分子生物学-细胞信号转导

CellularSignal 第一节

细胞间信息物质signal细胞内信息物质signal一、细胞间信息物细胞间信息物质是由细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质的统称，又称作第一信使(firstExtracellularsignal

(Localchemical气体信号(Gaseoussignal)：NO细胞间信息物endocrine激paracrine细胞因子,生长因子,NO,CO, synaptic(intracellularsignal（second

G蛋白(G-信号酶各种蛋白激酶(protein网络构成基础：蛋白质分子和小分子活性质蛋白质分子的细胞内水平调信号转导分子（signal信号转导网络的结构基础（效应分子）是一些关键的蛋白质和一些小分子活性物质。其中的蛋白质被称为信号转导分子，小分子活性物质被称为第二蛋白激酶（proteinkinase）：能够将蛋白激酶分蛋白丝/苏氨酸激酶-丝/苏氨酸的羟蛋白酪氨酸激酶-酪氨酸的酚羟蛋白组/赖/精氨酸激酶-咪唑环、胍基、氨蛋白半胱氨酸激酶-巯蛋白天冬氨酸/谷氨酸激酶-酰蛋白激酶分类（根据细胞定位蛋白磷酸酶（proteinphosphatase）调控结合元件(modular)SH2结构域信号分子与含磷酸酪氨酸蛋白分SH3结构域信号分子与含脯氨酸蛋白分PH结构域磷脂分子PIP2、PTB结构域同SH2磷酸酪一个信号分子含两种以上的结合元同一调控元件可存在多种不同的信号转导分结构域本身均为非催化结构一、受体的概位于细胞膜或细胞内的能特异识别和结合信息分子，并引起生物学效应的一类生物大分子。配体（ligand）特异识别并结合受体，引高度亲高度特可逆可饱和放大效二、受细胞膜受体(membranereceptor)：细胞内受体(intracellularreceptor)：(DNAbindingG蛋白偶联受G-proteincoupled配体门控离子通道受Ligand-gatedionchannel单个跨膜α螺旋受Singletransmembraneα-helix鸟苷酸环化酶活性受guanylatecyclase(GC)active*7α螺旋(α-guanylatebindingprotein,G-GGTPGDP，亚基G蛋有两种构象活化型——-GTP（催化亚基（调节亚基）非活化型——-GDP※G-*激动型G蛋白（stimulatoryGprotein，Gs）抑制型G蛋白（inhibitoryGprotein，Gi）磷脂酶C型G蛋白（PI-PLCGprotein，Gq）G G

G

G效应蛋白

G效应蛋白此类受体的信号传导归激 受Ｇ蛋 第二信蛋白激酶或其他功能蛋生物学效 组中存在17个Gα 个Gβ 和12个Gγ 组中存在着至少800个编码G蛋白偶联受体（Gprotein-coupledreceptors，GPCRs）的 ligand-gatedionchannelreceptor**催化型受体（catalytic(tyrosineproteinkinaseTPK)活性,可催化自身或其他底物蛋白磷酸化胰岛素受体，表皮生长因子*（non-catalytic膜受体(membrane*三聚体或四聚*心钠肽（ANP）和鸟苷蛋白等通过此起胞浆受体(cytosol*由α、β亚基组成的异源二聚*大部分为可溶性受*配体NO、CO（二）细胞内受功能多为转录因子，与相应配体结合后， 配体类固醇激素、甲状腺素、维甲酸、维生素受体的结高度可变 DNA结合 含有锌指结激素结合 常含有与SV40常含有与SV40T抗原核定位信核受体结构及作用机制示意 *高度特异**（receptor*up *down 胞内受体的信号转离子通道受体的信号转G蛋白偶联受体的信号转 单次跨膜受体的信号转 TGF受体途径第三节信息的转导途径signaltransduction）第二信使Second（一）cAMP-cAMP-proteinkinase激动型G抑制型GproteinkinaseAcAMP的合成与分

（-磷酸二酯

5´-

cAMP的作用机理——PKA的激cAMP作用于cAMP（cAMP-dependentprotein（proteinkinaseA，PKA）2．cAMP的作用机理——PKA的激 cAMP-蛋白激酶途R

磷酸二酯

蛋白激酶酶磷酸

膜通透性

信息效PKA被激活后使糖原分解；②糖原合成细胞核内受cAMP、PKA诱导称为cAMP效应元件（CRE），能识有活有活无活受 受 体

ATPMg酸化酶b酸化酶b酸化酶b激无活性无活性磷酸化酶糖

ATPMg

有活性磷酸化酶a-葡萄（二）Ca2+－依赖性蛋白激酶途组成胞外信息分子，G蛋磷脂酶C(phospholipaseC,二酰甘油(diacylglycerol,三磷酸肌醇inositol145triphosphateIP3蛋白激酶C(proteinkinaseC(1)DAG，IP3(磷脂酰肌醇4,5-二磷酸

