分子生物学实验

分子生物学实验教案PAGEPAGE29分子生物学实验教案（2012～2013学年第二学期）伊犁师范学院化学与生物科学学院2013年分子生物学实验教案课程名称分子生物学实验任课教师总学时数36学分1授课对象2011级生物科学实验项目名称与学时分配序号项目名称学时1质粒DNA的提取和纯化32DNA浓度和纯度的测定33琼脂糖凝胶电泳检测DNA34PCR扩增获取目的基因35DNA酶切36目的DNA的回收37目的基因与载体的体外连接38大肠杆菌感受态细胞的制备39大肠杆菌感受态细胞的转化310重组子的筛选311PCR鉴定重组子312酶切鉴定重组子313表达载体的构建（选修）314外源基因的诱导表达（选修）315SDS检测目的蛋白（选修）3使用教材分子生物学实验指导，教学参考资料朱旭芬，史锋，赵小立等编著，《基因工程实验》，浙江大学生命科学学院全国生物技术实验师资培训教材，2004。魏群主编，《分子生物学实验指导》，高等教育出版社、施普林格出版社，1999。吴乃虎编著，《基因工程原理》，高等教育出版社，1997。[美]J.姆布鲁克等编著，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002。《分子生物学实验》简介分子生物学实验是根据基因工程的本质而设计的一门综合性和设计性的实验课程。本实验课程涵盖基因的主要操作过程，由内容相关的一系列实验组成，强调实验的连续性和一体化，包括目的DNA片段的PCR扩增及电泳鉴定，质粒DNA的抽提、纯化及电泳鉴定，质粒DNA的限制性内切酶酶切及体外连接，感受态细胞的制备及转化，转化子鉴定及接种培养，重组质粒抽提、纯化、酶切与及检测及重组蛋白表达分析等实验。通过本课程学习，使学生学习和掌握分子生物学中常用的各种实验技术，包括培养学生形成正确的实验操作习惯，正确地使用各种实验仪器与试剂、详细记录实验的过程与结果、对实验中所出现的问题做合理的分析，培养学生分析问题和解决问题的能力。该课程自设置以来不断进行实验内容的调整和改进，并在实验运行机制和课时设置方面进行了大胆的尝试和革新，既让学生自主地设计实验技术路线、实验材料准备、实验操作和结果分析，发挥学生的主动和创新意识，增加对实验的兴趣和认识，又让学生学习和熟悉科研课题研究思路，达到掌握开展科学研究的方法和具体实验操作的目的。分子生物学实验计划表细菌的培养质粒提取(PUCATPH，pBSKS，pGEX-2TKPET28c)DNA浓度和纯度的测定琼脂糖凝胶电泳检测DNAPCR扩增（PUCATPH）获取目的基因序列酶切表达质粒酶切表达质粒PET28cPCR产物的酶切、电泳确定；酶切克隆载体pBSKS、电泳确认；电泳回收表达载体片断电泳回收表达载体片断试剂盒回收目的基因条带；试剂盒回收酶切过的克隆载体目的基因片断与表达载体体外连接目的基因片断与表达载体体外连接目的基因与pBSKS载体的体外连接感受态制备，连接产物转化感受态细胞BL21制备感受态宿主菌，重组质粒热击转化感受态细菌DH5a感受态制备，连接产物转化感受态细胞BL21诱导目的基因表达，转化子筛选蓝白斑选择筛选转化子诱导目的基因表达，转化子筛选挑取白色单菌落，扩大培养；蓝斑作对照检测表达情况检测表达情况菌液PCR扩增提取质粒，酶切质粒电泳检测重组子插入片断大小，确认正确插入的重组子说明：本程序基本涵盖了基因工程的整个实验流程，包括目的基因的获得，克隆载体的构建，表达载体的构建，载体和目的基因的连接、转化，重组子的筛选、目的基因的诱导表达。限于我们的实验条件，感受态细胞的的制备和目的基因的表达可能比较粗放，请大家谅解。实验1质粒DNA大量提取和纯化【时间安排】：3学时【实验类型】：基本训练【目的要求】：了解：质粒DNA的一般特征特性和提取质粒的原理；掌握：最常用的提取质粒DNA的方法；熟悉：质粒DNA大量提取和纯化的方法步骤。【实验原理】：质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，在基因工程中具有及其广泛的应用价值，因此，质粒的分离、提取和纯化是最常用、最基本的实验技术。质粒（plasmid）是一种独立、稳定的遗传因子，是在细菌等细胞中染色体之外的DNA分子，大小范围在1～200kb以上不等。大多数来自细菌细胞的质粒是双链、共价闭合的环状分子，以超螺旋形式存在。作为理想的克隆载体的质粒必须具备以下四点：（1）一个复制起点（raplicationorigin）；（2）一个或多个选择性标记基因，如抗生素基因；（3）带有一个人工合成的、含有多个限制性酶切位点的多克隆位点（Multiplecloningsite,MCS）；（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。天然质粒存在不同程度的局限性，现在常用的质粒大多数都是经过修饰和改造过的质粒。应用质粒作为基因克隆的载体分子，一个重要的条件是获得批量纯化的质粒DNA分子。带有质粒的宿主（如大肠杆菌）细胞中，除了质粒外，还有基因组DNA和各种RNA的存在，并且还含有菌体组分的蛋白质、脂类物质等。提取质粒就是从这些混合物中将质粒分离出来。已经建立了多种从细菌中提纯质粒DNA的方法，这些方法无一例外都包括以下三个步骤：（1）培养细菌，使质粒大量扩增；（2）收集和裂解细菌并除去蛋白质和染色体DNA；（3）分离和纯化质粒。