切片实验理论教程11课件

显微技术简介GeraldKarp,2010分辨率：指分辨物体间最小间隔的能力。R=0.61λ/N．A．其中λ为入射光线波长；N．A．为镜口率＝ｎsinα/2，n=介质折射率；α=镜口角（样品对物镜镜口的张角）。思考：如何提高显微镜的分辨能力？肉眼光学显微镜透射电镜分辨率0.2mm0.2µm0.2nm应用范围可观察头发丝、双面刀刀刃的厚度可观察细胞的结构(最大有效倍数:1000)可观察细胞内的结构,分辨DNA、蛋白质等生物大分子、单个金属原子（放大倍数可达百万倍）观察石蜡切片和半薄切片观察超薄切片电子波性—DeBroglie波1924年，德布罗意提出了运动着的微观粒子（如中子、电子、离子等）也具有波粒二象性假说-运动着的微观粒子也伴随着一个波-物质波或德布罗意波。

静电透镜：与一定形状的光学介质界面（如玻璃凸透镜的旋转对称弯曲折射界面）可以使光线聚焦成像相似，一定形状的等电位曲面族也可使电子束聚焦成像，产生这种旋转对称等电位曲面族的电极装置即为静电透镜。一、光学显微镜术光学显微镜(L.M)Hooke(1665)

用光学显微镜观察软木的结构，首次建立了Cell的名词。镜下结构称光镜（lightmicroscopeLM)结构；

放大倍数1000倍；分辨率0.2μm；组织制成薄片，以利光线通过。显微镜主体CCD或数码相机调节座物镜转换架物镜目镜载物台聚光镜（滤光片）光源开关（滤光片）成像透镜

反射镜或分束镜生物切片计算机图象采集卡视频信号线1.石蜡切片术

(paraffinsectioning)石蜡切片法石蜡切片法是以石蜡作包埋剂，用旋转切片机将材料切成薄片，经一系列处理制成永久制片的方法。在研究植物的细胞、组织、胚胎以及形态等方面石蜡切片法是最理想的制片方法。制片过程（1）取材（1.0cm）

固定(甲醛）酒精脱水（低-高）透明（二甲苯）

浸蜡包埋切片（5－10um）展片；（2）脱蜡（二甲苯）酒精（高-低）水苏木精-伊红染色酒精脱水（低-高）透明（二甲苯）封片（树胶）

固定固定是制片极为关键的一个步骤，制片质量的优劣。除与材料的新鲜程度有关外，还取决于最初的固定是否适当和完全。割取组织块后，应立即进行固定。将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固定液中。借助固定液的作用，使细胞的新陈代谢瞬时停止，并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变化。从而达到使组织变硬从而便于切片、增强内含物的折光度、令细胞易于着色的目的，同时具有防腐作用。以新鲜配制固定液效果较好。固定的时间依材料的种类、性质、大小等而定。材料固定完毕，保存于加盖的容器内，贴上标签。

良好的固定剂，应是穿透力强，使细胞立刻致死，原生质全部凝固；不发生任何变形，增强折光率，并且不妨碍染色。

固定的目的和作用在于：①防止组织自溶和腐败；②使细胞内的蛋白质、糖、脂肪等各种成分沉淀保存下来从而保存细胞的各种组成成分使其保持与生活时相近似的形态和结构；③因沉淀及凝固的关系，使细胞内不同的成分产生不同的折光率，造成光学上的差别使原来在生活情况下看不清楚的结构变得清晰易见，且有的固定剂还有助染作用(如醋酸、苦味酸)，从而使细胞各部易于染色；④固定剂还兼有硬化作用，使柔软组织硬化而不易变形，有利于操作。常用的固定液福尔马林—醋酸—酒精混合固定液（FAA液）是植物制片技术中较为良好的固定液和保存液。除单细胞和丝状藻类外，均可用此液固定．也通用于昆虫和甲壳类的固定。

FAA液配方：福尔马林5m1

冰醋酸5m150％或70％酒精90m1

※一般固定根、茎、叶、花药、子房组织切片。

※幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，防止材料收缩；

※加入5%甘油可防固定液蒸发和材料变硬※预染色

脱水

脱水是用一种即能与水又能与透明液混合的液体来逐渐置换样品中游离的水。现采用的脱水剂一般是丙酮或乙醇进行梯度脱水，脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。脱水的过程：一般是30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%→90%→100%→100%

脱水应逐步而不应跨越太大进行，否则将引起组织强烈的收缩或变形，在经无水乙醇处理时，应保证试剂的纯度。无水酒精往往会含有水分，因此最好能检测一下试剂的纯度。可以用液体比重计来测定，也可以将几毫升酒精滴入几毫升二甲苯或甲苯，如果混合液出现混浊就表示酒精中至少含有2％的水分。

透明

透明是用一种即能与乙醇又能与包埋介质互溶的液体来置换样品中的乙醇，从而为最终的包埋创造一个有利的条件。现采用的透明剂一般是二甲苯，甲苯，氯仿等。其过程为：1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具有渗透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点是易使组织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情而定。

渗蜡

将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合液中，不断提高石蜡的比例，直至用石蜡完全置换了组织块中的透明剂，便于今后的包理与切片。石蜡有液态与固态二种，渗蜡要在恒定温箱（60°c）中进行，以保证石蜡处于液态中。

