大环内酯类抗生素残留检测课件

大环内酯类抗生素残留检测一、大环内酯类抗生素的概念及应用二、大环内酯类抗生素的理化及药理毒理性质三、大环内酯类抗生素的样品前处理方法四、大环内酯类抗生素的理化检测方法五、大环内酯类抗生素的生物监测方法一、大环内酯类抗生素的概念及应用1、概念：大环内酯类抗生素（macrolides），是一类均具有14～16元大环内脂基本化学结构的抗生素，多为碱性亲脂性化合物，它是通过内酯环上的羟基与去氧氨基糖缩和生成的碱性苷，对革兰氏阳性菌及支原体抑制活性较高。2、分类与应用：常见的大环内酯类抗生素有：红霉素、泰乐菌素、替米考星、吉他霉素、螺旋霉素等。其抗菌特性不仅广泛应用于兽医临床治疗，在人医临床治疗中也有开发许多大环内脂类抗生素的新品种。泰乐菌素〖理化性质〗白色至黄色粉末，易溶与甲醇，微溶于水，在乙醇、丙酮或三氯甲醛中溶解，临床上一般制成酒石酸盐和磷酸盐〖药理作用〗本品为畜禽专用抗生素，对G+菌、支原体、螺旋体等均有抑制作用，对大多数的G-作用较差。此外，本品对牛、猪、鸡还有促生长作用。〖毒理作用〗①牛静脉注射可引起震颤，呼吸困难及精神沉郁等。②肌内注射时可产生较强的局部刺激，可引起兽医接触性皮炎。③不能与聚醚类抗生素合用，因可导致后者毒性增强。替米考星〖理化性质〗白色粉末，易溶于甲醇、乙腈、乙醇，不溶于水〖药理作用〗替米考星具有同大环内酯类药物相似的抗菌活性，为泰乐菌素水解产物的半合成品，对革兰氏阳性菌和一些革兰氏阴性菌及支原体有效。尤其对金黄色葡萄球菌、化脓链球菌、肺炎链球菌、化脓棒状杆菌及畜禽支原体的活性具有比泰乐菌素更强的活性。主要用于防治敏感菌引起的牛肺炎和乳房炎，也用于猪、鸡的支原体病等。〖毒理作用〗替米考星的毒性很低，毒性主要表现在心脏毒性和肾脏毒性，可引起心动过速和收缩力减弱。肌肉注射和皮下注射均可出现局部反应(水肿)，亦不能与眼接触，皮下注射应选在牛肩后肋骨上的区域内。三、大环内酯类抗生素的样品前处理方法样品的处理目的是使样品中大环内酯类药物浓缩，除去其他物质和基质，是目标检测物净化，主要包括3种方法：1、液液萃取2、基质固相分散

3、.固相萃取

1、液液萃取最常用的萃取技术之一。早期，Croteau就采用LLE的方法对对血浆和肝样品中的ERM进行萃取，然后上液相色谱分析。通过比较不同有机溶剂萃取剂效果后发现，叔丁基甲醚和乙醚萃取的回收率最高[4]。Hammel等[1]则采用乙腈等有机溶剂对七种MAL进行了萃取。由于需要耗费大量有机溶剂，对环境不友好。且萃取时间较长。目前LLE在MALs样品前处理中已很少被采应用。越来越多的被固相萃取所代替。3、固相萃取与LLE相比，SPE不需要使用大量有机溶剂。处理过程中不会产生乳化现象。能简化样品的处理过程。缺点是回收率和精密度略低于LLE。尽管如此，SPE仍然是MALs样品前处理中的主流技术。用于净化的柱子有HLB、Strata—X、BondElutdiol、BondElutSCX和C18等。其中。HLB柱用得最多1、高效液相色谱法（HPLC）

由于MALs具有发光团。多数具有较强的UV吸收。因此可用紫外检测器(UV)包括二极管阵列检测器(DAD)对其进行检测。目前该方法已成为大多数实验室MAL残留检测的常用方法。以下为HPLC法对大环内酯类抗生素的分析。2、气相色谱——质谱联用法（LC—MS）MALs的分子量较大。且极性较高。上机前为了降低待测物的极性、提高质谱检测的灵敏度。必须经过衍生化处理。由于操作繁琐．该方法在MALs分析中的应用也不多见。采用电喷雾离子化源，正离子检测方式对各主要成分进行一级全扫描，将对应的准分子离子峰进行二级全扫描质谱分析，通过与对照品的色谱和质谱行为对比，以对MALs残留进行分析。3、薄层色谱分析法TLC是20世纪50年代发展起来的一种色谱技术，具有操作简单、应用性广、灵敏度高、快速和检验成本低的特点，特别适用于无紫外吸收的杂质的检测。现经过改进的TLC采用有利于推广的以甲苯-无水甲醇-吡啶(V(甲苯)/V(甲醇)/V(吡啶)=14/2/1)为展开剂、硅胶H-CMC-Na薄层板、碘熏回视显色的方法进行测定。4、紫外分光光度法该法以正己烷-丙酮(V(正己烷)/V(丙酮)=7/3)作展开剂，在HF254硅胶板上点样展层后，刮取有效斑点，用甲醇溶出，测定的244nm处吸光度，与标准曲线对照求出其含量，工作曲线在10～60μg范围内线性良好，相关系数r=0.9996，平均回收率在99.8%，变异系数小于0.6%。该方法操作较简便，快速、准确。