本实验是采用SDS裂解法制备质粒DNA。人们使用碱与SDS裂解法从E.coli中分离制备质粒DNA已有20多年的历史。其原理是：将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清液中。尽管碱性溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒DNA双链仍不会彼此分离，这是因为它们在拓扑学上是相互缠绕。只要OH－处理的强度和时间不要太过，当pH值恢复到中性时，DNA双链就会再次形成。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，然后被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中沉淀下来。离心除去变性剂后，就可以从上清液中回收复性的质粒DNA。SDS裂解法制备质粒DNA通常使用SolutionⅠ、SolutionⅡ、SolutionⅢ三种溶液，其生化作用原理：SolutionⅠ：溶菌液，葡萄糖增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解；EDTA螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制Dnase对DNA的降解作用（因为Dnase作用时，需要一定的金属离子作辅基）。SolutionⅡ：核酸在pH大于5，小于9的溶液中是稳定的，当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在SolutionⅡ中NaOH的浓度为0.2mol/L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA和质粒DNA的变性；SDS是离子型表面活性剂，它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3－……R+——蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。SolutionⅢ：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH值至4.8必须加入大量的冰醋酸。所以SolutionⅢ实际上是NaAc-HAc缓冲液。其作用是为了把pH12.6的抽提液中和，调pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol/LNaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电贺，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。【仪器与试剂】：主要仪器：微量移液器、离心机、离心管、冰盒、恒温水浴锅、干燥器等。主要试剂：LB培养基、抗生素、TE溶液、RNase溶液、NaAc溶液、酚/氯仿/异戊醇溶液、乙醇、缓冲液和溶液等LB（Luria-Bertani）培养基：配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入细菌培养用胰化蛋白胨（bacto-tryptone）10g；细菌培养用酵母提取物（bacto-yeastextract）5g；NaCl10g，充分溶解后用5mol/LNaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1L，在15lbf/in2（1.034×105Pa）高压蒸汽灭菌20分钟。少量配制应按比例减小！SolutionⅠ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）SolutionⅡ：200mmol/LNaOH，1%（m/v）SDS（要现用现配，室温使用！）SolutionⅢ：3mol/LKAc（pH4.8）溶液。可这样配制：5mol/L乙酸钾60.0ml冰乙酸11.5mlH2O28.5ml混合（所配成的溶液中钾离子浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。保存于4℃，用时置于冰浴中。）其他溶液：酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），酚可用可不用！NaAc：3mol/L【重要实验步骤和教学设计】：实验准备：制备含有相应抗生素的固体和液体LB培养基，将保存的菌液涂布到固体培养基平板上培养单菌落（1～2天）。挑取单菌落在含有对应于某一抗生素(如Amp或Kan)的LB培养液（25mL）中接种，37℃振荡培养过夜，使细菌处于对数生长期（约12－16个小时）。吸取10mL培养液于eppendorf管中，12000rpm离心5分钟，弃去上清液，可用微量移液器适当吸取残余上清。细菌沉淀于管底。加入1mL溶液Ⅰ，用手指或涡旋振荡器剧烈弹震，使菌体充分悬浮，室温下静置5min。加入2mL新配制的溶液Ⅱ，盖紧管盖，上下温和颠倒eppendorf管2－3回，以混匀内容物（千万不要剧烈振荡）,冰浴静置5min。加入1.5mL浴冷的溶液Ⅲ，上下颠倒混匀数次，冰浴条件下静置5min。12000rpm离心10min，将上清液移至新的eppendorf管中（约400µL）。加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），充分振荡混匀，12000rpm离心5min。吸取上层水相至新的离心管中，加入十分之一体积量的3mol/L的pH5.2NaAc,再加入2倍体积（约1