包埋样品经石蜡渗透后，其内部间隙已完全被石蜡占据，此时还需要用同种硬度的石蜡包埋成蜡块以利于后边的切片，包埋可用相同的器具，也可折叠一牛皮纸盒。将液态石蜡缓缓倒入纸盒中，再用镊子轻轻将浸好蜡的组织块夹入纸盒，摆好位置，待石蜡冷却成固态即包埋完毕。至此，一块组织已完成前处理过程，可以切片，前边的步骤看来既无高深的理论，又无复杂的技术，一切看似简单，但一步做不到都会造成整个制片的前功尽弃。切片修块：切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，从切面看组织周围的石蜡相等。固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台上，以便于固定在切片机上。切片：一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片连成一长条蜡带。切下的蜡带放在一干净黑纸上。贴片：用小刀根据需要切成数段，分别用粘片剂贴在干净载玻片上。在恒温展片台上展平，烘干。贴片指用黏贴剂把切片平铺贴在载玻片上，以便于染色和观察。常用的粘片剂有下列二种：(1)明胶黏片剂(2)蛋清黏片剂1:1的蛋清与甘油

在干净的载玻片上涂粘片剂、加水2-3滴，将检查过的蜡带放置其上，并将载玻片移至烫片箱上，温度为40口左右。干片，40口烘箱烘干2天。

染色剂的分类根据来源分

(l)天然染色剂此类染色剂是从动、植物体中提取的，为天然产物，产量少。目前常用的有苏木精、洋红、地衣红和靛蓝等。其中最常用的为苏木精和洋红。

(2)合成染色剂全是由芳香环或具有芳香性的杂环化合物所构成。最早是由煤焦油蒸馏产物合成而得的，所以又称为煤焦油染料。除上述两类外，在生物染色中还使用一些无机化合物，如硝酸银、氯化金、锇酸等。根据用途分

(l)细胞核染色剂用于细胞核的染色剂有天然染色剂的苏木精、洋红以及合成染色剂中的番红、结品紫、硫堇、甲苯胺蓝、甲基绿、美蓝、孔雀绿和焦油紫等。

(2)细胞质染色剂用于细胞质的染色剂有合成染色剂中的曙红、亮绿、橘黄G、酸性品红、苦味酸和水溶性苯胺蓝等。（3）脂质染色剂用于显示脂质的染色剂有合成染色剂中的苏丹III、苏丹Iv、硫酸尼罗蓝及油红等。细胞壁的染料酸性品红番红固绿甲苯胺蓝苏木精结晶紫亮绿苏丹IV细胞核染料（碱性）碱性品红苏木精洋红番红地衣红结晶紫甲苯胺蓝细胞质染料（酸性）酸性品红曙红固绿苦味酸伊红各种荧光染料染色原则：先用碱性染料染再用酸性染料染染色原理有关染色的理论至今是一个并末完全清楚的很复杂的问题。目前一般还是从物理和化学的作用来解释各种组织或细胞的染色现象。染色的物理作用此理论认为组织细胞的染色是以物理作用为基础的，主要是依靠下列三种物理作用的一种或全部，使染色剂进入组织或细胞内。

(1)毛细管作用及渗透作用，但染色剂与组织细胞没有牢固的结合

(2)吸收作用，又称溶解学说。这种学说认为组织细胞所以能被染色，主要是吸收作用所致。组织吸收染色剂，作牢固的结合。组织的着色与溶液的颜色相同，但不一定和干燥染色剂的颜色相同。

例如，品红溶液为红色，所染组织也为红色，而干燥的品红则为绿色。苏丹类染色剂使脂质着色，是一种溶解现象。因为苏丹类染色剂在脂质中的溶解度大于在酒精等溶剂中的溶解度。当苏丹类的酒精溶液与组织细胞中的脂质接触时染色剂就从酒精中溶解到脂质中，从而使其着色。

(3)吸附作用吸附作用是固体物质的特性，即较大的物体能从周围溶液(染液)中吸附一些小颗粒(化合物或离子)到自身的特性。细胞中各种蛋白质或胶体有不同的吸附面，因此能选择性地吸收不同的离子，即某种蛋白质对某种染色剂有吸附作用,而对别种染色剂无吸附作用，这就可以解释鉴别染色现象。

染色的化学作用化学作用的主要理论根据是染色剂的性质可分为酸性、碱性和中性染色剂，而动、植物的细胞内—般也可区分为酸性(阴离子)和碱性(阳离子)部分。当碱性染色剂溶液中的有色部分成为阳离子时，就能与细胞的阴离子(酸件部分)较牢固地结合，当酸性染色剂溶液中的有色部分成为阴离子时，就能与细胞内的阳离子(碱性部分)较牢固地结合。例如，细胞核，尤其是核内的染色质，主要由核酸组成，是酸性的组成成分．故和碱性染色剂(苏木精)的亲和力很强，易于着色。细胞质含碱性物质，故和酸性染色剂(曙红)的亲和力很大，易于着色。所以，在苏木精—曙红(H.E)染色中，细胞核被碱性染色剂苏木精所染，细胞质被酸性染色剂曙红所染。这也就是细胞核是嗜碱性的，细胞质是嗜酸性的。除染色质外，粘液和软骨的基质等都是嗜碱性的，细胞质内含的某些颗粒也为嗜酸性。须注意的是嗜碱性和嗜酸性是相对而不是绝对的，若细胞在碱性染色剂溶液中停留过久，则细胞质也可染上碱性染色剂的颜色。某些细胞(如血细胞）具有特殊性质，能和中性染色剂发生亲和力而结合。由此可见，细胞各成分的染色强弱是与细胞成分及染色剂的性质有密切关系：两者之间的亲和力强，染色就深；亲和力弱或无，染色也就浅或无。但是，染色的实际情况是极为复杂的，组织细胞的染色作用，还随所用溶液的pH值而变动。染色剂和染色液的配制