DAG+DAG、IP3结合，促使细胞内Ca2+释放*PKC的生理功 调节代活化的PC引起一系列靶蛋白的丝、苏氨酸残基磷酸化。靶蛋白包括：质膜受体、膜蛋白和多种酶②调 表PKC对 PKC 的早期活化和晚期活蛋白、Ca2+/CaM依赖蛋白激酶钙调蛋白(calmodulin,CaM)分子中含有四个结构域，都可结合Ca2+(每个CaM实际可结合4个Ca2+)，CaM构象胞外血管紧张素

磷脂酶受质磷脂酶受胞

内质

钙调蛋白蛋白 磷酸蛋白生理效其他生理效（三）cGMP-※组受体配体G-鸟苷酸环化酶(guanylatecyclasecGMP(second蛋白激酶G(proteinkinase※cGMP的合成和降

Ca2+Ca2+

5´-membranereceptor：**α,β*激动剂R 蛋 磷酸化

NNH

NONNH2O2

(C2)-

NO合酶

(C2)

2H2-CH-COON3精氨

CH-COON3瓜氨NO合酶(nitricoxidesynthaseNOsignaltransductionNObinds GCsolublePKGactivationPhosphorylationofForexample:（三）酪氨酸蛋白激(tyrosineproteinkinase,（erb-B、kit、fins等）编码的受 1.受体型TPK-Ras-MAPK途组成：催化性受体，GRB2SOS,Ras蛋白,GRB2(growthfactorreceptorboundproteinSH2域(srchomology 与原癌src编码的酪氨酸蛋白激酶区同源，Ras蛋白：原 SOSsonofsevenless，交换因子MAPK(mitogen-activatedprotein包括MAPK、MAPK激酶（MAPKK）、MAPKK激酶（MAPKKK），是一组酶兼底物细胞外信EGF、PDGF具TPK活性的受二聚

反式反式作用因 核调 表

P调节其他蛋白活EGFR介导的信号转导如骨骼肌细胞的乙酰胆碱受体。类固醇激甲状腺激 G

例迷走神经兴奋→AchGK＋通道开放→膜超极化（三）G蛋白通PLC的信号转导机G蛋白激活PLC，PLC催化膜磷脂PIP2IP3DAG两种第二信使，再分别调节细胞中a2＋的浓度和PKC的活性细胞凋亡：由 信号诱发的受调节的细胞死亡过程,是细胞生理性 细胞增殖：通过细胞 增加细胞数量的过程。细胞分化：一个尚未特化的细胞发育出特征性结构和功能的过程。PI3K-Akt-mTOR这些变化并非都是的，通常要几种信号结合起来才反应，而且通过细胞信号转导的基本规（一）信号转导的速（二）信号的放大、抑制和拮（三）信号转导的正负反（四）信号转导通路的通用性和特异（五）不同信号转导通路的交叉联细胞信号转导的基本规一．影响信号转导速率的因素配体门控的离子通道受体1受体到效应器中间环节的多少的影

中间分子相互碰撞的速

本身是离子通道受体配特点：信号转导速度极快G蛋白偶联受体：代谢型受体,受体激活通过G蛋白-效应酶-胞内第二信使信号二．信号的放大、抑信号转导的步骤越多，活化分子的的放耦联型受体介导的信号转导过程是的放MAPK级联反应也是一个典型的级联反应过程。因此也具有一定的级联放大作用。但是与G蛋白偶联型受体系细胞内的信号级联放大作受体水平的抑制和拮制与拮