mL）的预冷的无水乙醇。10.放入－20℃冰箱中静置30分钟，11.弃去上清，加入1mL预冷的70%乙醇，12000rpm离心5min，洗涤沉淀。12.弃去上清，沉淀在室温下自然干燥。然后加入40µLTE溶液。13.取5µL的质粒与2µL的6X上样缓冲液混合后，在0.8％的琼脂糖凝胶上电泳检测。14.将所获得的质粒DNA样品置于4℃【实验注意事项】：注意微量移液器、离心机的正确使用方法；在记入溶液Ⅱ时只需上下温和颠倒离心管即可，千万不能剧烈振荡。经抽提后，吸取上清液时注意不要把中间的白色层吸入，其中含有蛋白质等杂质。【思考题】：作为理想的克隆载体的质粒必须具备哪些特点？SDS裂解法制备质粒DNA的原理是什么？SDS裂解法制备质粒DNA中三种溶液的生化原理分别是什么？除了SDS裂解法外，还有什么方法可以制备质粒DNA？【实验后记】：实验2分光光度法测定DNA的浓度和纯度【时间安排】：3学时【实验类型】：基本训练【目的要求】：了解：分光光度法测定DNA浓度和纯度的原理；掌握：分光光度法测定DNA浓度和纯度的技术方法；熟悉：分光光度法测定DNA浓度和纯度的实验操作步骤和注意事项。【实验原理】：前面提取得到的DNA的浓度和纯度都是未知的，在后续的DNA酶切、连接及转化等实验中需要一定的浓度和纯度要求，因此要测定DNA的浓度和纯度。测定DNA的方法通常有：紫外分光光度法；琼脂糖凝胶电泳法（也叫荧光光度法）（1）紫外分光光度法：组成DNA的碱基均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值在波长为250～270nm之间，腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm，鸟嘌呤：276nm，胸腺嘧啶：264.5nm，尿嘧啶：259nm。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后其最大吸收峰不会改变，但核酸的最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm。这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。在波长260nm紫外线下，10OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA为40μg/ml；单链寡聚核苷酸为20μg/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。分光光度法不但能够确定核酸的浓度，还可以通过测定在260nm和280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280）估计核酸的纯度。DNA的比值为1.8，RNA的比值为2.0。若DNA比值高于1.8，说明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。当然也会出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况，所以有必要结合凝胶电泳等方法鉴定有无RNA，或用测定蛋白质的方法检测是否存在蛋白质。紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25μg/ml的核酸溶液。（2）琼脂糖凝胶电泳法（荧光光度法）：对于很稀的核酸溶液，可以用琼脂糖凝胶电泳法。溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，它插入到DNA分子中形成荧光结合物，使发射的荧光增强几十倍，而荧光的强度正比于DNA的含量，将已知浓度的标准样品作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。用量只需要5-10ngDNA即可，肉眼观察可检测0.05µg-0.1µg的DNA。该方法只是估计水平，另外还应考虑DNA或RNA样品中分子大小与标准对照中核酸分子的长度。【仪器与试剂】：主要仪器：紫外分光光度计、石英杯、离心管、微量移液器；主要试剂：实验1提取的质粒样品、纯水。【重要实验步骤和教学设计】：吸取5µLDNA样品，加水至1ml混匀后，转入分光光度计的石英比色杯中。如果样品很少，可以用0.5ml的比色杯，上述核酸样品与水的用量缩小一半。先用1ml水对分光光度计校正为零点。在260nm和280nm分别读出光密度，DNA样品的浓度我OD260×核酸稀释倍数×50/1000；RNA样品的浓度OD260×核酸稀释倍数×40/1000；浓度单位为μg/µL。