Deiafield氏苏木精

苏木精4g

无水酒精25ml10％铵明矾(硫酸铝铵)水溶液400m1

配制时先将苏木精溶于无水酒精，待先全溶解后加入10％铵明矾水溶液，充分搅动混合后，注入细口瓶内，瓶口用纱布封住。然后将瓶置于温暖有光处3—4天后过滤，滤后再加入100m1甘油和100ml甲醇，混合均匀后，瓶口仍用纱布封口，再置于光线充足处1—2月使之成熟。待颜色变成紫褐色时即为成熟。成熟后过滤，塞紧瓶口置于阴凉处贮存，可长期保存，多年不坏。此液着色力较强，染数分钟即可。也可用染液l份加蒸馏水3—5份稀释后使用，染色时间需延长一至数小时。此液染细胞核及嗜碱颗粒效果良好。染植物细胞的纤维壁比用其它任何染液着色更好。H.E染色：苏木精（Hematoxylin）伊红（Eosin）染色碱性染料将嗜碱性物质（本身酸性）染成蓝色酸性染料将嗜酸性物质（本身碱性）染成红色细胞核中的DNA、RNA细胞质中的RNA细胞质、膜性结构（线粒体、溶酶体、滑面内质网）染色方法现象番红－固绿对染法木质化的细胞壁及细胞核－红纤维素的细胞壁及细胞壁－绿铁矾苏木精法细胞一般结构及细胞分裂时期的优良染剂，细胞分裂时期的染色体染成黑色高碘酸－席夫反应法（PAS法）植物组织染成不同程度的红色，可将纤维素细胞壁及淀粉粒染成红色天然染料

1、苏木精（Hematoxylin）苏木精是从南美的苏木（Haematoxyloncampechianum）干枝中用乙醚浸制出来的一种色素，是最常用的染料之一。苏木精不能直接染色，必须暴露在通气的地方，使他变成氧化苏木精（又叫苏木素）后才能使用，这叫做“成熟”。苏木精的“成熟”过程需时较长，配置后时间愈久，染色力愈强。被染材料必须经金属盐作媒剂作用后才有着色力。所以在配制苏木精染剂时都要用媒染剂。常用的媒染剂有硫酸铝按、钾明矾和铁明矾等。苏木精是淡黄色到锈紫色的结晶体，易溶于酒精，微溶于水和甘油，是染细胞核的优良材料，他能把细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色。分化时组织所染的颜色因处理的情况而异，用酸性溶液（如盐酸—酒精）分化后呈红色，水洗后仍恢复青蓝色，用碱性溶液（如氨水）分化后呈蓝色，水洗后呈蓝黑色。

2、洋红（Carmine）洋红又叫胭脂红或卡红。一种热带产的雌性胭脂虫干燥后，磨成粉末，提取出胭脂红，再用明矾处理，除去其中杂质，就制成洋红。单纯的洋红不能染色，要经酸性或碱性溶液溶解后才能染色。常用的酸性溶液有冰醋酸或苦味酸，碱性溶液有氨水、硼砂等。洋红使细胞核的优良染料，染色的标本不易褪色。用作切片或组织块染都适宜，尤其适宜于小型材料的整体染色。用洋红配成的溶液染色后能保持几年。洋红溶液出现浑浊时要过滤后再用。

3、靛蓝洋红（Indigocarmine）是由木蓝（Indigofera）提出的靛蓝（Indigo）加上亚硫酸钠而成。为蓝色酸性染料，作为细胞质的染色剂。常与苦味酸合成苦味酸靛蓝洋红（picro-indigo-carmine），呈绿色，可与碱性品红作对比染色。

4、地衣红（Orcein）是由地衣（Lecanoraparella）中取得的染料，可在酸性或碱性溶液中染色。植物细胞学中应用较多，尤其对于某些植物的染色体染色，效果比醋酸洋红更好。配制方法与洋红相似，通常也多溶入醋酸中（2.2％）染色。现在已多用其人工合成染料。

人工染料人工染料，即苯胺染料或煤焦油染料，种类很多，应用极广。它的缺点是经日光照射容易褪色，苯胺蓝、亮绿、甲基绿等更易褪色。在制片中注意掌握酸碱度，并避免日光直射，也能经几年不褪色。

1、酸性品红（Acidfuchsin）酸性品红是酸性染料，呈红色粉末状，能容于水，略溶于酒精（0.3%）。是良好的细胞制染色剂，在动物制片上应用很广，在植物制片上用来染皮层、髓部等薄壁细胞和纤维素壁。它跟甲基绿同染，能显示线粒体。组织切片在染色前先浸在带酸性的水中，可增强它的染色力。酸性品红容易跟碱起作用，所以染色过度，易在自来水中褪色。

2、刚果红（Congored）刚果红是酸性染料，呈枣红色粉末状，能溶于水喝酒精，遇酸呈蓝色。它能作染料，也用作指示剂。它在植物制片中常作为苏木精或其他细胞染料的衬垫剂。用来染细胞质时，能把胶制或纤维素染成红色。在动物组织制片中用来染神经轴、弹性纤维、胚胎材料等。刚果红可以跟苏木静作二重染色，也可用作类淀粉染色，由于它能溶于水和酒精，所以洗涤和脱水处理要迅速。

