DB42T1843-2022牛结核病多方法联合诊断规程

ICS65.020CCSB10

DB42湖 北 省 地 方 标 准DB42/T1843—2022牛结核病多方法联合诊断规程Codeofpracticeofmultiplediagnostictestsforbovinetuberculosis20222022032320220523湖北省市场监督管理局发布目次前言 III引言 V1范围 12规性用件 13术和义 14缩语 15单内态和ELISA抗检法合 26ELISA体测和IFN-γ外放联合 27单内态应比皮内态应合 38单内态和IFN-γ外放联合 49临剖和或菌和PCR检分法合 410物全作求 6前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由湖北省农业农村厅归口。本文件起草单位：华中农业大学、湖北劲牛牧业有限公司、高安市裕丰农牧有限公司。本文件实施应用中的疑问，可咨询湖北省农业农村厅，联系电话bsnab@126.com；对本文件的有关修改意见建议请联系华中农业大学，电话邮箱：chenyingyu@。引 言（BovineTuberculosis）（2012-2020年（、IFN-γELISAPCRhELISAPCR为了在现有技术条件下提升牛结核病检测的敏感性和特异性，最大限度地减少假阳性牛错杀和假阴为了在现有技术条件下提升牛结核病检测的敏感性和特异性，最大限度地减少假阳性牛错杀和假阴结核病多方法联合诊断规程范围本文件规定了牛结核病多方法联合诊断规程中的单皮内变态反应和ELISA抗体检测法联合、ELISA抗体检测法和IFN-γ体外释放法联合、单皮内变态反应和比较皮内变态反应联合、单皮内变态反应和IFN-γ体外释放法联合、临床剖检和/或细菌培养和PCR检测分型法联合以及生物安全要求等。本文件适用于牛结核病检疫、监测和净化过程中的诊断。（GB/T18088GB/T18645-2020GB19489GB/T32945-2016牛结核病诊断体外检测γ干扰素法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。GB/T32945-2016牛结核病诊断体外检测γ干扰素法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1牛结核病bovinetuberculosis3.2个体流行率individualprevalence一段时间内某群体中患病的动物总数与同时间该群体暴露动物数之比。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DMSO：二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide）ELISA：酶联免疫吸附测定（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay）IFN-γ：伽马干扰素（Interferon-γ）PCR：多聚酶链式反应（PolymeraseChainReaction）单皮内变态反应和ELISA同时具备临床检测和实验室检测操作条件，且牛结核病个体流行率小于3%的场群。按照GB/T18645-2020中6.3.1（检ELISA单皮试法检测为阳性，或ELISA抗体检测法检测为阳性的牛均判为结核阳性。ELISA单皮试法和ELISA抗体检测法联合诊断流程如图1所示。图1单皮内变态反应和抗体检测法联合诊断流程图6ELISA抗体检测法和IFN-γ体外释放法联合具备实验室检测操作条件，且牛结核病个体流行率小于3%的场群。ELISA32945-2016中4.3IFN-γELISA抗体检测法检测为阳性，或IFN-γ体外释放法检测为阳性的牛均判为结核阳性。ELISAIFN-γELISA抗体检测法和IFN-γ体外释放法联合诊断流程如图2所示。图2ELISAIFN-γ不具备实验室检测操作条件，且牛结核病个体流行率大于等于3%的场群。按照GB/T18645-2020中6.3.1GB/T18645-2020中6.3.1检单皮试法和比较皮试法检测均为阳性的牛判为结核阳性。单皮内变态反应和比较皮内变态反应联合诊断流程如图3所示。图3单皮内变态反应和比较皮内变态反应联合诊断流程图单皮内变态反应和IFN-γ牛场具备实验室检测操作条件，且牛结核病个体流行率大于等于3%的场群。按照GB/T18645-2020中6.3.1GB/T32945-20164.3IFN-γ单皮试法和IFN-γ体外释放法检测均为阳性的牛判为结核阳性。单皮内变态反应和IFN-γ单皮试法结合IFN-γ体外释放法检测联合诊断流程如图4所示。图4单皮内变态反应和IFN-γ体外释放法联合诊断流程图9临床剖检和/或细菌培养和PCR检测分型法联合屠宰场宰杀牛或病死牛，或需要进行牛结核病临床剖检、细菌培养或PCR检测分型的牛。GB/T27639-20117PCRPCR牛结核病细菌分离培养工作需要在生物安全三级实验室进行。按照GB/T18645-2020动物结核病诊断技术中步骤5.5进行牛结核病细菌的分离培养。PCR依照商品化核酸提取试剂盒的使用说明进行样本的处理，并提取组织内核酸，直接用于PCR检测或储存于-80℃条件下备用。PCRPCRPCR表16SrRNARv0577IS1561、Rv1510、Rv1970、Rv3877/8和Rv3120PCRPCR个PCR1～72×TaqMixture12.5μL，模板1μL1～710各1μL1～7PCR25μLPCR将本文件中7个PCR反应管放置于PCR仪中，设定反应程序进行扩增：94℃10min，进入循环扩增阶段：94℃1min，60℃1min，72℃1min，循环30次，最终72℃10min。PCR核酸序列引物1（16SrRNA）上游引物5’-ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3’下游引物5’-TCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCA-3’引物2（Rv0577）上游引物5’-ATGCCCAAGAGAAGCGAATACAGGCAA-3’下游引物5’-CTATTGCTGCGGTGCGGGCTTCAA-3’引物3（IS1561）上游引物5’-GCTGGGTGGGCCCTGGAATACGTGAACTCT-3’下游引物5’-AACTGCTCACCCTGGCCACCACCATTGACT-3’引物4（Rv1510）上游引物5’-GTGCGCTCCACCCAAATAGTTGC-3’下游引物5’-TGTCGACCTGGGGCACAAATCAGTC-3’引物5（Rv1970）上游引物5’-GCGCAGCTGCCGGATGTCAAC-3’下游引物5’-CGCCGGCAGCCTCACGAAATG-3’引物6（Rv3877/8）上游引物5’-CGACGGGTCTGACGGCCAAACTCATC-3’；下游引物5’-CTTGCTCGGTGGCCGGTTTTTCAGC-3’引物7（Rv3120）上游引物5’-GTCGGCGATAGACCATGAGTCCGTCTCCAT-3’下游引物5’-GCGAAAAGTGGGCGGATGCCAGAATAGT-3’将PCR1，120V，100mA30min1-7PCR和4041～7号管PCR号PCRPCR表2PCRPCR结果记录结果判定引物1引物2引物3引物4引物5引物6引物7PCR产物+------分枝杆菌属+++++++结核分枝杆菌+++--+-牛分枝杆菌++++-+-山羊分枝杆菌+++----牛分枝杆菌卡介苗-------分枝杆菌属阴性9.3结果判定临床剖检有疑似结核结节，且PCR检测和分型结果为阳性的牛判为结核阳性。9.4临床剖检和/或细菌培养和