按步骤1的稀释方式，DNA或RNA的浓度（μg/µL）均为OD260的10倍；如OD260为0.1，则样品的浓度就为1μg/µLDNA或RNA。这样稀释倍数非常便于计算。若为DNA样品，OD260/OD280比值大于1.8，说明仍存在RNA，可以考虑用RNA酶处理样品；小于1.6，说明样品中存在蛋白质或酚，应再用酚/氯仿抽提，用乙醚抽提后，以乙醇沉淀纯化DNA。RNA样品OD260/OD280比值小于2，也应该考虑再用酚/氯仿抽提。【实验注意事项】：使用石英杯时要注意拿取方法，不要直接拿透光的那两个侧面；测量前要调零，测量不同样品时要冲洗石英杯；正确开、关紫外分光光度计。【思考题】：实验得出的数据是否合理？为什么？如果实验测得A260/A280＝1.8，是否能说明提取的DNA样品非常纯净？为什么？【实验后记】：实验3琼脂糖凝胶电泳检测DNA【时间安排】：3学时【实验类型】：基本训练【目的要求】：了解：琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理；掌握：琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法；熟悉：琼脂糖凝胶电泳检测DNA的操作过程。【实验原理】：琼脂糖凝胶电泳是检测DNA的常用方法。琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取，是一种聚合链线性分子，实验室中常用两种琼脂糖，即常熔点的和低熔点的，它们都是琼脂的衍生物，具有很高的聚合强度和很低的电内渗，都是良好的电泳支持介质。核酸分子是两性解离分子，在pH3.5时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷酸基团中只有第一个磷酸解离，整个核酸分子带正电荷，在电场中向负极泳动；在pH值为8.0～8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动。不同大小和构象的核酸分子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于DNA分子的电荷密度大致相同，即相同数量的链DNA几乎具有等量净电荷，它们以同样速度向正极移动，因此，在一定电场强度下，DNA分子的移动速率取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片断泳动速度不一样，可进行分离。其迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对质量相同，但构型不同的DNA分子。如抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使提取的质粒可能存在三种构型：①超螺旋的共价闭环状质粒（CC）；②解旋开环质粒DNA（OC）；③线状质粒DNA（L）。电泳中，泳动最快的是CC，其次为L，最慢的为OC。DNA在琼脂糖中的电泳迁移速率主要取决于：样品DNA分子大小、DNA分子构象、琼脂糖浓度、电场电压、缓冲液、温度等。加入EB，并将已知浓度的标准样品和已知分子量大小的标准DNA片断（即marker）作琼脂糖凝胶电泳对照，可分别检测样品的浓度和分子量大小。【仪器与试剂】：主要仪器：微波炉、稳压电泳仪、电泳槽、紫外灯箱、三角瓶、量筒、微量移液器、离心管、记号笔等；主要试剂：实验1提取的质粒样品、溴化乙锭、溴酚兰、电极缓冲液、琼脂糖、上样缓冲液、标准DNAmarker。【重要实验步骤和教学设计】：准备好制胶板，封边防漏。根据所需浓度称取一定量的琼脂糖，加入适量的0.5×或1×TBE或其它电泳缓冲液，微波炉加热或沸水裕使琼脂糖溶解。等凝胶温度降到55℃～60℃时，加入溴化乙锭（EB）至终浓度为0.5µL/ml，摇匀。将琼脂糖倒入制胶板中，凝胶厚度一般为0.3～0.5cm，迅速插上梳子，检查有无气泡。凝胶充分凝固后，小心取出梳子，并撤除两端封边挡板。将凝胶放置于电泳槽中，加入相应的电泳缓冲液，使液面略高于胶面。在DNA样品中加入1/6的上样缓冲液，混匀后，稍离心，然后用移液器将DNA样品加入样品孔中。接通电源，选择适当电压和电泳方向，使DNA样品由负极向正极电泳。当指示剂接近凝胶末端时，切断电源，停止电泳。10、取出凝胶，在紫外灯下观察，摄像。【实验注意事项】：制作琼脂糖凝胶时，要戴手套，不要滴洒在台面或地面，千万不要触碰溴化乙锭（EB），因为它是癌变的强烈诱变剂，用后用水彻底冲洗干净；加样时不要慌，不要抖动，以免碰裂加样孔导致各个加样孔中的DNA相互渗透观看电泳结果时不要拥挤，认真辨认是否提取到了目的质粒DNA。【思考题】：DNA电泳方向与pH值有什么关系？在一定电场强度下，DNA分子的移动速率取决于分子筛效应？DNA在琼脂糖中的电泳迁移速率与样品DNA分子大小、DNA分子构象、琼脂糖浓度、电场电压、缓冲液、温度等有什么样的关系？【实验后记】：实验4PCR扩增获取目的基因【时间安排】：3学时【实验类型】：设计【目的要求】：了解：PCR反应的基本原理和引物设计的一般要求；掌握：通过PCR反应获取目的基因的实验技术；熟悉：PCR反应体系的加样顺序和PCR仪的正确使用方法。