3、甲基蓝（Methylblue）甲基蓝是弱酸性染料，能溶于水和酒精。甲基蓝在动植物的制片技术方面应用极广。它跟伊红合用能染神经细胞，也是细菌制片中不可缺少的染料。它的水溶液是原生动物的活体染色剂。甲基蓝极易氧化，因此用它染色后不能长久保存。

4、固绿（Fastgreen）固绿是酸性染料，能溶于水（溶解度为4%）和酒精（溶解度为9%）。固绿是一种染含有浆质的纤维素细胞组织的染色剂，在染细胞和植物组织上应用极广。它和苏木精、番红并列为植物组织学上三中最常用的染料。5．苯胺蓝（Anilineblue）是一种混合酸性染料，平常所用很难有一定的标准。此染料一般很难溶于水，也不易溶于酒精（1.5％）。植物制片中可与番红合用，作为组织染色；也可作藻类植物染色。因为这种染料的成分很不一致，染色效果不易掌握。6、苏丹Ⅲ（SudanⅢ）苏丹Ⅲ是弱酸性染料，不溶解于水，呈红色粉末状，易溶于脂肪和酒精（溶解度为0.15%）。常用70％酒精中的饱和溶液。苏丹Ⅲ是脂肪染色剂。7、苏丹Ⅳ（SudanⅣ）苏丹Ⅳ是弱酸性染料，也是很好的染脂肪染料，现在多用以代替苏丹Ⅲ，可染树脂、乳汁管、蜡质以及角质等结构，也可使叶绿体染成暗红色。8、伊红（Eosin）这类染料种类很多。常用的伊红Y，是酸性染料，呈红色带蓝的小结晶或棕色粉末状，溶于水（15摄氏度是溶解度达44%）和酒精（溶于无水酒精的溶解度为2%）。伊红在动物制片中广泛应用，是很好的细胞质染料，常用作苏木精的衬染剂。9、碱性品（复）红（Basicfuchsin）碱性品红是碱性染料，呈暗红色粉末或结晶状，能溶于水（溶解度1%）和酒精（溶解度8%）。碱性品红在生物学制片中用途很广，可用来染色胶原纤维、弹性纤维、嗜复红性颗粒和中枢神经组织的核质。在生物学制片中用来染维管束植物的木质化壁，又作为原球藻、轮藻的整体染色。在细菌学制片中，长用来鉴别结核杆菌。在尔根氏反应中用作组织化学试剂，已核查脱氧核糖核酸。10、结晶紫（Crystalviolet）结晶紫是碱性染料，能溶于水（溶解度9%）和酒精（溶解度8.75%）。结晶紫在细胞学、组织学和细菌学等方面应用极广，是一种优良的染色剂。它是细胞核染色常用的，用来显示染色体的中心体，并可染淀粉、纤维蛋白、神经胶质等。凡是用番红和苏木精或其他染料染细胞核不能成功时，用它能得到良好的结果。用番红和结晶紫作染色体的二重染色，染色体染成红色，纺锤丝染成紫色，所以也是一种显示细胞分裂的优良染色剂。用结晶紫染纤毛，效果也很好。用结晶紫染色的切片，缺点是不易长久保存。11、龙胆紫（Gentianviolet）龙胆紫是混合的碱性染料，主要是结晶紫和甲基紫的混合物。在必要是，龙胆紫能跟结晶紫互相替用。医药上用的紫药水，主要成分是甲基紫，需要时能代替龙胆紫和结晶紫。12、中性红（Neutralred）中性红是弱碱性染料，呈红色粉末状，能溶于水（溶解度4%）和酒精（溶解度1.8%）。它的碱性溶液中呈现黄色，在强碱性溶液中呈蓝色，而在弱酸性溶液中呈红色，所以能用作指示剂。中性红无毒，常做活体染色的染料，用来染原生动物和显示动植物组织中活细胞的内含物等。陈久的中性红水溶液，用作显示尼尔体的常用染料。13、番红（Safranin）番红是碱性染料，能溶于水和酒精。番红是细胞学和动植物组织学生常用的染料，能染细胞核、染色体和植物蛋白质，示维管束植物木质化、木栓化和角质化的组织，还能染孢子囊。14、亚甲蓝或美蓝（Methyleneblue）亚甲蓝或美蓝是碱性染料，呈蓝色粉末状，能溶于水（溶解度9.5%）和酒精（溶解度6%）。亚甲蓝是动物学和细胞学染色上十分重要的细胞核染料，其优点是染色不会过深。15、甲基绿（methylgreen）甲基绿是碱性染料。它是绿色粉末状，能溶于水（溶解度8%）和酒精（溶解度3%）。甲基绿是最有价值的细胞和染色剂，细胞学上常用来染染色质，跟酸性品红一起可作植物木质部的染色。16、甲苯胺蓝是常用的人工合成染料的一种,属于醌亚胺染料类,这类染料一般含有两个发色团,一个是胺基,一个是醌型苯环,来构成色原显色。染料除有发色团外,还要有能使色原对组织及其他被染物产生亲和力的原子团即助色。助色团能促使染料产生电离成盐类,帮助发色团对组织产生染色力,使切片上的组织细胞着色。甲苯胺蓝不仅含有两个发色团,还含有两个助色团,为硷性染料,甲苯胺蓝中的阳离子有染色作用,组织细胞的酸性物质与其中的阳离子相结合而被染色。可染细胞核使之呈蓝色；肥大细胞胞质内含有肝素和组织胺等异色性物质遇到甲苯胺蓝可呈异染性紫红色，封藏封藏于中性树胶中，使材料能在显微镜下清晰地显示出来，并能长期保存。方法：将含材料的载玻片放在吸水纸上（切片一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树胶（必须在二甲苯干燥前进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍微倾斜使其左侧与封藏剂接触，然后再缓慢地放下，避免产生气泡。韭菜根横切面女贞茎横切面（皮孔）南瓜茎横切面局部2、半薄切片技术

