分子病毒学讲义RNAiandVirology

思考题什么是基因沉默(genesilencing)?什么是siRNA、RNAi？举例说明RNAi在医学病毒学中有哪些应用？1RNA干扰

在病毒学研究中的应用

2009.3.12医学分子微生物学2主要内容RNAi的概念发现作用机制特点在医学病毒学领域的应用3定义基因沉默(genesilencing)指生物体特定基因由于种种原因不能表达。RNA干扰

（RNAinterference，RNAi）4基因沉默基因沉默分为两种：

转录水平的基因沉默(TranscriptionalGeneSilencing,TGS)

指基因在细胞核内RNA合成受阻导致基因沉默

转录后水平的基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing,PTGS)

指基因在细胞核内能稳定转录，在胞浆内却无相应的mRNA存在的现象。5定义RNAi由dsRNA介导的有特定酶参与的特异性基因沉默现象。（RNAiisdsRNA-inducedgenesilencing.）RNAi主要属于转录后水平的基因沉默(PTGS)RNA干扰

（RNAinterference，RNAi）6RNAi现象是生物普遍存在基因转录后沉默的一种方式，是RNA水平上调节基因表达的方式，是生物界古老而且进化上高度保守的现象之一；RNAi能高效特异的阻断基因的表达；已经证实植物中的转录后基因沉默（PTGS）、共抑制（cosuppression）及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑制（quelling）现象均属于RNAi在不同物种的表现形式。在基因表达调控和基因功能研究中发挥重要作用，在药物靶基因的筛选、抗病毒、肿瘤基因治疗等领域有很好的发展前景。

7RNAi的发现

90年代初，RichJorgensen的设想

---发现“共抑制”现象(cosuppression)×8RichJorgensen：“cosuppression”9RNAi的发现

1992年，Romano和Macino等证明真菌也有类似现象

---基因压制

(“quelling”inNeurospora

crassa)1995年，SuGuo和kemphues的秀丽线虫(C.elegans)实验

---表明RNA干扰现象的存在1998年，AndrewZ.Fire等明确了dsRNA介导的RNAi现象；1999年，Hunter等印证了Fire等提出的RNAi现象是dsRNA引起的结论；

1011DiscoveryofRNAidsRNAinjectC.elegansWt,Notstained

Wt,

UninjectedWt+AntisenseRNAWt+dsRNAsenseantisenseMex-3mRNAdetectioninembryosbyinsituhybridization12RNAi的作用机制

长链dsRNA在ATP参与下，被“Dicer”酶切割成20~25nt的

siRNA(smallinterferingRNA);

☻“Dicer”酶：RNA酶Ⅲ家族核酸酶，依赖ATP核酸内切酶；

☻Dicer作用底物：长度200～500nt左右的dsRNA；

☻Dicer作用后的产物：dsRNA经切割后形成21～25nt的siRNA；

RNA诱导的沉默复合体

(RISC，RNA-inducedsilencing

complex)识别并降解靶mRNA;

☻RISC组成：siRNA、解旋酶、核酸内切酶、核酸外切酶、ATP等；

RNAi的放大效应；13RNAi的作用机制

(RISC)RNAi的放大效应14siRNAsstructure19ntduplex2nt3’overhangs特点：5’末端为pi，3’末端为-OH，并且有2个突出的单链核苷酸15Tuschl,2002theantisensestrandofthesiRNAguidescleavagesteptwo:16RNAi的特点转录后水平的基因沉默(PTGS)特异性高高效性需要ATP

可遗传性及远距离效应17RNAi的应用基因功能的研究疾病的治疗cancerviralinfectionparasiticinfectiongeneticdisease18研究基因的功能：简单有效代替基因敲除(knockout)的遗传工具“剔降”(knockdown)

防御病毒感染：研究发现，利用siRNAs可有效抑制病毒复制或阻止病毒的侵染，为进一步治疗病毒性疾病奠定了基础。

HIV、肝炎病毒、疱疹病毒、登革病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、HPV-16等。RNAi在病毒学研究中的应用19RNAi与HIV－靶向病毒RNA的RNAi机制：

－沉默与HIV复制密切相关的细胞因子的表达：如：CD4受体和CCR5/CXCR4联合受体的mRNAs

TheHumanImmunodeficiencyVirus(HIV)LifeCycleandRNAInterference.20HIV基因结构21RNAi与HIVSuppressionofCXCR4bysiRNA

22RNAi与肝炎病毒HBV：Shlomai和Shaul将HBV的X-siRNA和core-siRNA转染Huh7细胞，转染后，细胞内HBV的产生减少了20倍。HCV：针对HCVRNA的siRNA转染细胞4天后，可使细胞质中复制的HCVRNA降低80倍。

RNAi与流感病毒Ge等针对流感病毒的不同基因设计了20种siRNA，结果以核蛋白(NP)和RNA聚合酶(PA)基因的siRNA对流感病毒感染有抑制作用。RNAi与其它病毒针对脊髓灰质炎病毒中编码衣壳蛋白、病毒聚合酶的mRNA的siRNA，可以抑制病毒复制，加速清