丙种球蛋白的电泳制备课件

丙种球蛋白的电泳制备目录基本资料丙种球蛋白的制备方法丙种球蛋白的操作步骤一、基本资料简介：中文简称：“丙球”英文名称：γ-globulin、gammaglobulin【别名】免疫血清球蛋白，普通免疫球蛋白，人血丙种球蛋白，丙种球蛋白，静脉注射用人免疫球蛋白（pH4）性状：冻干制剂应为白色或灰白色的疏松体，液体制剂和冻干制剂溶解后，溶液应为接近无色或淡黄色的澄明液体，微带乳光。但不应含有异物或摇不散的沉淀。注：由于人血中的免疫球蛋白大多数为丙种球蛋白（γ-球蛋白），有时丙种球蛋白也被混称为“免疫球蛋白”(immunoglobulin)。药理作用

注射丙种球蛋白是一种被动免疫疗法。它是把免疫球蛋白内含有的大量抗体输给受者，使之从低或无免疫状态很快达到暂时免疫保护状态。由于抗体与抗原相互作用起到直接中和毒素与杀死细菌和病毒。因此免疫球蛋白制品对预防细菌、病毒性感染有一定的作用。

适应症丙种球蛋白是血液中一种蛋白质，它通常来源于许多人献的血液，常被用来：防止和治疗感染，对慢性疲劳症有显著的改善作用；适用于预防传染性肝炎，麻疹等病毒性疾病感染；治疗先生性丙种球蛋白缺乏症；可提高对某些严重细菌性和病毒性疾病感染的疗效。实验方法分离胶的制备浓缩胶的制备待分离样品的准备加样电泳脱色染色实训原理

圆盘电泳是带电粒子(胶体颗粒、离子等)在电场的作用下在特定的介质中向与其电荷性质相反的电极方向定向泳动的现象.广泛应用于生物大分子的分离和鉴定。它是利用丙烯酰胺和双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成大分子的凝胶物。

它同时兼有分子筛和电泳效应。当样品通过凝胶进行电泳时，便可以根据其样品中各分子的电荷和分子量的不同而泳动出不同的区带。

由于聚丙烯酰胺凝胶化学性质较琼脂稳定，很少带有侧基，在电泳过程中，吸附作用与电渗作用均小，所以该技术的分辨率均高于其它琼脂电泳技术实训器材与试剂试剂：

猪血清样品、分离胶缓冲液、凝胶溶液、10%过硫酸铵（AP）、电极缓冲液、固定液、染色液、脱色液

仪器：圆盘电泳槽、电泳仪、电泳玻璃管、滴管、烧杯、刻度吸管、加样枪、注射器等。

三、操作步骤1、装管取已准备好的玻管，从一端量至7cm处，用笔划线。起始端用胶布包封好后，插入橡皮塞中，垂直放好。2、配胶

分离胶的制备：（1）将清洁、无破碎干燥的小玻管一端（挑选一下比较平的那头），用胶布贴封后，朝下垂直放入有机玻璃凝胶玻管架的孔中，并在小玻管的7.0cm处作一记号。（2）、用自动取液器吸取上述配好的分离凝胶贮液沿着小玻管内壁小心准确加入7.0cm高。（3）、凝胶溶液加毕后，随即吸取蒸馏水，加至管中的凝胶表面，使其表面覆盖一水层（水封，1.0cm高）。在灌胶和封水的过程中，操作要轻，以避免产生气泡。（4）、将加注好的凝胶管于室温下静置，以进行聚合反应，在正常情况下大约30-60分钟后，待界面出现明显分层现象时，表明胶已聚合完毕，即可加浓缩胶。3、灌胶及封胶将混匀好的胶液，用滴管缓慢注入玻璃管，当加到液面距离电泳玻璃管上口1cm时停止。注意在加的过程中不要混进空气，随即用注射器经针头沿凝胶管壁缓慢加入蒸馏水至管满，防止氧化，室温下聚合15-20min。4、制样取血清30ul，加0.025%溴酚蓝5ul，20%蔗糖65ul，混匀即可。浓缩胶的制备：（1）、轻轻倒掉分离胶玻管上端的液体，并用吸水纸吸去未倒净的液体（但不能触及胶面）然后先小心用浓缩胶贮液洗涤凝胶表面1-2次，再小心加入该浓缩胶贮液1.5cm高。（2）、随后同样加1.0cm高的蒸馏水层覆盖胶表面。大约也在20-40分钟后，待浓缩胶出现乳白色时，表明胶已聚合完毕。（3）、加样：取一根上次做好的凝胶小玻管用吸水纸轻轻吸去浓缩胶表面上的水层，然后用微量注射器加10ul测试样品溶液。（4）、装置凝胶管：将加好样品的凝胶管的加样端（上端），插入上电泳槽孔中，然后将已插满凝胶管的上电泳槽放入加有电极溶液的下电泳槽内。此时凝胶玻管下端管口易产生气泡，可通过轻轻摆动凝胶玻管以去除气泡，插入上电泳槽的玻管上端，用滴管轻轻滴满电极溶液，以免产生气泡，最后将上电泳槽装满电极液。（5）、接通电源：接通电泳槽的两端电极与电泳仪的电源，内槽装阴极缓冲液,外槽用阳极缓冲液恒压电泳,先40V约1.5h,当样品进入分离胶时,电压升至60V约1.5h。确定电泳结束时，不应将溴酚兰跑出凝胶管，以防止标准分子量中的最低分子量蛋白质也跑出凝胶管。6、剥胶电泳结束后，取下玻璃管，将一支带有长针头的注射器吸有适量水（蒸馏水或自来水），从浓缩胶一端紧贴玻璃管壁缓慢插入针头，一面注入蒸馏水一面缓慢旋转玻璃管。靠水流的压力和润滑作用使凝胶和玻璃管的内壁分开，待水流从另一端流出时，再慢慢将针头退出（注意操作中不要把胶条搅碎）。然后用洗耳球轻轻在胶管的一端加压，将胶条从玻璃管中缓慢滑出。

7、固定剥胶完毕后，将胶条置于固定液中固定20-30分钟

8、凝胶染色：将取出的凝胶柱，放入一合适干净的培养皿内，然后加入适量考马斯亮蓝染色液中，于摇床上进行振摇染色30分钟，完毕，回收染色液，用清水洗凝胶柱2-3遍。在染色的同时，凝胶中蛋白质区带亦被固定。

9、凝胶脱色：在培养皿（或试管）内加入适量脱色液于摇床上进行振摇（2小时/次，需3次）脱色多次直至色带完全清晰为止。

10、绘图：最后根据染色所出现的带数和位置进行绘图，以确定被分析样品的组分。另一种方法是通过密度扫描仪扫出各组分的峰形位置，这样不仅能确定组分，而且能比较出各组分所占比例（如果要计算出各分离区带的相对迁移率，可参考教课书）。四、注意事项样品的离子强度、pH值尽可能与浓缩胶溶液相同，如含大量盐类时，应透析除盐。最适合的样品蛋白量是10μg～100μg，加入样品量要少，血清样品3μl～5μl，免疫球蛋白样品可加15μl～20μl。凝胶柱面应平整，操作过程切勿产生气泡，否则电泳区带不整齐。电泳中电流应保持稳定，避免电流强度过高，而产生大量的热使分离失败。电泳开始，样品应于