蛋白质折叠与折叠病

关于蛋白质折叠与折叠病第1页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六您知道蛋白质折叠吗？您知道“蛋白质折叠病”吗？您知道蛋白质折叠有多复杂吗？

第2页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六蛋白质折叠的定义

蛋白质凭借相互作用在细胞环境(特定的酸碱度、温度等)下自己组装自己，这种自我组装的过程被称为蛋白质折叠第3页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六

蛋白质折叠问题是生命科学领域的前沿课题之一，并且被列为“21世纪的生物物理学”的重要课题，它是分子生物学中心法则尚未解决的一个重大生物学问题。从一级序列预测蛋白质分子的三级结构并进一步预测其功能，是极富挑战性的工作。研究蛋白质折叠，尤其是折叠早期过程，即新生肽段的折叠过程是全面的最终阐明中心法则的一个根本问题。

第4页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六蛋白质折叠问题为什么会称为

当今生物学领域中的研究热点之一？破译生命的另一半遗传密码，完善中心法则蛋白质分子设计及蛋白质工程的需要越来越多的基因工程产物需要复性复活，要求蛋白质折叠的理论及技术作为指导第5页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六研究的源动力disease

免疫病毒库鲁病(Kuru)疯牛病研究背景第6页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六卡里顿·加德赛克

美国国立卫生研究院病毒和神经研究室主任，因发现神经性传染性疾病的新病因和传播新机制而获得1976年诺贝尔医学/生理学奖。第7页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六

加德赛克在新几内亚岛发现了一种奇怪的疾病，当地的土著人称之为“kuru”。由于找不到病因，被当地人称为“终极巫术”。

Kuru在当地的含义是颤抖，因某种未知的寒冷或恐惧而颤抖。一旦Kuru的颤抖开始，就不可逆转，诅咒会越来越烈，直至死亡为止。Kuru的诅咒非常残酷：先是不可抑制的颤抖，然后丧失行走能力及无法言语，接着瘫痪。但中了巫术的人至死心智都很清醒，不会陷入昏睡状态，因此格外痛苦。第8页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六蛋白质折叠研究的背景

遗传信息的传递

DNARNAProteins肽链有活性的蛋白质天然构象实质上是多肽链遗传信息的传递应该是从核苷酸序列到有完整结构的功能蛋白质的全过程。第9页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六蛋白质折叠研究的概况20世纪60年代，安芬森（Anfinsen）基于还原变性的牛胰RNase的研究提出“自组装学说”Ellis于1987年提出了蛋白质折叠的“辅助性组装学说”。

mRNA的二级结构可能作为一种遗传密码从而影响蛋白质结构的假说那么，蛋白质的氨基酸序列究竟是如何确定其空间构象的呢？第10页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六牛胰核糖核酸酶的一级结构二硫键第11页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六变性剂巯基乙醇复性牛胰核糖核酸酶的变性和复性第12页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六第13页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六蛋白质折叠的研究内容蛋白质折叠的研究，狭义的定义就是研究蛋白质特定三维空间结构形成的规律、稳定性及与其生物活性的关系。在概念上有热力学的问题和动力学的问题；蛋白质在体外折叠和在细胞内折叠的问题；有理论研究和实验研究的问题。第14页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六蛋白质折叠的研究内容最根本的科学问题就是多肽链的一级结构到底如何决定它的空间结构？既然前者决定后者，一级结构和空间结构之间肯定存在某种确定的关系，这是否也像核苷酸通过“三联密码”决定氨基酸顺序那样有一套密码呢？后来，有人把这设想的一级结构决定空间结构的密码叫作“第二遗传密码”。第15页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六第二遗传密码完整的提法应该是遗传密码的第二部分，即蛋白质中氨基酸序列与其空间结构的对应关系，国际上称之为第二遗传密码或折叠密码Anfinsen原理：自发折叠概念的转变(有帮助的肽链的自发折叠和组装)三联密码的解决国外对蛋白质折叠的研究第16页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六第二遗传密码的特点简并性在第一遗传密码中有所谓“简并性”，即同一AA可以由不同密码子所编码，如CGA和AGC

