兽医生物制品学幻灯片

生物技术诊断制剂姓名何俊导师黄毓茂学号2004228044专业预防兽医传染病生物技术诊断制剂

随着分子生物学的飞速发展，新型诊断技术不断涌现，与之相配套的生物技术诊断制剂也应运而生，尤其是基于分子水平的诊断制剂发展迅猛。生物技术诊断制剂大致包括重组表达抗原（recombinantantigen）、核酸探针（nucleicacidprobe,geneprobe）、聚合酶链反应（polymerasechainreaction,PCR）基因芯片（genechip）等。生物技术诊断制剂不仅特异性强，而且可以获得常规方法无法制备的一些诊断制剂，或能克服常规程序制备的诊断制剂的缺陷。同时，基于生物技术制备的诊断制剂易于标准化、产业化。一、重组表达抗原

基因工程重组表达抗原是用DNA重组技术，将编码特定抗原的基因插入原核或真核表达质粒，再转入宿主细胞中使其高效表达，然后运用生物化学分离、纯化技术，提取表达产物等，最终制成诊断用重组表达抗原。近年来，重组表达抗原已显示出独特的优越性，具有高特异性、高纯度、均质性好、重复性强、成本较低、并可大批量生产等优点，尤其是应用这一制造技术获得了常规方法无法制备的诊断抗原，如乙型肝炎病毒等一些病原体尚无法获得纯培养，但应用生物技术已制备出标准的乙型肝炎各组分诊断抗原，对人兽共患病特别是高危险病原体（如免疫缺陷病毒、结核分枝杆菌、炭疽杆菌等）的诊断抗原制备，应用生物技术更是具有无可比拟的优点。重组表达抗原的发展前景十分广阔。二、核酸图谱分析

核酸图谱分析包括核酸电泳图谱、核酸酶切图谱、寡核苷酸指纹图谱等。适用于这些诊断技术的试剂，主要是核酸提取、酶切、电泳等生化和分子生物学试剂，商品化程度已很高。（一）核酸电泳图谱分析

核酸电泳图谱是指分离纯化的核酸，由于分子量的差异而在电泳中迁移速率不同，形成不同的带型。通过带型异同度的分析可确定生物体间的遗传关系。质粒图谱分析和RNA图谱分析都是电泳图谱分析。1．质粒图谱分析质粒是细菌细胞内能自主复制的染色体外的DNA，它是耐药性、毒力因子等特殊遗传特性的载体。多数细菌往往含有大小和数量不等的质粒，具有相对稳定性，因此质粒图谱分析是细菌分型和流行病学的重要工具，具有诊断价值。该法简便、特异、快速、可靠，缺点是对一些无质粒或质粒不稳定的菌株，以及质粒分子量相同而核苷酸序列不同的菌株无分辨能力。（二）核酸酶切图谱分析

染色体DNA、质粒DNA或RNA经反转录而形成的cDNA，经限制性内切酶切割后产生大小不同的片段，经琼脂糖电泳后可形成不同的带型，即核酸酶切图谱，又称DNA指纹图谱。用相同的限制性内切酶消化的DNA所产生片段的异同程度，直接反应生物体间的遗传关系。用不同的限制性内切酶消化DNA可分析基因间的连锁关系。本法可用于比较不同病原体基因组的差异，了解它们之间的遗传关系。限制性酶切片段长度多态分析（RFLP）是核酸酶切图谱分析的延伸，它在一些细菌分子流行病学研究中显示出重要价值，因为细菌染色体DNA限制性酶切片段长度多态性是细菌基因特征的重要指标。RFLP与核酸杂交技术联合使用则结果更容易判断和解释。（三）寡核苷酸指纹图谱分析

将纯化的RNA经一种特殊的RNA酶（通常为T1酶）消化后，产生许多理化特性和大小不同的寡核苷酸片段，经聚丙烯酰胺凝胶双相电泳分离后进行放射自显影，形成一类似指纹的图谱，即寡核苷酸指纹图谱。该法在RNA病毒的研究中得到了广泛应用，如基因组遗传多样性研究，同一病毒不同毒株的地理分布、历史演变和宿主类群关系的研究，野毒株与疫苗株的比较等。三、核酸探针