【实验原理】：获取目的基因是非常艰巨的工作，通常要求：靶基因表型明确；单个靶基因编码优良性状或疾病基因；靶基因是一对等位基因控制的显性基因；容易获得目的基因的突变体和重组子等。但通过设计合理的基因克隆策略还是可以分离获得目的基因的。使用的方法通常有：PCR扩增法、核酸探针筛选法、免疫反应筛选法、酶活性筛选法、差示杂交法、DNA标签法、染色体巡查法（chromosomewalking）、图位克隆法、酵母双杂交法等等。聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）简称PCR技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应。分三步：①变性，通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA；②退火，当温度降低时由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少；③延伸，在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下，5′→3′的聚合酶催化以引物为起始点DNA链延伸反应。以上三个步骤为一个循环，每一循环产物可作为下一个循环的模板，几十个循环后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到大量复制，可达2×106～7拷贝。引物的设计在PCR反应中极为重要，应遵循几条原则：①碱基组成，G﹢C含量应在40～60%，4种碱基要在引物中分配均匀，如没有多聚嘌呤或多聚嘧啶的序列，并且没有二核苷酸重复序列；②长度，18～25个核苷酸，上下游引物的长度差别不能大于3bp；③不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列的存在，这种序列可能成发夹结构，如果是这种结构在PCR条件下稳定，它会非常有效地组织寡聚核苷酸和靶DNA之间的复性；④一个引物的3′末端都不能和其他任何引物互补，否则会形成引物二聚体。精心设计引物，应用热启动PCR或降落PCR或特制的DNA聚合酶都可以避免二聚体形成；⑤解链温度（Tm）：计算出两个引物的Tm值相差不能大于5℃，扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10℃，这些特性保证了扩增产物在每个PCR循环可有效地变性；⑥3′末端，每个因为的3′末端碱基应尽可能为G或C，但又不推荐使用3′末端有……NNCG或……NNGC序列的引物，因为末端GC碱基高的自由能可以村级发夹结构的形成，还可能产生二聚体；⑦向引物5′末端添加限制性酶切位点，噬菌体启动子等序列，因为位于DNA分子5′末端的限制性酶切位点的切割效率比较低，所以，引物应当超出限制性内切酶识别位点2－3个核苷酸，即至少包含有2－3个保护碱基；本实验已知目的基因是在质粒pUCATPH中的抗潮霉素基因，见图1要求通过PCR技术将目的基因扩增出来，关键是引物设计，在设计引物时要考虑到后续实验中的DNA酶切、连接和转化等，所用的克隆载体为pBSKS，见图2图2【仪器与试剂】：主要仪器：微量移液器、PCR仪、离心机、微波炉、电泳槽、电泳仪、紫外灯箱等。主要试剂：模板DNA、质粒DNA、引物、Tag酶及其他PCR反应体系的成分、DNA标准Marker、进口琼脂糖、TE、上样缓冲液、乙醇等。【重要实验步骤和教学设计】：取一个0.2mL的eppendorf管，在其中添加以下各种成分。模板DNA(质粒PUCATPH)2.5µL引物Doc1F0.5µL（注意：引物自己设计！）引物Doc1R0.5µL（注意：引物自己设计！）10XBuffer2.5µLdNTP2µLddH2O17µLTaq酶（5U/µL）0.2µL总体积25µL稍离心。将反应管放入PCR热循环仪，按下列条件设计程序，进行PCR反应。预变性94℃3min变性94℃50sec退火62℃50sec30个循环各个温度可以自己设定！延伸72℃1.2min补充延伸72℃10min保存10℃forever反应结束后，取8µL反应液与2µL上样缓冲液混合后用1.0％琼脂糖凝胶电泳，以DNAmarker做标准对照，鉴定PCR产物是否存在以及大小。将三个PCR反应产物混合在一个管子中，然后添加1/10体积的3mol/L的pH5.2NaAc和2倍体积的冰冷无水乙醇，－20℃冰箱中放置30min以上。12000rpm离心5分钟，将eppendorf管倒置于吸水纸上，室温干燥5分钟。30µLTE溶解沉淀，电泳确认回收PCR产物。【实验注意事项】：在实验步骤1中，每组做三个重复反应，先在一个0.5mL的eppendorf管中配制4个反应的混合液（不加模板），然后分装到已加入了模板的0.2µL的eppendorf管中。整个操作过程最好在冰上进行，尤其Taq酶一定要在冰上操作。DNA片断的回收，用DNA凝胶回收试剂盒，详细操作见实验6【思考题】：在设计PCR引物时，为什么在目的基因的上游、下游分别加上限制性内切酶的识别序列？在配制PCR反应混合液时为什么要把各个反应管相同的成分加起来混合配制再分装？为什么要多配一管的用量？