植物半薄切片的制作观察细胞最常用的方法是先制作切片，然后用显微镜观察与摄影。以下介绍用低粘性Spurr树脂包埋植物材料，用半/超薄切片机切片的方法。2.1半薄切片主要步骤★取材★固定★漂洗、脱水★渗透、包埋★半薄切片★半薄切片染色每一步都是关键,任何环节的疏忽都会导致制片的失败2.2常用固定剂

(1)四氧化锇(OsO4)--OSMIUMTETRAOXIDE

※强氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，可较好的固定脂肪、蛋白质、磷酸脂蛋白；※固定变性DNA及核蛋白，不能固定天然DNA、RNA及糖原；※具有固定和电子染色双重作用，样品图象反差较好；▼酶的钝化剂，不适合细胞化学的固定；▼与乙醇/醛类反应生产沉淀－－漂洗●分子较大,渗透速度缓慢,但反应迅速,均匀固定深度0.25㎜；●固定时间一般为1-2小时,时间太长易使组织变脆,切片困难；●锇酸固定液常用浓度：1％－2％;

极易挥发，对粘膜、角膜毒性极大,操作要十分小心!(2)戊二醛(

C5H8O2)--glutaraldehyde

※有效保存组织细微结构,对蛋白质的固定效果好；※渗透力强,渗透速度快,较好的固定糖原、核蛋白、微管、内质网和细胞基质、有丝分裂的纺锤丝及胞饮小泡等；※保存某些酶的活力,较好保存抗原,适于细胞化学研究；※对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强，均匀固定深度:0.5~1mm,0－4℃可长时间固定(几周甚至1～2个月)不会使组织变脆，可用于远离实验室的取材;▼缺点:不能保存脂肪，磷脂固定效果差，对细胞膜的显示较差，没有电子染色作用。(3)甲醛-Formaldehyde

※渗透组织的能力比戊二醛强，对于致密组织（种子）固定作用好；※细胞精细结构保存质量不如戊二醛，但酶活性的保存优于戊二醛；▼缺点：不能较好的固定细胞基质，脱水后大部分细胞基质将丢失；＊常用多聚甲醛－戊二醛的混合固定液。(4)高锰酸钾※强氧化剂，较好固定脂蛋白;※对神经髓鞘、叶绿体及其他各种膜结构的研究均可作为固定剂；※只用于某些常用固定剂难以固定的植物和酵母样品，且一般不需要用锇酸后固定.2.3漂洗漂洗的目的:☆组织固定后脱水前的漂洗:

清除残留固定剂,减小固定剂和脱水剂之间的反应，避免沉淀物干扰超微结构的观察.☆双重固定中,在锇酸固定前的漂洗:

避免锇酸与戊二醛反应生成细小而致密的饿沉淀，破坏细胞结构.常用缓冲液优点缺点pH磷酸盐缓冲液对细胞无毒性作用,缓冲能力强固定时易产生沉淀,易长细菌植物材料一般6.8~7.2二甲砷酸盐缓冲液不易长细菌,与低浓度钙质1-3mM不发生沉淀反应有毒(通风橱)醋酸－巴比妥缓冲液固定时不产生沉淀易长细菌,只适于配锇酸固定液,不适合配醛类(缓冲失效)二甲基砷酸钠缓冲液配制：此液配制比较简单，比较稳定，能保存，不易被细菌污染；但有一定的毒性，配制时要小心，应在防护罩内进行配制。尽量不使试剂与皮肤直接接触，避免呼吸道吸入。另外，由于二甲砷酸盐不像磷酸盐那样会和铅试剂起反应产生沉淀，因此在细胞化学中使用普遍。常用浓度为0.1mol/L。配方如下：A液（0.4mol/L二甲砷酸钠贮存液）：

Na(CH3)2•ASO2•3H2O8.65g加双蒸水至100mLB液(0.2mol/L盐酸溶液)：

HCl(36%-38%)1mL:加双蒸水到60mL

取25mLA液、3-4mLB液混合，测pH，可用B液调整pH值到7.2左右，再加双蒸水到50mL，配成的二甲砷酸钠浓度为0.2mol/L。在配制固定液时也应稀释到0.1mol/L。最后配成的固定液中加1-3mmol/L的钙离子，可使结构保存更好。

多聚甲醛戊二醛固定液配制：取2g多聚甲醛粉末溶于21mL蒸馏水，65℃下不断搅拌，加1～3滴1N氢氧化钠，使溶液透明，冷却后加25%戊二醛4mL，加二甲基砷酸钠缓冲液（0.2mol/L，pH7.2）使总体积到50mL，并加25mg无水氯化钙。混合液的pH为7.2。本液对微管有良好的保存作用。后固定液：1％OsO4溶液

OsO4：0.5g，0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液：50mLOsO4一般为0.5或1克安瓶中封闭包装，配制时剥去商标，用自来水洗净，放洗涤液中泡4～12小时后用水冲洗，在安瓶上划痕，用蒸馏水洗净，投入茶色瓶中，加缓冲液，用玻璃棒在瓶中捣碎，轻轻摇动放冰箱中，48小时后完全溶解。此药蒸气对人眼、角膜、鼻腔和口腔粘膜有固定作用，用时特别小心，在通风橱内操作。卡诺固定液12纯酒精15ml30ml