用放射性同位素、地高辛或生物素等标记核酸分子或其片段的一条链作为核酸探针，与处理样本中存在的互补链结合为双链，这个反应就称为核酸杂交或分子杂交。核酸杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交。根据方法不同，核酸杂交又可分为原位杂交和转印杂交。在转印杂交中，检测DNA的称为Southern杂交，检测RNA称为Northern杂交。核酸杂交已广泛用于特定基因的检测和基因转录活性的研究，具有重要的诊断价值。核酸探针制备的主要步骤包括目的片段的获取，将信号分子（如放射性同位素35S、32P，地高辛，生物素，荧光素等）标记核酸分子或其片段，探针纯化，质量鉴定，探针保存等。（一）核酸探针制备技术基因探针的获取1.cDNA探针：通过提取纯度较高的相应的mRNA,反转录成相应的cDNA，再利用它与目的基因DNA相作用2.基因文库法：将染色体DNA通过超声波或者限制性内切酶不完全水解，从而得到许多片段，选取长度在15-20kb的片段重组到噬菌体中，经过体外包装，再转录到大肠杆菌，在固体培养基上可得到许多噬菌斑，然后用菌斑原位杂交筛选含有目的的基因作为探针。3.寡核苷酸探针：人工合成低于50个核苷酸的任意序列的寡核苷酸片段作为探针二：基因探针的标记方法1.放射性探针的标记法缺口平移标记法：在适当浓度的DNaseⅠ作用下，在双链DNA上随机造成3’-OH端缺口，而大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ有修补缺口的能力，其具有5’→3’外切酶活性，在缺口处按5’→3’方向切除单核苷酸；同时有5’→3’的聚合酶活性，在缺口处3’端加入底物中的单核苷酸，因而可从切口的5’除去核苷酸并与3’端核苷酸的加入同时进行，以互补的DNA单链为模板合成新的DNA，这时在反应液中加入一种或多种标记的核苷酸（P-32,H-3）,从而形成高放射性的DNA探针随机引物启动法：随机引物是人工合成的长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物。对于任何一个用作探针的DNA片段，随机引物混合物中都会有一些六核苷酸片段可以与之结合，起到DNA合成引物的作用。将这些引物与变性的DNA单链结合后，以4种dNTP（其中一种是标记物标记的dNTP）为底物，合成与探针DNA互补的且带有标记物的DNA探针。

cDNA探针标记：在以mRNA制备cDNA同时加入标记的脱氧核苷酸即可。末端标记法：在大肠杆菌T4噬菌体多聚核苷酸激酶的催化下将γp（32）ATP上的γ-磷酸连接到寡核苷酸的5’末端上。2.非放射性标记生物素标记探针：将生物素结合于三磷酸脱氧尿苷上，使之成为2’三磷酸脱氧尿嘧啶-5’烯丙胺生物素，这种标记的生物素可以与另一种蛋白质-亲和素结合，亲和素事先用酶标记，在底物的作用下显色而被检测出来。光敏生物素标记：光敏生物素在可见光（350nm）的短暂照射下，能与核苷酸碱基反应，并牢固的结合成光敏生物素标记探针。半抗原-抗体-酶法：将畄体半抗原地高辛甙元通过一手臂与dUPT连接，用随机启动延伸法标记DNA探针，与目的DNA杂交后，杂交分子用酶联免疫法检测。化学标记法：用化学试剂如乙二胺交联活化的生物素（酰基-氨基戊酸-N羟基琥珀酰胺脂）或生物素酰肼取代胞嘧啶的N4氨基；用戊二醛等做交联剂将生物素化碱性大分子欧联在G碱基的N7位；合成的寡核苷酸可以用乙二胺交联活化生物素与5’末端磷酸基进行标记。免疫标记法抗杂交体标记法：在杂交过程中作为探针的核酸与其互补的核酸能形成杂交体，杂交体本身具有一定抗原性，因而可用抗杂交体的抗体并结合带标记的第二抗体对杂交体进行检测半抗原标记法：通过对已知核酸片段做一定的修饰，在探针的某些部位连接半抗原，探针通互补核酸片段杂交后，与半抗原的特异性抗体结合，再通过结合带标记的第二抗体对形成的杂交体进行检测。（二）基因探针的杂交与检测一.杂交膜的制备方法1.斑点杂交法：将样品DNA变性后直接吸附在硝酸纤维膜上，加上探针直接杂交，或将细胞或病毒点在膜上，再经变性、杂交；或将瓶皿上的菌落或菌斑，原位的吸附在膜上。优点：简单、迅速；可在同一膜上同时进行多个样品检测；对于核酸初提样品检测效果也很好。缺点：不能确定所测基因的分子量，且特异性不高斑点杂交1、原理及步骤：提取病毒、细菌、CellDNA↓点样品至膜、干燥、固定↓

探针、DNA变性、杂交↓

洗膜、放射自显影↓结果分析

2、应用：1）混合样品DNA鉴定2）基因缺失检测3）基因表达分析

2.Southern印迹杂交将DNA用限制性内切酶酶切，然后用琼脂糖凝胶电泳将所得DNA按分子量大小分离，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射性自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。应用：克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性和定量分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析。带有DNA片段的凝胶DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上转膜杂交、显影凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印迹杂交的技术流程3.Northern印迹杂交