除了PCR扩增获取目的基因外，还有什么方法可以获得目的基因？列出其中几种的原理。【实验后记】：实验5DNA酶切【时间安排】：3学时【实验类型】：基本训练【目的要求】：了解：限制性内切酶的一般特性，为了实现DNA的体外重组，选择合适的限制性内切酶，对质粒载体DNA和供体目的DNA进行酶切，产生粘性末端的原理；掌握：通过对DNA的酶切，学会设计构建体外重组DNA分子，根据目的基因合理选择载体与限制性内切酶以及DNA的酶切技术；熟悉：DNA酶切操作的实验步骤。【实验原理】：分子生物学实验中常用到限制性内切酶（Restrictionendonuclease），它能够识别和切割双链DNA（ds-DNA）分子内特殊核苷酸序列。几乎所有种类的原核生物都能产生限制性内切酶，根据其结构核作用特点分成Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型三类。Ⅰ型、Ⅲ型核酸内切限制酶一般都是大型的多亚基的蛋白复合物，既具有内切酶的活性，又具有甲基化酶的活性。Ⅱ型酶由于其核酸内切酶活性和甲基化作用是分开的，而且核酸内切作用又具有序列特异性，所以在基因克隆中有特别广泛的用途。在基因工程操作中通常使用Ⅱ型酶。（一）Ⅱ型限制性内切酶的一般特性各种限制性内切酶能专一地识别碱基顺序；识别碱基对数目一般为4、5、6bp的长度范围；识别顺序大多数为二重对称，酶切后一般形成粘性末端，少数产生带平端的DNA片段；不同来源的限制性内切酶可以切割相同的序列，这些酶称为同列酶。有的限制性内切酶识别位点不同，但对DNA切割后产生相同的粘性末端；一般都以Mg2+为唯一的辅助因子，并要求有一定的盐离子浓度；有些限制性内切酶易受到甲基化酶的抑制，因此需要消除甲基化酶，才能顺利酶解DNA；1U酶：是1微克的纯DNA在指定缓冲液中，37℃（应是在理想条件下）酶解60分钟完全酶切时所用的酶的活力；限制性内切酶都较昂贵，极易失活，注意保存其活力。（二）设计构建体外重组DNA分子选用的限制性内切酶都不能在目的基因内部有专一的识别位点。构建体外重组DNA分子，最简单的重组方式就是用两种不同的限制性内切酶同时分别酶切目的基因DNA的两端和载体，分别产生两个不同的粘性末端。这样构建的重组DNA分子，目的基因DNA片段是从一个方向插入质粒载体中的，重组的效率较高，也易于筛选出重组子。如果目的基因DNA片段只能用一种限制性内切酶进行切割，产生末端或粘性末端，那么载体也要用同样的酶进行酶切，这样构建的重组DNA分子，目的基因DNA片段以两个方向插入质粒载体中，甚至目的基因DNA串连后再插入载体中，载体的自连也较多，因而重组效率差。这样筛选重组子比使用两种不同限制性内切酶构建的重组DNA分子工作量大些。（三）酶切反应反应需要Mg2+和一定盐离子浓度，如果缓冲液中盐离子浓度使用不当，会使酶的识别位点发生改变。反应温度一般是37℃，极少个别酶要求在25℃、30℃、50℃、60℃、65℃等。酶切反应时间有30min、60min、2hours或过夜，一般来说，酶纯度不佳，酶切时间不能太长。【仪器与试剂】：主要仪器：离心机、离心管、微量移液器、冰盒、电泳仪、电泳槽、恒温水浴锅等。主要试剂：质粒、PCR产物、限制性内切酶、限制酶缓冲液、上样缓冲液、乙醇、TE等。【重要实验步骤和教学设计】：在0.5mLeppendorf管中加入下列成分APCR回收产物（目的基因）：ddH2O7µL回收产物10µL(约1µg)10X通用Buffer2µLHindⅢ(10U/µL)0.5µL如果前面自己设计的不是这两种酶，则使用自己设计的酶BamHⅠ(10U/µL)0.5µL如果前面自己设计的不是这两种酶，则使用自己设计的酶总体积20µLBpBSKS质粒酶切ddH2O7µLpBSKS质粒10µL(约2µg)10X通用Buffer2µLHindⅢ(10U/µL)0.5µLBamHⅠ(10U/µL)0.5µL总体积20µL混匀，稍离心，在37℃反应2-4小时，或过夜。加入反应终止液以终止酶切反应（一般可省略）取10µL酶切反应液，加入3µL上样缓冲液，然后进行琼脂糖凝胶电泳，参照标准分子量marker，回收目的条带。【实验注意事项】：DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的正确性，确认样品确实被加入反应体系，酶的操作必须严格在冰浴条件下进行，用完后立即放回－20℃冰箱。使用两种酶同时进行DNA酶切时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行，可以采用通用缓冲液（universalbuffer）,但有时还会难以找到合适的universalbuffer。为了节省酶的使用，本实验我们将为大家配好反应混合液，请同学们分装即可。各种酶切反应的缓冲液归纳为三类：高盐、中盐和低盐离子强度的缓冲液。市售各类酶都配有制定的缓冲液，如果有两种酶要用两种不同浓度的缓冲液，一般先用低浓度，然后再补加盐调节至更高盐浓度。DNA的纯度直接影响酶切产物的质量，DNA中的DNA酶切蛋白、RNA及SDS、酚、氯仿、乙醇、EDTA等杂质都影响酶切效果。DNA中的核酸酶、蛋白（杂酶）往往随酶切时间的增长使DNA降解越严重。