氯仿5ml

冰醋酸5ml1ml渗透迅速，固定根尖和花药只需30-60分钟，但固定时间不能太久，一般不超过一天Spurr树脂的配制1.Spurr树脂的组成Spurr树脂是由四种试剂按比例配制而成(表1)表1Spurr树脂常用的配方其中可塑剂的用量调节包埋块的硬度。2.Spurr树脂的配制配制时，盛树脂的烧杯放在电子天平上，按表中试剂的序顺，边滴入试剂边称量，每加入一种试剂要充分搅拌后再加另一种试剂。盛树脂的烧杯要烘干，树脂配制好后，盛树脂的烧杯要用塑料纸封口，防止树脂吸湿。树脂要随配随用，配制好树脂只能在冰箱中存放2天。通常每一个样品需要用4～5ml树脂，按样品数计算总量，分二次配制，一次在浸渗开始时配制，另一次在最后一次更换纯树脂时配制三、操作方法1.材料的固定2.脱水3.置换4.浸透5.包埋与聚合6.修块7.玻璃刀制作8.切片9.贴片10.染色1.材料的固定固定是制片的第一步，它的主要目的是将植物细胞迅速杀死及固定。固定剂都是蛋白质凝固剂。固定剂凝固性固定剂：破坏结构。甲醇、乙醇、丙酮、三氯醋酸、氯仿等非凝固性固定剂：破坏结构少。戊二醛、甲醛、锇酸、醋酸、重酪酸钾等戊二醛：最常用的固定剂，还原剂。它能与蛋白质分子的氨基和肽键交连，保持细胞结构和某些酶活性。锇酸：很好的固定剂，强氧化剂。不但能固定蛋白质，还能对脂类固定，因而能固定膜结构。(3)清洗：吸去管瓶中的前固定液，加入1～2ml缓冲液于管瓶，将管瓶放在振荡机上低速振荡，10min后吸去缓冲液。共清洗3次，每次10min。(4)后固定：清洗后，管瓶中加入0.5ml后固定液。振荡固定3h左右，使固定材料逐渐变黑。后固定过程也可在冰箱中进行(即过夜)。(1)管瓶编号：根据固定样本数编写管瓶号码。(2)前固定：用双面刀片将植物材料切成1mm厚的薄片，把薄片放入盛有1～2ml前固定液的管瓶中，固定时要将管瓶盖盖紧。将管瓶放在振荡机上低速振荡3h左右。2.脱水所谓脱水，就是用乙醇或丙酮等有机溶剂浸渍已固定的材料，逐步除去样品中的水分。脱水过程(1)用吸管吸去管瓶中的后固定液，用缓冲液或重蒸水清冼管瓶和固定的材料三次，每次10min。(2)用20%、40%、60%、80%、90%、95%的乙醇分别浸渍固定的材料，每种浓度处理20～30min。(3)100%乙醇浸渍材料3次，每次30min。3.置换

指一种溶剂更换另一种溶剂的过程。(1)在管瓶中加入2ml无水乙醇和1ml环氧丙烷(alc:PO≈7:3)，处理材料10min。(2)向管瓶中追加1ml环氧丙烷(使alc:PO≈5:5)，处理材料10min。(3)向管瓶中再追加2ml环氧丙烷(使alc:PO≈3:7)，处理材料10min。(4)倾倒出管瓶中的无水乙醇和环氧丙烷混合液，加入纯环氧丙烷3次，每次10min。在置换过程中管瓶要盖紧盖子，一防环氧丙烷挥发使样品干燥，二除空气中湿气进入有机溶液。4.浸透

指树脂替换有机溶剂的过程。(1)在管瓶中加入1ml环氧丙烷，向内滴入1滴Spurr树脂，将管瓶放在振荡机上低速振荡1～2h。(2)向管瓶中追加1至数滴Spurr树脂，使Spurr树脂的浓度逐渐提高，每滴加一次Spurr树脂，振荡1～2h，共滴加0.3ml左右的树脂，使树脂浓度达到25%左右。(3)用吸管吸去管瓶中0.5～0.8ml的环氧丙烷和Spurr树脂的混合液，然后加入纯Spurr树脂0.5ml，使树脂浓度达到50%～60%左右，振荡2～3h。(4)用吸管吸去管瓶中的环氧丙烷和Spurr树脂的混合液，加入0.5～0.8ml的Spurr树脂，振荡2～3h。(5)更换新配制的Spurr树脂1ml，振荡12h左右。5.包埋与聚合

(1)调温：先将恒温箱调至温度至70℃，包埋模事前烘干置干燥器中存放。(2)浸透：在包埋模的中放上已浸透的材料，用滴管吸取新配制的Spurr树脂，并注满每个穴孔，用镊子拨正样品的方位。(3)聚合：将包埋样品的包埋模放入70℃恒温箱中聚合，12h后取出置干燥器中存放。包埋模(左)和镊子(右)指材料在树脂中定位和树脂固化过程。

