基因的损伤修复和基因突变xu课件

第四章DNA的复制

Chapter4DNAReplication生物机体的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子中，表现为特定的核苷酸排列顺序，并通过DNA的复制由亲代传递给子代。在后代的生长发育过程中，遗传信息从DNA转录给RNA.然后翻译成特定的蛋白质，以执行各种生物功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。复制是指以原来DNA分子作为模板合成出互补分子的过程；转录是在DNA分子上合成出与其核苷酸顺序相对应的RNA的过程；而翻译则是在RNA的控制下，根据核酸链上三个核苷酸决定一个氨基酸的三联体密码规则，合成出具有特定氨基酸顺序的肽链(蛋白质〉过程。在某些情况下RNA也可以是遗传信息的基本携带者。细胞在每次分裂的过程中，整个基因组都必须精确地复制一次。如何保证这一点？两个原则(1)DNA复制的启动决定了细胞的进一步分裂;(2)复制过程完成前，细胞是不会发生分裂的。电镜观察DNA复制（真核生物）4.1.1半保留复制概述DNA复制的假设：有3种可能：

1）全保留式；

2）半保留式；

3）混合式。实验证明：方法：将E.Coli培养在以15NH4Cl为唯一氮源的培养基中生长；提取其DNA；进行氯化铯密度梯度离心。再移至14N培养基中生长、提取DNA、离心分析。4.1.2DNA复制的一些基本概念1.复制子基因组内能独立进行复制的单位称为复制子(replicon)或复制单位。每个复制子都含有控制复制起始的起点(origin)和控制复制终止的终止点(terminus)。因此，从复制起始点到终止点的区域为一个复制子。原核生物的复制起点通常在它染色体的一个特定位点，并且只有一个起点，因此原核生物的染色体只有一个复制子；真核生物染色体可以在多个位点起始复制，有多个复制起点，是多复制子。不同生物复制子的数目质粒一般是一个自主环状的DNA基因组，构成一个独立复制子；原核生物基因组中一般只含一个复制子，在唯一的起始点启动就会引起整个基因组复制；真核生物基因组含多个复制子（一般40-100kb/个）。2.复制起点复制起点在细胞内可以起始一个复制循环，并可控制复制起始反应的频率。3.复制终点大肠杆菌DNA是环形分子，复制终点(termini)在起始点OriC的相对位置(旋转180°，距离OriC270kb处。复制从QriC开始，双向进行(bidirectionalreplication)。复制叉(replicationfork)向两个相反方向沿环状DNA前进，最后两个复制叉相遇在一个位点而停止，此停止的部位称为终止位点(ter)。5.复制方向通过放射自显影实验可以判断DNA复制是双向还是单向进行。复制开始时，先用低放射的3H-脱氧胸苷标记大肠杆菌。数分钟后，再转移到含有高放射性的3H-脱氧胸苷培养基中继续进行标记。这样在放射自显影图像上，复制起始区的放射性标记密度比较低，感光还原的银颗粒密度也较低；继续合成区标记密度较高，银颗粒密度也就较高。若是单向复制，银颗粒的密度分布是一端低，另一端高；而双向复制，则是中间密度低，两端高。由大肠杆菌所获得的放射自显影图像都是两端密度高，中间低，证明大肠杆菌染色体DNA是双向复制。(1)相向复制从两个起点分别起始两条链的复制，即有两个复制叉的生长端，但在复制叉中只有一条链是模板。(3)双向复制复制起始于一个位点，但向两侧分别形成复制叉，向相反方向移动。在每个复制叉上，两条DNA模板都被拷贝。在原核细胞和真核细胞中，这种复制方式最普遍。枯草芽泡杆菌染色体DNA复制虽是双向的，但两个复制叉移动的距离不同。一个复制叉先在染色体上移动1/5的距离后停下来，等待另一复制叉完成4/5的距离。质粒R6K两个复制叉的移动也不对称，第一个复制叉到达1/5距离即停下来，从反方向开始形成第二个复制叉并完成其余部分的复制。质粒ColE1的复制完全是单向的，复制叉只向一个方向移动。(2)滚动环式复制滚动环式(rollingcircle)复制是单向复制的特殊方式。是很多病毒、细菌因子以及真核生物中基因放大的基础。滚动环式复制步骤如下：1)首先(十)链DNA复制起点被特异性蛋白切开，形成缺口，使游离出5’和3’-OH端游离出来，(+)链的5’端与双链脱离开；2)以(-)链DNA为模板，(+)链的3’-OH端为引物，由DNA聚合酶III催化聚合反应，从(+)链的3’-OH端加入dNTP，使链不断延长，3’端不断延伸，取代原有的(十)链，被取代的(+)链不断从(一)链上剥离出来；3)(+)链从3’端不断被合成，好像(-)链在滚动，(+)链5’形成越来越长的“尾巴”；4)原来的(+)链被滚动出一定长度之后，作为模板重新合成(一)链；5)最后形成线性的正负双链分子，或进一步两端连接形成双链，这种双链DNA是滚动环式复制的中间产物，称为复制型(replicativeform，RF)。滚环复制φX174噬菌体由一个单链环状DNA组成，这条链称为正（+）链；合成的互补链称为负（一）链。双链体的复制以滚环复制方式进行。TheAproteiniscis-acting(3)D环（D-loop)式另-种单向复制的特殊方式称为取代环或D环式复制。线粒体DNA的复制即是一例（纤毛虫线粒体DNA为线性分子，其复制方式与此不同）。双链环在固定点解开进行复制，但两条链的合成高度不对称，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代，在电镜下可以看到呈D环形状。待一条链复制到定程度，露出另一条链的复制起点时，才开始复制。表明复制起点是先以条链为模板起始合成DNA的一段序列；两条链的起点并不在同一点上，由于两条链的起点分开一定距离，所以产生D环复制。叶绿体DNA的复制也采取D环的方式，双链环两条链的起点不在同一位置，但同时在起点处解开双链，进行D环复制，故称为2D环复制。7.复制速度真核生物DNA的复制速度比原核生物慢。真核生物染色体DNA的复制实为多复制子的同步复制。虽然各复制子发动复制的时间有先后之差，但就整个细胞而言，能够满足细胞对DNA的需要。真核生物与原核生物染色体DNA的复制还有一个明显的区别是：真核生物染色体在全部复制完成之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核生物中，起点可以连续发动复制。真核生物在快速生长时，往往采用更多的复制起点。4.1.3DNA复制的酶体系与DNA聚合反应有关的酶包括多种DNA聚合酶和DNA连接酶。1.DNA聚合酶催化的反应在有适量DNA和镁离子存在时，DNA聚合酶(DNApolymerase)能催化4种脱氧核糖核苷三磷酸合成DNA。反应底物为dATP、dGTP、dCTP和dTTP4种脱氧三磷酸核苷酸，统称为dNTP。在DNA聚合酶催化下，以有3’-羟基的核酸链作为引物，dNTP被加到DNA链的末端，同时释放无机焦磷酸，链延长的信息来自对应的互补链。①以4种dNTP作为底物；②反应需要接受模板指导；③链延伸需有引物3

