一个循环的测序反应。第二十二页，共32页。4.8454图形数据处理图形处理FLX+原始图形输出图形处理输出文件信号处理D_..imageProcesssing

regions/1.cwfgsRunProcessor.logD_..fullProcessingregions/1.cwfsff/*.sffgsRunProcessor.logMetricsfiles-*.csv,*.txt,*.fna,*.qual第二十三页，共32页。4.9454测序信号均一化分析正常异常第二十四页，共32页。4.10454BaseCalling根据信号归一化分析结果，计算每个cycle碱基信号当量，生成序列文件。第二十五页，共32页。4.11454测序数据质控数据产量和质量统计读长分布统计质量值分布统计第二十六页，共32页。4.12454GSFLX+XL+质控标准质控点5.合格指标读长产出平均值>420bp质量值平均值>20数据产量（Mb/run）>500第二十七页，共32页。5

454测序仪的应用范围454测序系统相对于Hiseq，SOLiD等第二代测序平台，拥有快速和长度长的核心竞争优势，所以454测序系统在其他测序平台可运转的应用类型至于，特别适合于基因组的从头组装以及环境基因组（Meta-genomics）等需求长读长测序数据的研究应用。454测序数据可以单独分析，也可以和短读长测序数据进行协同分析，使得研究目的更易实现并做到成本最优化。第二十八页，共32页。5.1从头组装的优势轻松覆盖短读长测序无法覆盖的GapXL+长读长数据XLR70短读长数据各关键指标显示同样的数据量，长读长数据拥有更好的组装效果第二十九页，共32页。5.2

对环境样品分辨能力更高模拟数据分析证明，超过300bp读长的16SrRNA基因可变区扩增子测序数据在进行环境基因组样品物种组成分析时拥有无可比拟的准确率，这是当前的