6.修块(1)切块粘合

将钳子夹住样品块，用小钢锯把样品块切割，并将切割后的样品块与树脂块用铁砂皮磨平，然后用501胶将在一起(图B)。

(2)磨块

用锉刀或铁砂皮磨(粘合好的)样品块，使样品稍稍暴露，使待切部位呈方形或长方形，最后用刀片将样品块的磨面切平，其形状如图3所示。A.直接修块B.样品块与树脂块粘合后再修块使样品显露出树脂，成为易于切片的状态7.玻璃刀制作用玻璃制刀机先将玻璃条制成边长为25mm的正方块，然后再将每正方块制作成2把玻璃刀。为了使璃制刀上口能注水浮切片，还需用制刀用的胶带和石蜡制作盛水用的“小舟”，如图5所示。图4由玻璃条制作玻璃刀的示意图图5附有盛水“小舟”的玻璃刀8.切片(1)固定样品块和玻璃刀

将样品块和玻璃刀固定在切片机上，避角约为5度，样品头平放时，玻璃刀刀口与样品块处于同一高度。调节玻璃刀前后位置，使刀口接近样品块。

(2)荒切

用注射器向玻璃刀的“小舟”中注水。然后开动切片机，调节进刀距离和速度，让玻璃刀荒切样品块，使样品块的切面逐渐平整光滑起来。切下的树脂片会漂浮在“小舟”的水面上。(3)切片

当样品块的切面平整光滑后便可正式切片。正式切片前应把漂浮在“小舟”水面上荒切片去除。作为光镜观察用的半薄切片厚度一般控制在1μm左右。图6样品块和玻璃刀的相对位置环氧树脂中的硬化剂可以与硅胶模具中的硅反应，使包埋块变软，因此，不能用硅胶模具45度角的刀切硬材料，35度刀切较软材料冷冻切片用水：二甲亚砜为1:1的比例，冰点会降至-40℃玻璃条毛面向下旧铜网清洗：用三氯甲烷泡过夜后，超声20-30min，再用丙酮超声20-30min，乙醇洗净，新铜网用乙醇洗净即可。钻石刀的清洗，有油时用丙酮，蜡用二甲苯，再用100%乙醇清洗铀染避光，铅染不用。膜烘干不需加热，常温最好（放干燥器中）50%乙醇配染色液，置于小管分装后冻-20度，取出用前12000g5-10min离心，除去沉淀石蜡切片无水乙醇后用正丁醇，然后纯蜡1h，纯蜡2h，纯蜡4-6h，不用二甲苯，二甲苯易透明透过植物材料超薄切片渗透不好，可在固定后加EDTA过夜，然后再用锇酸预染为了使冷冻切片连续，可以增加切片宽度，或在样品周围涂Gel，或在水槽中加1-2滴乙醇用抗静电装置消除静电影响，抗静电装置TheCrioniorize/charger包埋时包埋进一张纸用于标记名称9.贴片

当“小舟”水面上有理想切片时，用被烧结过的呈圆头玻璃小棒去沾附切片(图7)，并把切片释放到滴有水滴的载玻片的水滴上，然后将载玻片放到电热板上烤片，当载玻片上的水滴被烤干时切片就被贴在载玻片上。图7贴片将切片固定到载玻片上的过程。10.染色

在载玻片的切片的部位上滴加0.5%～1%TBO，并把载玻片放到电热板上烤片，待染色剂干后即用蒸馏水冲洗(图8)。并再次把切片烘干。图8水洗染色后的切片切片机给切片染色和清洗的过程。

切片厚度：0.5~5um切片捞到载玻片上半薄切片厚度：0.5-1μm，切完后捞片前用滤纸蘸一下后置于液面上方熏一下使片子展开，用亚甲基蓝染色半薄切片冰冻切片：组织液氮骤冷，恒冷箱切片机切片(糖类、脂类、酶、核酸等）。涂片：将游离的细胞直接涂于切片上，主要用于血液、微生物等不能切片成薄片的液态颗粒性材料，可在载玻片上涂成单层细胞，再经固定，脱水，染色等手段制成永久标本。铺片：主要用于动、植物组织的表皮层观察，可活体取待观察动、植物组织，用尖镊子撕去一层表皮，迅速平铺在载玻片上。如:洋葱表皮细胞的铺片制备。压片：一些较幼嫩，柔软的材料可将其置载玻片上，用小解剖刀将其分散，加染料一滴，再盖上盖玻片，用拇指垂直用力挤压，使组织散成一薄片，再进行观察，如植物根尖观察染色体，花粉粒观察发育阶段等。染色后可作临时的观察标本，也可以经过脱水、透明等手续制成永久的玻片标本。3.其他制片方法二、电子显微镜技术

(electronmicroscopy)光镜：分辨率为0.2μm，放大倍数约为1000倍；电镜：分辨率为0.2nm，比光镜高1000倍，可放大几万倍到几十万倍，因此电镜能观察到细胞的更微细结构。在光镜与电镜下进行观察，常用的长度计量单位为毫米（mm）、微米（μm）和纳米（nm）。这些单位间的关系如下：μm(微米)＝10-3mm(毫米)；nm(纳米)＝10-3μm(微米)1.透射电子显微镜技术

(transmissionelectronmicroscopeTEM)

透射电子显微镜技术的组织须用戍二醛或锇酸固定，树脂包埋，超薄切片(厚50～80nm），再经铅盐等重金属盐染色后，在透射电子显微镜下观察。电镜下所见的结构称为超微结构(ultrastructure)，被金属所染部位，荧光屏上显得暗，图象较黑，称为电子密度高；反之则称为电子密度低。被检结构和重金属盐相结合的称正染色；被检结构本身不与重金属盐结合，而其周围染上重金属盐的称负染色。一般染色都是正染色。透射电子显微镜的成像基本原理