’-羟基存在；④链延伸方向为5

’→3

’

；⑤产物DNA的极性与模板相对。2.大肠杆菌DNA聚合酶大肠杆菌中共有5种不同的DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶I、II、Ⅲ、IV和V。3.DNA连接酶DNA连接酶（DNAligase)催化双链DNA切口处的5

’-磷酸基和3’-羟基生成磷酸二酯键。连接反应需要能量：大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以腺苷三磷酸(ATP)作为能量来源。4.1.4DNA的半不连续复制走向为3’→5’的DNA新合成链实际上是由许多5’→3’方向合成的DNA片段连接起来的。当DNA复制时一条链连续，另一条链不连续，因此称半不连续复制。前导链（leadingstrand):

以3’→5’

链为模板，新生链以5’→3’方向连续合成；后随链(laggingstrand):

由冈崎片段连接成的DNA链为后随链。DNA合成的引物：所有已知的DNA聚合酶都不能发动新链的合成，只能催化已有链的延伸反应。然而RNA聚合酶则不同，它只需要DNA模板存在，就可以在其上合成新的RNA链。研究证明，在DNA模板上需先合成一段RNA引物，DNA聚合酶从RNA引物的3'-OH端开始合成新的DNA链。4.1.5DNA合成的高保真性DNA的复制是一个高保真的系统。与DNA复制的忠实性有关的因素包括RNA引物作用、DNA聚合酶的自我校正功能、细胞内几种校正和修复系统等。4.1.6DNA复制的拓扑性质两条互相缠绕的双螺旋DNA分子具有许多拓扑学上的性质和关系。在DNA分子的复制、重组、转录和装配等过程中都涉及拓扑异构体的转变。DNA拓扑异构体之间的转变是通过拓扑异构酶(topoisomerase)实现的。有两类的拓扑异构酶:I型和II型拓扑异构酶。对原核生物来说，拓扑异构酶I主要消除负起螺旋，但也能引起DNA的其他拓扑结构转变；II型拓扑异构酶是一种DNA旋转酶，通过引入负超螺旋，从而抵消了DNA复制中产生的正超螺旋。真核生物的该酶略有不同。4.2细菌DNA复制的过程以大肠杆菌为例。大肠杆菌染色体DNA的复制过程分为3个阶段:起始、延伸和终止。其间的反应和参与作用的酶与辅助因子各有不同。在DNA合成的生长点即复制叉上，分布着各种各样与复制有关的酶和蛋白质因子，它们构成的复合物称为复制体(replisome）。DNA复制的阶段表现在其复制体结构的变化上。4.2.1大肠杆菌复制的起始起始阶段涉及多种酶和蛋白质辅助因子的参与。4.2.2复制的延伸在复制的延伸阶段，同时进行着前导链和后随链的合成。前者持续合成，后者分段合成，亲代DNA双链解开，由SSB稳定并形成复制叉之后，前导链与后随链的合成便有所不同。1.复制叉多种酶和蛋白因子在复制起始点参与组装形成复制叉。包括特异性识别和结合于起始点的起始蛋白、参与组装但不涉及以后DNA合成步骤的荷载因子(loadingfactor)等。复制叉组装大体分为两步。第一步是起始因子对复制起始点的识别和双螺旋DNA解链的开始。第二步是荷载因子和解链酶以复合体形式吸纳到复制起始点，使双链DNA解开，形成复制所需要的单链模板，从而形成复制叉。2.复制体和回环模型在复制叉上，同一个DNA聚合酶III分子负责双链DNA同时协同地复制前导链和后随链，即前导链的合成和后随链的合成同步进行。已知DNA聚合酶III全酶是一个不对称的异二聚体，有两个DNA合成的催化中心，前导链和后随链的合成各利用一个催化中心。