链激酶的研究进展课件

链激酶的研究进展一、背景血栓栓塞性疾病的致残率和病死率都很高,严重威胁人类生命和健康。溶栓治疗是治疗血栓疾病的有效手段,因此溶栓药物的研究进展非常迅速,大致有三个阶段:(1)第一代溶栓剂:以链激酶、尿激酶为代表,第一代溶栓剂在临床治疗中的应用使血栓性疾病的病死率明显降低,但它们存在着许多的缺点,主要是没有溶栓特异性,过多的降解了纤维蛋白原,导致出血等严重不良反应。(2)第二代溶栓剂:以组织纤溶酶原激活剂和单链尿激酶为代表,两者均有一定程度的纤维蛋白特异性,但它们依然存在半衰期短等缺点。二、链激酶简介链激酶(streptokinase，SK)是由溶血性链球菌的A、C、G族产生的机体由血纤维蛋白酶原(plasminogen，Pg)最有效的活化剂之一。SK是一个单链蛋白质，耐热，100℃50min处理后仍能保持其活性；分子量为47—50．2kD。由414个氨基酸组成，其中N一端230个氨基酸残基与胰蛋白酶具有同源性，不过SK并不具有活性丝氨酸残基位点，因而授有胰蛋白酶的典塑性质。实际上，SK并不是酶，它对人Pg的活化作用是间接的。只有病原性的A、C、G族链球菌的染色体上才具有SK基因。并不是所有的A族都能产生有活性的细胞外sK蛋白。不同来源的SK基因具有广泛的异源性，A族和C族链球菌的SK基因在棱苷酸序列上只具有90%的同源性。即使在同一族内(A族)相同和不同血清塑菌株间也有显著的异源性。这种基因水平上的异源性导致了蛋白质水平上免疫学和化学性质的差异性。链激酶的研究历史1933年Tillett等发现β-溶血性链球菌的培养滤液能产生一种可以溶解人血凝块的物质。1945年Christensen等发现该物质能激活纤维蛋白酶原转变为纤维蛋白酶,因而命名为链激酶。1972年Reddy阐明了SK的作用机理。1984年,Malke等从C.S.equisimilis中克隆得到了skc的基因。1995年Young等发现切除SK分子N端的15个氨基酸后比整个长链的SK分子更容易在大肠杆菌中表达。2003年LakshmiV等对SK的氨基末端的159残基进行了研究分析,结果表明SK在无纤维蛋白作用下通过非蛋白质水解来激活底物Pg。2005年RonaldRBean等研究了SK的α区域的作用,它能激活Pg中的Glu,Lys及Pm的Lys荧光素标记。链激酶的作用原理是激酶能将纤溶酶原激活为纤溶酶,使具有丝氨酸蛋白酶活性的纤溶酶能降解构成血栓骨架的纤维蛋白,从而起到溶解血栓的作用。链激酶不能直接使纤溶酶原激活,而是和Pg形成1:1的等分子复合物,使纤溶酶原发生构象改变,从而暴露出活性部位,该活性部位催化纤溶酶原转变为纤溶酶。纤溶酶有两个作用:一是迅速降解纤维蛋白原成小分子产物,这些降解产物不能参与血纤维网的形成从而阻碍血栓的形成;二是纤溶酶可以直接降解纤维蛋白,引起血栓溶解。四、链激酶的修饰Pizzo用羰基二酰亚胺唑(1，1，_carbonyldiimidzazole)活化PEG，然后将其偶联到sK蛋白Lys残基的ε-NH2上，反应机制如下图：五、重组链激酶及其三种突变体的活性研究

（1）SK及其三种突变体基因的克隆（2）SK及其三种突变体在大肠杆菌中的表达的表达及其分离纯化（3）SK及其突变体的活性比较（1）野生型SK基因的克隆根据已经发表的SK基因设计引物，对链球菌基因组进行PCR增,测序获得ska基因序列，根据测得ska序列设计引物进行PCR，产物经电泳分离纯化后,直接连接到pGEM-T质粒上,大量扩增后再用NdeI/BamHI切下ska,连接到经同样酶切的pET-15b上,构建表达野生型SK的表达质粒pSK,酶切鉴定。表达SKΔC42质粒的构建

根据所测ska的序列设计引物通过PCR扩增出编删除SKC-末端的42个氨基酸残基所得的突变体(SKΔC42)的基因skaΔC42,克隆pGEM-T载体上,再用NdeI/BamHI从上切下该基因,并连接到pET-15b上,构建表达SKΔC42的表达质粒pSKΔC42。表达SK-K59E和SKΔC42K59E的表达载体的构建

根据所测序列设计引物，分别通过PCR扩增出C-末端编码区和删除编码C-末端42氨基酸残基ska片段,两个片段PCR产物分别连接到pGEM-T质粒上,构建pGEM-T-SKLK59E和pGEM-TSKSK59E,连在pGEM-T-SKLK59E质粒上的ska片段中编码Lys59的密码子AAA突变成了编码Glu的GAA,连在pGEM-T-SKLK59E质粒上的ska片段中编码Lys59的密码子AAA突变成了编码Glu的GAA且删除了C-末端42个氨基酸残基的编码区,将这两个片段从上述两个质粒上用AflII与BamHI切下,分别连接到经同样酶切过的pSKΔC42及pSK上,分别构建表达SK-K59E、SKΔC42K59E的表达质粒pSK-K59E及pSKΔC42K59E。结果表明重组SK、SKΔC42、SK-K59E、SKΔC42K59E分别占大肠杆菌总蛋白的45%、44%、44%、46%，由此可见,无论是C-末端删除还是K59突变成E59,都不影响SK或其突变体(SKΔC42、SK-K59E、SKΔC42K59E)在大肠杆菌中的表达量。（3）SK及其突变体的活性比较

对纯化的重组SK、SKΔC42、SK-K59E、SKΔC42K59E的活性测定表明,各1nmol的以上四种蛋白在2h内水解酪蛋白形成的透明圈的直径都是2cm,说明以上SK及其突变体具有同样的活性,且与等摩尔的链激酶标准品活性相同。这说明删除C末端的42个氨基酸残基或将K59突变成E59或者同时删除C末端的42个氨基酸残基并将K59突变成E59三种突变并不影响SK的活性。六、不同链激酶的比较天然的SK价格低廉,但是由于该酶是从病原性溶血链球菌发酵而得,所以有一定的抗原性,对人体具有副作用易于引起全身纤溶从而增加出血的危险,此外制备中残存的细菌溶血素对心肌和肝脏都有损害。基因重组的链激酶(recombinantstreptokinase,r-SK)的抗原性弱于天然的链激酶(由C型β-溶血性链球菌提取),因此利用基因工程技术在E.coli中表达链激酶(r-SK)避免了使用致病性溶血链球菌可能带来的危害,