DNA中的杂DNA也有竞争酶的切口，往往造成切不动，DNA中的有机离子与溶剂抑制酶的活性，也使酶失活，DNA切不动或使酶解产生星号反应。产生星号反应的原因还有因酶浓度太大，离子浓度太低等，DNA的构型多，也影响酶切效果。【思考题】：限制性内切酶酶解中通常遇见什么问题？分析可能存在的原因，有什么解决的办法？在选择限制性酶酶切目的基因片断时，我们必须充分考虑什么因素？实验中用一种酶酶切和用两种酶酶切，对后续实验有什么影响？【实验后记】：实验6目的DNA的回收【时间安排】：3学时【实验类型】：基本训练【目的要求】：了解：常用目的DNA的回收方法；掌握：从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的实验技术；熟悉：胶回收试剂盒回收DNA的操作流程。【实验原理】：从含有各种不同大小的DNA混合物（如：内切酶酶解的DNA）中分离纯化特定分子量的DNA片段是基因工程操作的基础工作。实验室中最常用的是凝胶电泳分离和回收的方法。许多生物公司都已经开发从凝胶中回收DNA片段的试剂盒。本实验计划采用UNIQ－10柱式DNA胶回收试剂盒回收目的DNA。该试剂盒主要含有UNIQ－10柱式离心管和BindingBuffer、Washsolution、ElutionBuffer三种溶液。UNIQ－10柱式离心管中含有一小片滤膜，通常是DEAE纤维素即二乙基氨基乙基（diethylaminoethyl）纤维素，在它的纤维骨架链上，连接有许多阳离子交换基团，是一种吸附阴离子基团的阴离子交换纤维素，它能结合带负电荷的DNA分子。DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后，将DNA片段转移到DEAE纤维素上，再用高离子缓冲液将其从DEAE滤膜上洗脱下来。BindingBuffer主要是融解琼脂糖凝胶块，释放DNA；Washsolution冲洗掉杂质；ElutionBuffer洗脱并保存DNA。回收DNA片段的方法还有很多，如：DEAE纤维素纸插片电泳法、电泳洗脱法、低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法、玻璃粉末洗脱法聚丙烯酰铵凝胶电泳回收法、蔗糖梯度超速离心分离法等等，这里不具体阐述。【仪器与试剂】：主要仪器：电泳仪、电泳槽、紫外观察箱、手术刀、eppendorf离心管、电子天平、离心机、恒温水浴锅、主要试剂：UNIQ－10柱式DNA胶回收试剂盒、无水乙醇【重要实验步骤和教学设计】：A从琼脂糖凝胶中回收DNA通过琼脂糖凝胶电泳将目的片断与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀割下含需回收的琼脂块，放入1.5mL离心管中。判断DNA片断的位置时，要尽可能使用长波长紫外光，在紫外光下照射的时间尽可能短。按400µL/100mg琼脂糖凝胶的比例加入BindingBufferⅡ，置于50～60℃水浴中10分钟，使胶彻底融化。加热融胶时，每2分钟混匀一次。将融化的胶溶液转移到套放在2mL收集管内的UNIQ－10柱中，室温放置2分钟。8000rpm室温离心1分钟。取下UNIQ－10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ－10柱放入到同一个收集管中，加入500µLWashsolution，8000rpm室温离心1分钟。重复步骤4一次。取下UNIQ－10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ－10柱放入同一个收集管中，12000rpm室温离心15秒。将UNIQ－10柱放入一根新的1.5mL离心管中，在柱子膜中央加入40µLElutionBuffer或水（ph>7.0）,室温或37℃放置2分钟。12000rpm室温离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片断，可立即使用或存放于－20℃备用。B从溶液中回收DNA:根据溶液的体积和所要回收的DNA的含量，加入3倍体积的BingdingBufferⅡ。如果溶液的体积不足50µL，加TE补足到50µL，再加入150µLBingdingBufferⅡ混匀。以下同琼脂糖胶中回收DNA步骤3－8。【实验注意事项】：挖取琼脂糖凝胶块时，要戴手套，注意溴化乙锭（EB）的安全使用；加入Washsolution、ElutionBuffer时，要对着滤膜滴加，又不要刺破滤膜；注意：对于高浓度的胶（1.5－2.0％），每100mg胶加入700µLBindingBufferⅡ，加热融胶的时间可延长到15分钟，以保证全部融化。提高洗脱温度到55-80℃有利于DNA的洗脱效率。【思考题】：在挖取琼脂糖凝胶块时为什么尽量减少不含目的DNA的凝胶？为什么尽量用长波长紫外线，并且尽量减少紫外线的照射时间？列举几个DNA回收的其他几种方法原理。【实验后记】：实验7目的基因与载体的体外连接【时间安排】：3学时【实验类型】：基本训练【目的要求】：了解：DNA连接酶的一般特性、连接反应条件和DNA连接方式；掌握：用T4DNA在连接酶降载体与目的基因连接起来，构建体外重组DNA分子，同时学习几种DNA连接的方法。