大量研究证实，这样一个复杂的复制过程由复制体承担，复制是发生在复制体上的一系列反应。回环结构模型能够解释在不连续复制的延伸中，复制叉内处于两个不同模板上的前导链和后随链之间具有什么样的空间和时间关系。当两条链同时复制时，后随链模板经过复制叉的部位就形成一个回环，以适应双链同时向前行进。这种复制模型称为回环模型.复制延伸过程归纳：前导链的合成比较简单，全酶异二聚体的一个亚单位与前导链模板结合，在引物RNA合成的基础上，连续地合成DNA，其行进方向与复制叉一致。后随链的合成分为4个步骤：1)后随链的模板形成回环，聚合酶异二聚体中的一个亚单位和引发体都与后随链模板结合，准备开始合成引物。2)引物行进5’→3’方向的合成，由于模板呈环状，所以引物行进的方向就与复制叉行进方向一致。3)模板链的环不断扩大，在引物3'-OH端开始合成DNA片段，合成方向为5'→3'，行进方向与复制叉行进方向一致。4)当DNA新片段合成到距离前一片段的5‘端仅剩一小空隙时，酶的行进受阻，模板链解环，新合成的片段随即移动到与复制叉行进相反的方向，至此后随链的一个冈崎片段的合成完成。与此同时，前移的复制体内引物酶又寻找新的引发位点，起始转录段新的RNA引物。后随链模板又绕DNA聚合酶III形成一个新回环，再次合成下一个冈崎片段。DNA聚合酶III合成的冈崎片段，由DNA聚合酶I切除5'端的RNA引物，填补片段之间的空缺，最后由DNA连接酶把它们连接成一条完整的子代链。3.复制的终止细菌环状染色体的两个复制叉向前推移，最后在终止区(terminusregion)相遇并停止复制，该区含有多个约22bp的终止子(terminator)位点。两个复制叉在终止区相遇后停止复制，复制体解体，其间仍有50~100bp未被复制，由修复方式填补空缺，其后两条链解开。4.3真核生物DNA的复制真核生物的DNA缠绕在组蛋白核心上，每形成一个核小体大约相当于引入1.2个负超螺旋。真核生物DNA复制的同崎片段长约200bp，相当于一个核小体DNA的长度。真核生物染色体有多个复制起点。4.3.1DNA聚合酶真核生物有多种DNA聚合酶。从哺乳动物细胞中分离出了5种，分别为α、β、γ、δ、ε。真核DNA聚合酶和细菌的基本性质相同。聚合酶α和δ是染色体复制所需要的酶；聚合酶ε相当于细菌聚合酶Ⅰ，是一种修复酶；聚合酶β也是一种修复酶；聚合酶γ是线粒体DNA合成酶。4.3.2真核生物染色体端粒的复制原核生物的染色体是环状的，其5'端冈崎片段的RNA引物被切除后可借助DNA模板链的另半圈向前延伸得到填补。但真核生物的线性染色体在复制叉到达线性末端时，前导链可以连续复制直到线性染色体模板链的末端，产生和释放完整的子代染色单体。而线性的后随链模板是以不连续方式复制的，不能像原核那样在切除引物后填补5'端的空缺。如果生物体没有特殊的修复机制，后随链的模板链就很可能被不完整复制，从而使后随链子代DNA的5'端序列逐步缩短，导致每次细胞分裂时由后随链合成产生的子代染色单体DNA都要短一截。真核生物能够通过形成端粒(telomere)结构以及具有逆转录酶活性的端粒酶(telomerase)来防止DNA复制时后随链缩短而产生的染色体缺短。端粒酶可以外加重复单位到5‘端上，维持端粒一定的长度。端粒酶，具有逆转录酶活性，能利用自身携带的RNA链作为模板，以dNTP为原料，以逆转录的方式催化互补于RNA模板的后随链DNA片段的合成，防止因后随链缩短而产生的染色体缺短，它是RNA与蛋白质组成的一种核糖核蛋白（RNP)复合体。4.4DNA复制的