都编码为Arg，UCC和AGU都编码为Ser等。第二密码也同样有简并性。现在已经知道有很多氨基酸序列不同的肽链可以有极为相似甚至相同的空间结构，这就是第二密码的简并性。第17页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六简并性的证据1、不同生物体中执行相同功能的蛋白质有AA序列上的差异,但却有相同的整体空间结构。例如：线粒体Cytc的AA序列已经测定，AA残基数均在104左右,但仅在21个位置上的AA在不同生物体的Cytc是完全相同的，但是所有Cytc的整体空间结构却是非常相似的。另外，两个在功能上完全无关的蛋白质，卵类黏蛋白的第三结构域和核糖体结构蛋白L7/L12的C-末端部分在AA序列上仅有3%相同,却具有几乎完全相同的空间结构。第18页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六2、化学修饰改变侧链性质，包括大小、极性、电荷、氢键形成能力等的影响。晶体衍射结构分析的结果表明：在分子内部引入大小不同的疏水基团的结果，只不过是使某些侧链基团在位置上有所重排，但并不影响分子的总体结构。第19页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六3、定点突变研究定点突变技术的建立为蛋白质结构功能关系研究提供了极大的方便。例如：金黄色葡萄球菌核酸酶是研究得最多的蛋白之一结果表明：某些个别键的破坏并不能对结构起到决定性的作用，所以个别残基的单独替换不会对分子的总体构象产生明显的影响。甚至把整段序列用相同残基构成的序列所取代，生物活性都没有明显影响。第20页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六多意性某些相同的氨基酸序列还可以在不同条件下决定不同的空间结构，这种情况可以称之为第二遗传密码的多意性。例如，Prusiner对天然型和感染型朊病毒(prion)的研究。天然型朊病毒(PrPc)在正常动物体内存在,不导致疾病,而感染型的朊病毒(PrPSC)则导致某些神经性疾病,并导致天然型朊病毒转变为感染型的朊病毒。初步研究表明天然型朊病毒主要为α-螺旋结构,而感染型的朊病毒却主要为β-折叠结构.第21页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六全局性第二密码必须把蛋白分子作为一个全局来考虑，这就从根本上决定了第二密码的复杂性，它不可能像第一密码那样有简单的一对一的关系。某些蛋白C-末端少数氨基酸的去除,或侧链基团的翻译后修饰，有时都可以对整体构象和功能产生重大影响。第22页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六在新生肽链合成过程中，后形成的肽段可以影响已经形成的肽段的构象从而造成对分子整体的影响。以上这些情况可以称之为第二密码的全局性，全局性决定了第二密码的复杂性。第二密码的全局性还体现在环境对分子结构的影响上，水分子对于维系蛋白质一定的空间结构有重要作用。第23页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六蛋白质折叠的研究内容破译“第二遗传密码”正是“蛋白质结构预测”从理论上最直接地去解决蛋白质的折叠问题，这是蛋白质研究最后几个尚未揭示的奥秘之一“蛋白质结构预测”属于理论方面的热力学问题。第24页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六蛋白质折叠第二个根本的科学问题是具有完整一级结构的多肽链又是如何折叠成为它特定的高级结构？这是一个折叠的动力学的问题，长期以来，主要用体外的实验方法研究，虽然已有四五十年，但至今尚未解决。绝大多数蛋白质从一条伸展的肽链，折叠成有其特定结构的、有活性的蛋白质，并不是一步完成的，而要经过许多折叠的中间状态。

第25页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六细胞内的蛋白质折叠1988年，邹承鲁明确指出，新合成出来的多肽链（称为新生肽）在合成过程中长度不断增加，并在延伸的同时进行着折叠，而不是在合成完成脱离核糖体后再自发折叠成为蛋白质。在新生肽成熟为功能蛋白的全过程中，每一步都涉及新生肽链的构象变化、折叠和调整。第26页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六蛋白质折叠机制的理论模型框架模型（FrameworkModel）疏水塌缩模型（HydrophobicCollapseModel）扩散-碰撞-粘合机制（Diffusion-Collision-AdhesionModel）

