生理指标测定方法

1叶绿素含量测定取样0.2g左右，剪碎，放入黑色胶卷盒中加20ml等量丙酮乙醇混合液（0号调零管：20ml等量丙酮乙醇混合液），48h以后，待材料变白，取上清夜于440、645、663nm处测其OD值。计算：叶绿素a含量=12.7d663-2.69d645叶绿素b含量=22.9d645-4.68d663叶绿素总含量=20.2d645+8.02d663类胡罗卜素含量=4.7d440-0.27（叶绿素a含量+叶绿素b含量）2脯氨酸含量的测定配药：（1）3%磺基水杨酸溶液：6g——200ml（2）2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol/l磷酸经3：2混合，作为溶剂进行配制。冰乙酸90ml85%磷酸（15mol/l）24ml用去离子水定溶至60ml茚三酮3.75g测定：（1）脯氨酸提取：取不同处理的剪碎叶片0.5g，分别置于大试管中，加入5ml%磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10min.（2）取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液2ml，加2ml冰乙酸和3ml显色液（0号调零管：2ml冰乙酸+3ml显色液+2ml去离子水），于沸水浴中加热40min.（3）取出冷却后向各试管加入5ml甲笨充分振荡，以萃取红色物质。静置，待分层后吸取甲笨层，以0号管为对照在波长520nm下比色。计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量。Y=（C*V）/（A*W）式中：C――提取液中脯氨酸含量（由标准曲线求得），ug;提取液总体积，mlA――测定时所吸取的体积，ml;W样品量，g；脯氨酸含量（干重或鲜重），ug/g.SOD,POD,MDA酶和可溶性蛋白质的配药：3个重复，1SOD1pH7.8磷酸缓冲液：（a）14.4gNa2HPO4-12H2O溶于400mL水中取366mL；（b）6.24gNaH2PO4-2H2O溶于400mL水中取34mL;两液混成400mL，即为pH7.8磷酸缓冲液。

104mmol/L蛋氨酸（甲硫氨酸）：称取0.39g蛋氨酸，用蒸馏水定容至25mL容量瓶中300umol/LNBT（氮兰四唑）：称取0.0125gNBT，用蒸馏水定容至50mL.0.8mmol/LEDTA：称取0.012mgEDTA，用蒸馏水定容至50mL容量瓶中(a)(b)反应液：配药用量pH7.8磷酸缓冲液：2ml100ml104mmol/L蛋氨酸（甲硫氨酸）0.5ml25ml300(a)(b)反应液：配药用量pH7.8磷酸缓冲液：2ml100ml104mmol/L蛋氨酸（甲硫氨酸）0.5ml25ml300umol/LNBT(氮兰四唑)1ml50ml0.8mol/LEDTA：0.5ml25ml2POD1pH7.0的10mmol/L磷酸缓冲液称取1.56gNaH2PO4-2H2O,定容于1000ml容量瓶中，取390ml.320uM/L核黄素：称取0.012g核黄素，用蒸馏水定容至100mL容量瓶中称取3.5gNa2HPO4-12H2O定容于1000ml容量瓶中。取610ml.混合后即为1000mlpH7.0的磷酸缓冲液.240mmol/LHO220.3ml-----100ml用蒸馏水配制320mmol/L愈创木酚0.1ml--50ml用蒸馏水配制420%三氯乙酸10g--50ml用蒸馏水配制反应液：配药用量磷酸缓冲液(pH7)愈创木酚40mmol/LH2O22.91ml0.05ml0.02ml291ml5ml2ml(1)10%三氯乙酸(TCA)10g——100ml（2）0.6%硫代巴比妥酸（TBA）先加少量的氢氧化钠（1mol/l）溶解，再用10%的三氯乙酸定溶。0.6g5ml95ml4可溶性蛋白质考马斯亮蓝G-250：称0.1g考马斯亮蓝G—250，溶于50ml90%乙醇中，加85%的磷酸中100ml，最后用蒸馏水定溶至1000ml，贮于棕色瓶中，此溶液常温下可放置一个月。酶液制备：取洗净的鲜材料0.5g置于冰浴的研钵中，先加2mLpH7.8的磷酸缓冲液，充分研磨至无粗纤维为止倒入离心管中，再用3mL（2+1）磷酸缓冲液洗净研钵并入离心管，在10000转离心20分钟，上清液即为SOD、POD粗提液。1SOD测定取4mL反应液，加入50uL的酶提取液再加50uL核黄素，另作6支不加酶液的处理（用缓冲液代替）作为最大光化还原管（0号调零管：pH7.8的磷酸缓冲液），立即置于4000LX的荧光灯（光照培养箱全光照：H1。温度为室温即可）下进行光还原反应，15分钟后，用黑纸遮光，终止反应。并用0号调零管调零点，在560nm波长下比色测定OD值。按下式计算SOD活性。(对照OD值一样品OD值)*样品体积SOD活性=对照OD值*样品鲜重大测定时样品用量POD测定取3mL反应液，加入20uL的酶提取液于小管中，充分混合后，在34C恒温水浴中反应三分钟。然后加20%三氯乙酸20uL，终止酶活性。以pH7.0的磷酸缓冲液调零点，在470nm波长下测其光密度。样品ODPOD的OD值=*稀释倍数MDA测定取酶液2ml加2ml0.6%的TBA于试管中(0号调零管：2ml+2mlTBA)，摇匀后沸水浴中加热15min，冷却后，4000转/分钟，离心10min.取上清液于532、600、450nm处测其OD值，以0号调零管调零。MDA浓度=6.45*(OD532-OD600)-0.56*OD450(pmol・LT)MDA含量=MDA浓度*提取液体积(5ml)/鲜重(0.5g)(pmol/gFW)可溶性蛋白质测定取酶液1ml加5ml考马斯亮蓝G-250于试管中(0号调零管：5ml考马斯亮蓝G-250+1mlpH7.8的磷酸缓冲液)，充分混合，放置15min，.取上清液于于593nm处测其OD值，以5ml考马斯