在真空条件下，电子束经高压加速后，穿透样品时形成散射电子和透射电子，它们在电磁透镜的作用下在荧光屏上成像。显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可见光（400-700）紫外光（约200nm)电子束（0.01-0.9）玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差电镜与光镜的比较脱水目的将组织内的游离水彻底清除,保证包埋介质完全渗入组织内部。方法用一种和水及包埋剂均能相混溶的液体来取代水,常用的脱水剂是乙醇和丙酮。注意事项脱水梯度逐级进行,急剧脱水会引起细胞收缩。（30%→50%→70%→80%→95%→100%→100%）;更换溶液动作要快。长时间暴露空气中会在组织内外产生微小气泡，影响渗透；脱水过程中应在70%脱水剂中4℃停留或过夜,过度脱水不仅引起更多物质的抽提，而且会使样品发脆，造成切片困难;置换用脱水剂：环氧丙烷（Epon812）、二甲苯（石蜡）。渗透和包埋、聚合渗透

渗透就是利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂的过程。包埋剂在单体状态时(聚合前)为液体，能够渗入组织内，当加入某些催化剂，经加温或其他条件，能聚合成固体，以便进行超薄切片。包埋、聚合

包埋操作：将组织块包埋在多孔橡胶包埋模板中或胶囊中，一定条件下可聚合硬化，形成包埋块。包埋板1包埋管胶囊Epon812渗透效果好，切片的图像对比度强，电子束照射下稳定吸潮性很强，潮湿和炎热的环境下，树脂会变软Spurr黏度低，可较好地渗透具有硬的木质化细胞壁的植物细胞、脂肪含量很高的内胚乳、高度液泡化的成熟果实,电子束照射下稳定图像对比度较弱Araldite聚合均匀，收缩量很小，超薄切片可直接沾在没有支持膜的载网上，电子束照射下十分稳定，用重金属染色时易着色。◆环氧树脂(epoxy

resin)◆水溶性树脂－丙烯酸类树脂

LRWhite、Lowicryls、GMA、PEG等，适于进行组织化学和细胞化学研究的样品制备。适于低温包埋，通常用于免疫电镜样品的制备。

包埋操作中的注意事项§所有试剂要防潮，最好存放在干燥器中；§所用器皿应烘干；§配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀；§包埋时动作要轻巧，防止产生气泡；§盛放过包埋剂的容器要及时用丙酮清洗干净.§皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；Spurr或Epon812难渗透时，可降低催化剂浓度，先后放树脂和丙酮1:3,1:2,1:1（不加催化剂）在真空环境中，抽后放摇床上摇，再抽再摇，三天后即可渗透完全。超薄切片修块

削去表面的包埋剂，露出组织，然后在组织的四周以和水平面成45度的角度削去包埋剂，修成金字塔形，顶面修成梯形或长方形，每边的长度为0.2mm～0.3mm。超薄切片

超薄切片机：LEICAULTRACUTR超薄切片厚度:

<100nm,一般50-70nm莱卡超薄切片机载网和支持膜载网(超薄)

载网铜网(常用)不锈钢网镍网(免疫电镜)直径：2-3mm，厚度：0.03-0.02mm(2)载网支持膜膜的要求:透明无结构,并能承受电子束的轰击.支持膜的种类:

火棉胶膜

聚乙烯醇缩甲醛膜(formvar膜)

碳膜膜的厚度:10nm～20nm超薄切片的染色目的:增强样品的反差,提高图象的清晰度.常用染色剂:

重金属盐各种染料常用的染色剂:

醋酸铀和柠檬酸铅。染色方法：(1)组织块染色在脱水至70%乙醇时，将组织块放在用70%乙醇配制的饱和醋酸铀溶液中，染色时间2小时以上，或在冰箱中过夜。

▲超薄切片染色(2)超薄切片后染色醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染铀染:细胞核及结缔组织染色铅染:提高细胞质成分的反差1）前固定（固定液体积是固定材料的十倍以上，材料不堆积）3%戊二醛in0.1MPBS,ph7.2，室温5-6h，后4°C保存2）漂洗：

0.1MPBSPh7.2充分漂洗3-4次，20-30Min/次3）后固定1%锇酸固定in0.1MPBS，4°Covernight4）漂洗：

0.1MPBSPh7.2充分漂洗3-4次，20-30Min/次5）系列脱水：30%-50%-70%（4°C,overnight,可以停下）-80%-95%-100%-100%）用丙酮置换乙醇：乙醇:丙酮=1:1，纯丙酮2次，每级20-30分钟6）渗透丙酮:树脂=2:1，1:1（可以停下了，overnight），1:22-3h/级纯树脂12h，换纯树脂12h（从进入树脂开始更要严格防潮！）7）包埋聚合

60°C24hr注意：免疫电镜时不用锇酸固定，树脂换成LRWhite等水溶性树脂，固定液可以是1.25%戊二醛+1.25%多聚甲醛in0.1MPBSPh7.2超薄切片技术主要包括取材、固定、包埋、切片、染色等步骤。透射电镜标本制备：1、固定（戊二醛与锇酸等）2、包埋（树脂）3、切片（50-80nm)4、染色（醋酸铀和柠檬酸铅等重金属）标本在荧光屏上呈黑白反差的结构影像。电子密度高、电子密度低：被重金属浸染呈黑色的结构，称电子密度高；反之，浅染的部分称电子密度内质网透射电镜图

超薄切片技术用于电镜观察的样本制备，观察组织、细胞内部超微结构。分辨率0