5、荧光光度测定法在硫酸存在下，四价铈的氧化物与MALs类抗生素发生反应，还原成三价铈，分别在255nm和348nm处测三价铈的荧光，在42.6～1200ng/mL浓度范围内成线性关系，标准加入法测得抗生素的回收率为97.7%～100.9%。6、毛细管电泳一电化学发光联用分析技术（CE—ECL）

毛细管电泳（CE）是一类以毛细管作为分离的通道，以高压直流电场为驱动力，依据被测物在溶液中带电粒子的淌度和分配行为上的差异而实现分离的检测技术。电化学发光（ECL），又称电致化学发光，是化学发光与电化学相结合的产物，是通过施加一定的电压进行电化学反应，在电极表面产生一些电生的物质，然后这些电生物质之间或电生物质与体系中某些组分之间通过电子传递形成激发态，由激发态返回到基态而产生的一种发光现象。1、试样制备

牛奶：取不少于500ml试样，装入清洁容器内，进行标记。

肉类、水产品、动物内脏：从原始样品中取出部分有代表性样品，

将可食部分放入高速组织捣碎机均质，充分混匀，用四分法缩分不少于500g试样。装入清洁容器内，进行标记。

蛋：从原始样品中，随机分出一半（不少500g），鲜蛋需去壳，进行标记。

注：制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。微生物效价法实验方法2、方法提要

试样经压榨得到样液，样液加到含有一定数量的嗜热脂肪芽孢杆菌培养基中，64摄氏度培养3h~4h。利用抗生素对敏感菌的抑制作用来判别试样中是否含有抗生素。培养基：细菌保存及传代培养基、增菌固体培养基、检定培养基

试剂：蒸馏水、溴甲酚紫、甲醇、标准物质泰勒菌素（纯度≧98%）

泰乐菌素标准储备液：100ug/ml。称取标准物质泰乐菌素10.0mg（精确至0.1mg），用甲醇溶解并定容至100ml，得到终浓度为100ug/ml的泰乐菌素标准储备液，置2~8摄氏度冰箱中保存，可使用1个月。

4、测定步骤

肉类、水产品、动物内脏：用肉类榨汁器榨汁，取大约250ul汁液作为待测样液。

蛋：取禽蛋液体至清洁容器中，均质后直接取样。

牛奶：直接取样。菌悬液制备：一般情况下，菌种的传代次数不应超过5代，否则在每次使用前确证其生化特性没有发生变异，或另需购置新的标准菌株。在确定保存的菌种生化特性没有改变后，将复活的菌种分别接种于盛有增菌固体培养基的克氏瓶中，55摄氏度培养72h镜检芽孢数达80%以上（如果达不到，可再培养数日，芽孢数量仍达不到要求，菌种可能变异，不可使用），用灭菌生理盐水洗下菌苔，使其悬浮于生理盐水中，80摄氏度水浴加热30min，2000g离心20min，弃上清液，用灭菌生理盐水重复洗涤芽孢两次。然后用灭菌生理盐水制成菌悬液，用稀释平板计数的方法或比浊法进行菌体计数以确定菌悬液的浓度，菌悬液中菌体细胞的含量应达到1.0×108CFU/ml。置2~8摄氏度冰箱保存，贮存期1个月。检定安瓿的制备

将嗜热脂肪芽孢杆菌菌悬液加入到融化后冷却至60摄氏度左右的灭菌检定培养基中，充分混匀，使培养基中嗜热脂肪芽孢杆菌的浓度达到1.0×106CFU/ml。在灭菌安瓿中加入1ml混合液，保持水平待其凝固。取制备好的检定安瓿，加入100ul0.05ug/ml泰乐菌素标准工作液，室温放置20分钟后，64摄氏度培养3h~4h，琼脂培养基颜色不变色，仍呈现紫色的安瓿为合格，达不到要求的安瓿应弃去。制备好的安瓿置2~8摄氏度冰箱可保存1周。测定

取制备好的检定安瓿，其中一个加100ul0.05ug/ml泰乐菌素标准工作液作为阳性对照，一个加入100ul阴性样品样液作为阴性对照。吸取100ul待测样液加入检定安瓿中，将安瓿放置室温，20分钟预扩散；对于蛋、鱼、肾脏样品，预扩散后，需置于80摄氏度水浴加热10分钟。预扩散后，用蒸