成核-凝聚-生长模型（Nuclear-Condensation-GrowthModel）拼版模型（Jig-SawPuzzleModel）第27页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六框架模型（FrameworkModel）

P.S.Kim和R.L.Baldwin于1982年提出，假设蛋白质的局部构象依赖于局部的氨基酸序列。在多肽链折叠过程的起始阶段,先迅速形成不稳定的二级结构单元；随后这些二级结构靠近接触,从而形成稳定的二级结构框架；最后，二级结构框架相互拼接，肽链逐渐紧缩，形成了蛋白质的三级结构。这个模型认为即使是一个小分子的蛋白也可以一部分一部分的进行折叠,其间形成的亚结构域是折叠中间体的重要结构。

第28页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六疏水塌缩模型（HydrophobicCollapseModel）该模型中，疏水作用力在蛋白质折叠过程中起决定性作用。疏水片段首先聚集在一起，然后进一步聚集长大，形成蛋白中间体，进而形成高级结构第29页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六扩散-碰撞-粘合机制（Diffusion-Collision-AdhesionModel）该模型认为蛋白质的折叠起始于伸展肽链上的几个位点，在这些位点上生成不稳定的二级结构单元或者疏水簇，主要依靠局部序列的3-4个残基间的相互作用来维系。它们以非特异性布朗运动的方式扩散、碰撞、相互黏附，导致大的结构生成并因此而增加了稳定性。进一步的碰撞形成具有疏水核心和二级结构的类熔球态中间体的球状结构。球形中间体调整为致密的、无活性的类似天然结构的高度有序熔球态结构。最后无活性的高度有序熔球态转变为完整的有活力的天然态。第30页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六成核-凝聚-生长模型（Nuclear-Condensation-GrowthModel）

肽链中的某一区域可以形成“折叠晶核”，以它们为核心，整个肽链继续折叠进而获得天然构象。所谓“晶核”实际上是由一些特殊的氨基酸残基形成的类似于天然态相互作用的网络结构，这些残基间不是以非特异的疏水作用维系的，而是由特异的相互作用使这些残基形成了紧密堆积。晶核的形成是折叠起始阶段限速步骤。

第31页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六拼版模型（Jig-SawPuzzleModel）此模型的中心思想就是多肽链可以沿多条不同的途径进行折叠，在沿每条途径折叠的过程中都是天然结构越来越多，最终都能形成天然构象。折叠速度快影响小第32页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六帮助新生肽折叠的蛋白（辅助蛋白）分子伴侣折叠酶分子内伴侣第33页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六分子伴侣-蛋白质的保姆

分子伴侣：(Chaperone或molecularchaperone,也可译为侣伴蛋白)，是细胞内的一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。

第34页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六主要类型

1.热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)HSP70、HSP40和GreE族等

2.伴侣素(chaperonins)GroEL和GroES家族第35页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六热休克蛋白促进蛋白质折叠的基本作用——结合保护待折叠多肽片段，再释放该片段进行折叠。形成HSP70和多肽片段依次结合、解离的循环。

HSP40结合待折叠多肽片段HSP70-ATP复合物

HSP40-HSP70-ADP-多肽复合物

ATP水解GrpEATPADP复合物解离，释出多肽链片段进行正确折叠

第36页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六伴侣素GroEL/GroES系统促进蛋白质折叠过程

伴侣素的主要作用——为非自发性折叠蛋白质提供能折叠形成天然空间构象的微环境。第37页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六折叠酶蛋白质多肤链的折叠过程中，还需要酶的催化，称之为折叠酶。它们催化与蛋白质折叠直接有关的、对形成功能构象所必需的共价键变化，帮助蛋白质正确折叠。第38页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六折叠酶类型(1)蛋白质二硫键异构酶PDI(Proteindisulfideisomerase)(2)肽基脯氨酰顺反异构酶PPI(Peptidylprolylcis/transisomerase)第39页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六蛋白二硫键异构酶(PDI)

