细胞的克隆培养及筛选课件

第10章克隆培养及筛选克隆培养利用克隆培养可以解决培养中的异质性问题，该技术对于连续细胞系相对容易，但对大多数原代培养的细胞来说，由于其成功率低而受到限制。成功的范例：Clark和Paterman（1978）通过原代的克隆培养从中国仓鼠肝内分离并建立了枯否氏细胞系；Zwain等克隆培养出睾丸支持细胞(1991)；1990年Muirhead等人，Troyer等人通过克隆培养从肾组织中分离出肾小球旁细胞和肾小球细胞;正常组织原代培养的另一个问题是只能传有限的几代，当克隆培养达到所需的数目时，细胞已经接近衰老：单个克隆细胞与群体之间的关系，20次倍增可形成106个细胞（见图表）克隆培养克隆培养也可作为对细胞的存活能力的检测，可用于选择细胞的最适生长条件（培养基和血清的选择）和测定细胞的化学及放射敏感性;单层贴壁细胞的克隆培养可用培养皿、多孔板或培养瓶进行。由于细胞持续贴壁，比较容易识别单个细胞所形成的集落，显微操作是唯一公认的决定性方法;悬浮细胞也可以在凝胶中克隆培养，比如琼脂或黏性溶剂如美希索(Methocel)。凝胶的稳定性或美希索的粘滞性可确保子代细胞不脱落集落。造血细胞通常是在悬浮培养条件下进行克隆培养，根据其细胞种类和使用的生长因子，克隆培养形成的集落可以是由体内外群体重塑能力很强的未分化细胞构成，或是有群体重塑能力弱的已分化细胞构成，这样克隆培养就成了一种检测细胞增殖能力和鉴定干细胞性质的方法。方案：稀释法克隆培养概要：低密度接种细胞，培养至集落形成，再进行细胞染色(用于存活检测)或分离细胞，然后扩增为细胞株，用于筛选。无菌材料培养基，0.25%胰蛋白酶，1ml、5ml、10ml、25ml吸管，6cm、9cm培养皿，试管。非灭菌材料血细胞计数器或电子细胞计数仪操作步骤1.细胞用胰蛋白酶消化以制备单细胞悬液，就克隆培养而言细胞呈单个悬浮状态是基础—消化不充分会形成细胞团，而过度则会降低细胞活性。2.在细胞消化期间，给培养皿编号，分出每步稀释用培养基，可能需要四次稀释才能将原来单层细胞稀释至适于克隆培养的浓度。3.待细胞变圆并开始脱落时，加入含血清或胰酶抑制剂的培养基以终止消化，分散细胞。4.细胞计数，将细胞悬液稀释至接种需要的浓度。如果是第一次克隆培养，选择每毫升中10、50、100和200个细胞进行实验。操作步骤5.将需要量的细胞种入培养皿中。6.在CO2培养箱中保温培养，静置培养一周，如果有集落形成，则进行以下处理：(a).贴壁形成率分析：集落的染色和计数。(b).克隆筛选：单个集落的分离(见后面“克隆的分离”)。如果没有可见集落，则更换培养基后再培养一个星期，如果有必要还可以更换培养基后培养三个星期，如果再没集落出现，则不再有可能出现集落。单层贴壁细胞

的克隆培养克隆形成后，可以直接从多孔板分离培养可以用克隆培养环技术培养，或者遮蔽一个集落，再用射线照射培养瓶如果不需要分离培养，只用于定量分析，则可以将集落固定、染色、计数。微量滴定培养板如果克隆培养的主要目的是分离不同的集落，那么将细胞接种在微量滴定板上的效果会更好，克隆长起来后也容易分离，但在早期必须注意观察，以保证标记好哪一孔真正有单个克隆提高单孔单克隆在统计学上的可能性，可以通过将接种细胞的密度降低至每5或10个孔中可能有一个单克隆集落的水平