G蛋白水平的抑制与拮蛋白激酶和磷酸23G蛋白或小G412三．信号转导的正负反态和信号转导能力的，称为负反馈作用，反之则称为正反馈。正反馈信号转导的正反馈多见于肿瘤，这种正反馈作用是肿瘤细胞恶性增殖的重要原因之一负反馈RasRafMAPK通路,酪氨酸蛋白激酶通过激活Ras激活该通路，反过来，激活的MAPK能磷Raf通用性：一种信号转导蛋白可以在不同的信号转导通路中起作用，或不同的受体能利用同一条信号转导通性.a.细胞信号转导分子组成和分布的多样性或不均位，这就决定了信号转导成分的多样性和组成多种信b.信号分子的连接机制不c.信号转导蛋白的时相性或调节性表达 细胞整合信号的方式主要有3信号转导与疾 肥胖→胰岛素受体功能霍乱毒活化状态，腺苷酸环化 性活化 百日咳毒素作百日咳毒素能催化Gi发生ADP度升高。导致患儿阵发性痉挛性咳嗽即百日咳霍乱患者具有特征性水样腹泻，从而导致脱水和代谢性 等系列变化。霍乱弧菌附 于小肠中，分泌的外毒素，是产生这些变化的主要因素脂溶性长链的基嵌在胞膜中，糖则 于胞表面，与霍乱肠毒迅速紧密而不可逆地结合在一起。的亚单位与M1结合后，亚单位得以穿入细胞膜。作为第一信使，引起 素PG等，第二信使的合成与释放增加。G使腺苷酸环化酶活性增高，催P使之转化为环苷酸MP，第三信，从而细胞膜内MP大量增加，促进细胞内一系列酶反应的进行，促使细胞分泌功能增强，细胞内水及电解质大量分泌。MP浓度增加抑制了肠绒对钠的吸收并主动分泌氯化钠，导致水及电解质大量丧失。一旦M结合，则述反应 ，其作的自然持时间泻时间）在临 可短至数小时或长～日。病理VSMC：合成表型，分泌激素，自身肥大、增（二）机械刺激的感受1、离子通2、整合3、机械刺激的信号转导途1、磷脂酶2MAPKs联级反3长因子分细胞损伤和应激反应中的信号转 34研究策略：共变法（Methodofitantvariations），抗剂）、DNA定点突变、转动物与稳定转染细胞、删除与RNA干蛋白质表达水平和细胞内定位研究二．蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术三．磷酸化蛋白质研究方法信号蛋白分子表达水平及分子量检Westernblot，FACS（流式细胞），IF（免疫荧光信号蛋白分子在细胞内定位研Greenfluorescentprotein—typically,live二．蛋白质与蛋白质相互作用的研究技Co-IP（免疫共沉淀）：用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与GSTpull-downassay：GST（GlutathioneStransferase，谷胱甘肽巯基转移酶）亲和层析和GSTPull-down方法此方法的基本原理是：利用重组技术将探针蛋白与GST（GlutathioneStransferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的Yeastormammaliantwo-hybirdassay（Double phospho-SDS-Phosphopeptideandphosphoaminoacidysisbymassspectrophotometric（光谱分析 磷酸化的信号转导分子的鉴它们分别由不同的蛋白激酶所催化。这些磷酸化蛋白通常都为信号转导分子，在信号传递过程中发挥重要的作用。含酪氨酸磷酸化的蛋白鉴通常是首先分离粗提蛋白，采用针对含这些氨基酸残基磷酸化蛋白单克隆抗体进免疫沉淀(mmunoprecipitatio),SDAGE电泳，然而采Wetrnbltingimmuobotng鉴定其分子量，进一步利用分子生物学技术克隆信号蛋白，搞清其 结构和氨基酸序列。信号转导中第二信使含量的测［Ca2+］：Ca2+原子吸收光谱法、离子微电极测定法、放射示踪qui-2/Am、Fura2/Am及Indo1Fura-2/AmIdo1I3（三磷酸肌醇）：3HdR的肌醇标记靶细胞，刺激剂刺激细胞，分离磷脂收集I3洗脱峰后进行液闪测定。信号转导中第二信使含量的测DAG（甘油二脂）的测定首先提取含DAG的样 32γ-ATP，最后将反应产物进行分离后测定射性含量，根据标准品计算出样品中DAG的含cAMP的测定可选择不同的方法：(1)统，用于小量样品的分析；(3)cAMPELISA测激酶活性的测对这些激酶活性的测定可以作为信号转导研究中的一种重要指标。KKC及I3K均有商品化的试剂盒。激酶可以催化特定底物发生磷酸化32γAPKC从胞质向胞膜的转位是PKC，因而分离胞质和胞膜中的PKCKC活性占总PKCKC的活化程度。TyrosineKinaseAssayApplicationsSignaltransductionresearchdrugNonradioactivedetectionoftyrosineHigh-throughput tativemeasurementofinhibitorIC50valuesScreeningofnoveltyrosinekinase细胞核转录因子的分离和鉴信号转导的结果是细胞核内一些转录因子DNA上某些特定的序列结合，调节转录活性和的表达水平。因而分离鉴定细胞内核子在信号转导研究中具有独特的意根据核转录因子可一些特定的核苷酸序列结合的特点，将其特定的核苷序列标记上同位素，鉴定信号转导中的核转录因子核转录因子具有一些特征性的结构，亮氨酸拉链(uciezipper锌指结zincfinger)螺转-螺旋(heltrnhelix结构。并且采用 法(footprining结合DN的位置和核苷酸序列。药理学