真核生物的PDI在内质网腔活性很高，细菌中的类似物是Dsb家族，位于细菌外周质(periplasm)，在肽链中催化错配二硫键断裂并形成正确二硫键连接，最终使蛋白质形成热力学最稳定的天然构象。通过催化巯基与二硫键的交换反应，从而催化蛋白质二硫键的形成、还原（断裂）或重排（异构化）。在蛋白质折叠过程中，主要催化含有二硫键的膜蛋白或分泌蛋白的正确折叠。

第40页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六肽基脯氨酰顺反异构酶(PPI)

PPI广泛分布于各种生物体及各种组织中，多数定位于胞浆，但也存在于大肠杆菌的外周质、红色面包霉的线粒体基质、酵母、果蝇和哺乳动物的内质网。肽基脯氨酰顺反异构酶是蛋白质三维构象形成的限速酶，在细胞中通过非共价键方式，稳定扭曲的酰胺过度态，而催化肽基脯氨酰顺反式的相互转变。在肽链合成后需形成顺式构型时，可使多肽在各脯氨酸弯折处形成准确折叠。第41页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六PDI和PPI不仅可以起到折叠酶的催化作用，而且具有防止折叠中间体聚集的类似分子伴侣的功能。王志珍等最早提出PDI是分子伴侣的假说并验证了PDI的这一功能第42页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六分子内伴侣(intramolecularchaperones)1987年，Ikemura发现枯草杆菌素(subtilisin)的折叠需要前肽(propeptide)的帮助。这类前肽常位于信号肽与成熟多肽之间，在蛋白质合成过程中与其介导的蛋白质多肽链是一前一后合成的，并以共价键相连接，是成熟多肽正确折叠所必需的，成熟多肽完成折叠后即通过水解作用与前肽脱离。Shinde和Inouye将这类前肽称为分子内伴侣。

第43页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六蛋白质折叠病（folddisease)蛋白质分子的氨基酸序列没有改变，即一级结构正常，只是其二级结构、乃至立体结构（构象）异常也可导致疾病，这类疾病称为“构象病”，或称“折叠病”第44页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六从本质上讲分子伴侣突变引起的疾病蛋白折叠、转运异常引起的疾病第45页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六从机制上讲质量控制系统——滞留（retaining）折叠异常第46页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六质量控制系统-滞留

许多编码基因的细微突变如点突变或个别氨基酸的缺失，编码蛋白还具有绝大部分生物活性，只是出现蛋白产物极细微的折叠异常，却可导致疾病的发生。部分原因是“质控系统”在发挥作用：蛋白产物极细微的折叠异常，虽然对活性影响不大，却可以被分子伴侣等识别而滞留在内质网，不能实现正常的转位、转运或分泌，从而不能到达生理位置执行正常的功能，导致疾病发生。第47页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六典型例子：α1

抗胰蛋白酶缺陷病α1抗胰蛋白酶发生突变时，仅有15%的蛋白质分泌出来，其余全部滞留在内质网（ER）中。这种滞留的原因部分是由ER的分子伴侣calnexin介导了折叠异常的突变蛋白的聚集。而异常产物的聚集大大妨碍了细胞的正常活动，导致肝硬化（cirrhosis）或肺气肿（emphysema）的发生。第48页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六第49页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六当然，并不是所有的蛋白折叠异常都导致定位异常。有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病（Creutzfeldt-Jakobdisease,CJD）、老年痴呆症（Alzheimer‘s）、亨停顿舞蹈病(Huntington’sdisease,HD)、疯牛病等等。第50页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六疯牛病牛海绵状脑病(bovinespongiformencephalopathy,BSE):

俗称疯牛病(madcowdisease):1986年首次在英国报道。该病潜伏期4～5年，发病初期表现为体质变差，体重减轻，产奶量下降等非特异性症状。随后神经系统症状逐步明显，出现小脑共济失调、震颤等，由于病牛常表现出感觉过敏、恐惧甚至狂乱，因此俗称“疯牛病”。第51页，共59页，2022年，5月20日，4点44分，星期六疯