例如：如果每毫升含100个细胞，贴瓶率为10%，则每毫升会有10个集落形成，即每0.1ml有一个集落。在微量滴定板中每孔种0.1ml，形成一个集落。如果将细胞稀释至每毫升10个细胞，理论上10个孔中只会有1个孔能形成1个集落，而每孔中多于一个集落的可能性很小。毛细管技术在一定密度的群体里，释放的胞内代谢物很快会和周围培养基达到平衡，而孤立的一个细胞就不能做到这一点。据此原理，Sanford等人发明了毛细管技术：毛细管本身能为细胞营造出类似细胞较高密度状态下的局部环境应用毛细管计数，集落可以处于独立的状态，能够依次被分离培养促进克隆生长的方法④中间代谢产物：可作为辅助介质添加到培养基中酮酸，如丙酮酸或α-酮戊二酸核苷⑤二氧化碳：二氧化碳对获得最大的克隆率是必需的，通常为5%；对人神经胶质细胞和成纤维细胞，2%更好，且在此条件下，可用20mmol/L的HEPES保护细胞，以避免在换液和CO2供应出现问题时的pH波动；DMEM配合使用10%CO2，常用于培养骨髓杂交瘤克隆制备单克隆抗体。促进克隆生长的方法⑥基质的处理：在血清浓度低时，多聚赖氨酸可以提高人成纤维细细胞的贴瓶率(a)在培养瓶中加入用超纯水溶解的1mg/ml的多聚右旋赖氨酸(约0.2ml/cm2)(b)弃去多聚赖氨酸，用PBSA(0.2ml/cm2)清洗培养瓶，瓶一瓶可立即使用或存放几周纤黏连蛋白也可提高很多细胞的贴瓶率，培养瓶可用含有5μl/ml纤黏连蛋白的培养基预处理。⑦胰酶：纯化的胰酶(经两次结晶)可能优于粗提的胰酶(用量0.05μg/ml)，但观点不一。Mckeekan(1977)发现用纯化的胰酶4℃消化细胞后，贴瓶率显著提高。饲养层细胞有些细胞克隆培养不好的原因与它们在低密度下没有生存能力有关，要让细胞在克隆生长的密度下生存，一种方法就是让细胞在生长受阻的饲养层细胞中克隆培养。饲养层细胞可以提供营养物质、生长因子和基质成分，它们能使克隆培养的细胞更容易生存。细胞经射线照射后用胰酶消化(或者先用胰酶消化后再经辐射)将这种细胞低密度种在培养皿中，可以提高细胞的克隆培养率；若高密度接种，可以为细胞选择性生长提供汇合的贴壁细胞层。方案：饲养层的准备概要：接种同源或异源细胞——比如来自小鼠胚胎的细胞在受测细胞克隆培养之前用射线照射或药物处理中等密度的饲养层细胞，使其失去增殖能力。无菌材料第二代13天胎龄小鼠胚胎成纤维细胞；克隆培养用培养基；丝裂霉素C,5uglml，溶于BSS或无血清培养基中非灭菌材料X射线或60Co源，能在30min或更短时间内释放30Gy(可以取代丝裂霉素C)操作步骤用胰酶消化原代培养的胚胎成纤维细胞，以每毫升105个细胞再种入培养瓶中；50%汇合时加入丝裂霉素C，其含量为2ug/106个细胞或0.25ug/ml过夜，或用30Gy射线照射细胞；处理完毕，更换培养基，再培养24小时，胰酶消化后，在新的培养基中以每毫升5X104个细胞接种(每平方厘米104个细胞)；继续培养24~48小时，种入克隆培养的细胞。克隆的分离当克隆培养用于筛选特定的细胞株时，形成的集落就需要分离，以进一步增殖。如果单层贴壁细胞直接在多孔板上克隆培养，那么集落可以用胰酶在各自的孔中消化分离。如果是在培养皿中克隆培养，集落之间就没有了物理分隔，这时必须创造一个分隔条件。在撤掉培养基之后，在集落周围放一个不锈钢或陶环，以达到分隔的目的。方案：用克隆环分离细胞克隆概要：将集落套在瓷质克隆环、玻璃环、PTFE环或者不锈钢环中，用胰酶消化后移至24孔板或12孔板种或直接种于培养瓶中。无菌材料克隆培养环(高温高压灭菌)；硅油(160℃干热灭菌1h)；加样器枪头；0.25%胰蛋白酶；生长培养基；24孔板或培养瓶；无菌镊。非灭菌材料加样器；标记笔，装在显微镜转换盘上，可对所筛选的克隆集落划上标记选择性抑制剂利用选择性培养基控制培养条件是一种筛选微生物的标准方法，但这种方法应用于培养动物细胞却有局限性；大多数已证明通常会成功的选择性培养基均是无血清的配方；很多代谢抑制剂目前应用都很成功：用右旋缬氨酸代替培养基中的左旋缬氨酸，并证实只有含右旋缬氨酸氧化酶的细胞才能在这种培养基中很好地生长(Gilbert&Migeon1975)；用这种方法已经筛选出肾小管上皮细胞、牛乳腺上皮细胞、大鼠脑内皮细胞等；但不能有效地针对人成纤维细胞。选择性抑制剂转染的细胞可以通过对一些药物的抗性来进行筛选如新霉素Neo及其类似物G418、潮霉素和氨甲喋呤；只要在细胞转染的DNA序列中加入可以赋予细胞耐药的基因：如neo(氨基糖苷磷酸转移酶)、hph(潮霉素B磷酸转移酶)、dhfr(二氢叶酸还原酶)，再向培养物中加入适当浓度的选择性药物就可以筛选出稳定转染的细胞。单纯疱疹病毒(HSV)的TK基因也可用于阴性筛选：这种基因能使丙氧鸟苷活化为一种细