Northern印迹同Southern印迹原理步骤一样，只是在电泳前先进行变性原理及步骤：提取病毒、细菌、Cell总RNA↓

提纯分离、变性RNA

↓

琼脂糖凝胶电泳分离RNA↓

转移至硝酸纤维素膜↓

杂交检测二.杂交反应基本过程1.预杂交：预杂交液中常加入鲑鱼精DNA，若标记探针是cDNA或RNA，预杂交液中还需加入多聚A以阻止特异性结合,42℃4-6h或过夜。2.杂交：探针100℃变性，迅速冷却，加入预杂交液中，42℃一天3.洗涤：2×SSC+0.1%SDS常温洗涤两次，1×SSC+0.1%SDS65℃洗涤两次，每次15分钟。4.放射自显影或显色反应（检测）使用放射性同位素标记物，采用放射自显影。若采用非放射性同位素标记物，则采用显色反应。显色反应将依据偶联的酶类而定。四、聚合酶链反应（PCR）

PCR技术是DNA体外扩增技术，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下引物沿5‘→3’方向不断延伸，利用4种dNTP合成新的互补DNA链，然后在高温下变性为单链，再在低温下使引物DNA片段与其复性，并在DNA聚合酶的作用下开始新一轮DNA合成。经如此反复循环（变性－退火－延伸）30~60次左右就可在短时间内将目的DNA扩增数百万倍。PCR技术为疾病诊断提供了简便、快速、特异、敏感的检测手段，适于检测不宜分离培养或含量极微的样品中病原体特定基因片段的有无，或分析不同样品中此片段的异同。为了检测RNA样品可以先进行反转录，然后进行PCR扩增DNA，这就是RNA的反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）。PCR与酶切图谱分析和分子杂交技术联合应用可获得更好的效果。PCR技术1.原位PCR技术：也就是在组织细胞里进行PCR反应，它既能鉴定带有靶序列的细胞，又能标出序列在细胞内的位置，对于分子和细胞水平上研究击毙昂的发病机理和临床过程以及病理转归有重大意义。2.巢式PCR：由两套引物和两轮PCR组成，先对靶DNA进行第一步扩增，然后从第一次反应产物中取出少量作为反应模板进行第二次扩增，第二次引物与第一次反应产物互补，扩增所得即为目的产物。优点是提高扩增倍数和反应准确性；缺点是第二次扩增交叉污染概率大。巢式PCR示意图3.反向PCR(IPCR):反向PCR用于扩增已知序列两端的未知DNA片段，因此一对引物与常规PCR一样与已知序列互补但是方向却是相反的。IPCR步骤主要包括酶切、自身连接还化、扩增和序列分析。4.重组PCR重组PCR技术是将两个或者多个基因片段通过一个基因片段的3‘端和另一个基因片段5’的互补，利用重叠延伸的方法进行高效和快速的体外基因片段拼接和突变的一种。5.多重PCR多重PCR又叫多重引物PCR或复合PCR,它是在同一反应体系中加入两对或两对以上的引物，同时扩增出多个核苷酸片段的PCR反应。主要用于多种病原微生物的同时检测和鉴定，以及同种病原微生物不同基因型鉴定和某些遗传病及癌基因的分型鉴定。PCR的应用一：基础研究基因克隆基因组测序基因突变制备单链模板基因功能和表达调控研究二：临床应用遗传性疾病的检测和分析肿瘤病因和发病机制研究检测病原体三：卫生安全食品微生物检测转基因食品检测动植物检疫其他：法医学，环境科学研究五、基因芯片

基因芯片是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品中的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。基因芯片又称DNA芯片（DNAchip）、DNA微阵列（DNAmicroarray）、寡核苷酸微芯片（oligonucleotidemicrochip）。基因芯片上世纪90年代初，由美国Affymetrix公司的Fodor博士提出并开始基因芯片技术的研究，至今，基因芯片技术在生物医学各个领域中的应用均已取得巨大突破。基因芯片已有初步成形的产品问世，可应用于基因表达谱分析、新基因的发现、基因突变与多态性分析、基因组文库作图、疾病的诊断与预测、药物筛选，以及司法与刑侦、环境与食品卫生监督等。基因芯片的制备技术（一）原位合成是指直接在芯片上用四种核苷酸合成所需探针的基因芯片制备技术，主要包括：1．原位光刻合成是由美国Affymetrix公司发展的结合了半导体工业的光刻技术和DNA合成技术制造高密度核酸阵列的基因芯片制备技术。2．原位喷印合成芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和