熟悉：DNA连接反应所用的连接酶以及连接反应体系的构建。【实验原理】：DNA连接酶催化双链DNA中相邻碱基的5’磷酸和3’羟基间磷酸二脂键的形成，利用DNA连接酶将适当切割的载体DNA与目的基因DNA进行共价连接，就能构建重组DNA分子。构建体外重组DNA分子一般是在T4DNA连接酶的作用下，有Mg2+ATP存在的连接缓冲系统中，将上述二种酶切后的DNA分子进行连接。（一）DNA连接酶的作用步骤1、T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物（腺苷酰酶）2、酶-AMP复合物再结合到具有5′－磷酸基和3′－羟基切口的T4DNA上，使DNA腺苷化。3、产生一个新的磷酸二酸二脂键，把缺口封起来。（二）DNA的连接方式在T4DNA连接酶的作用下的DNA连接反应，一般讲是随机的，连接方式有：①自连；②两种片段相连；③三个片段以上的自连与互连，一般这种几率较少，但也有。可以通过对载体、目的基因的处理以控制和调整DNA的有效连接。如，通过控制载体DNA与目的DNA的分子比例，可以影响重组率。一般情况下，对分离片段来讲，载体DNA的摩尔数与目的基因的摩尔数之比为1︰5，但目的基因的比例太多，容易产生自连后插入载体的多聚体。连接体积太大，自连机会多。（三）连接反应的条件1、缓冲液含有Mg2+作为辅助因子，ATP提供能量，同时也有保护和稳定酶活性的物质，如DTT（二硫苏糖醇）、BSA（小牛血清蛋白）。2、温度：连接反应温度在37℃时有利于连接酶的活性，但该温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此在实际操作时，DNA分子粘性末端的连接反应温度是折中采取催化反应与末端粘合的温度，一般为12～163、时间：12～16h（过夜）或7～8℃（四）几种DNA连接方法1、粘性末端连接法：即用专一性限制性内切酶酶切产生粘性末端，再通过DNA连接酶（T4DNA连接酶）进行体外连接。2、平头末端连接法：是利用某些酶对DNA能切出平整的末端，然后利用T4DNA连接酶将两者连接。它要求DNA浓度高，酶用量比粘性末端的连接大20～100倍。3、多聚核苷酸投影法：采用任一种限制性内切酶把DNA切开，利用DNA末端转移酶把互补的多聚核苷酸（polyA与polyT或polyG与polyC）连接到两者DNA片段的末端，然后用DNA聚合酶将其连接。4、人工街头（Waker）法：在要连接的外源基因与载体DNA的末端，先接上一段互补的人工接头，这个接头就是酶切酶的识别位点，因此可再用一种或二种限制性内切酶将其切开，产生粘性末端，再将外源基因与载体DNA连接。【仪器与试剂】：主要仪器：离心管、16℃培养箱、离心机、微量移液器、冰盒等。主要试剂：酶切后的基因DNA片段和载体DNA片段、T4DNA连接酶以及10倍的连接缓冲液。【重要实验步骤和教学设计】：在一个0.5mL的eppendorf管中加入2µL酶切后的载体与6µL目的基因片断。添加1µL的10X连接buffer以及1µL的T4DNA连接酶即PCR产物6µL酶切质粒（pBSKS）2µL10X连接buffer1µLT4DNA连接酶1µL总体积10µL混匀后3000rpm短暂离心将液体全部甩到管底。16℃条件下保温过夜或4℃过夜。连接产物用于转化感受态细胞。【实验注意事项】：连接时外源基因量要多些，载体的量要少些，这样碰撞的机会就多些，否则载体自身环化就比较严重。连接酶比较昂贵，酶的用量不要过多。连接反应需要ATP提供能量，在连接Buffer中含有ATP，所以尽量避免连接Buffer反复冻融。【思考题】：影响DNA体外连接的因素有哪些？实验过程应注意什么问题？【实验后记】：实验8大肠杆菌感受态细胞的制备【时间安排】：3学时【实验类型】：基本训练【目的要求】：了解：制备大肠杆菌感受态细胞的原理；掌握：大肠杆菌感受态细胞的制备方法和技术；熟悉：制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤。【实验原理】：在原核生物中，转化是一种普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处在一种感受状态有很大的关系。所谓感受态是指细胞处于容易吸收外源DNA的状态，它是由受体菌的遗传性所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子等影响。实验中通常使用氯化钙制备感受态大肠杆菌细胞。因为钙离子能够诱导大肠杆菌形成感受态细胞。对于钙离子诱导的完整细胞转化而言，菌龄、CaCl2处理时间、感受态细胞的保存期以及热脉冲时间都是很重要的因素，其中感受态细胞通常在12～24小时内转化率最高，之后转化率急剧下降。因此在制备感受态细胞时，将细胞培养至OD600为0.4～0.6后放入冰浴中使之停止生长，然后进行细胞处理。外界环境因子环腺苷酸（cAMP）及钙离子（Ca2+）能够提高受体细胞的感受态水平。另外，细胞的感受态一般出现在生长对数期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备感受态大肠杆菌的方法还有Hanahan方法（用于高效转化）和Inoue方法（用于制备超级感受态细胞）。【仪器与试剂】：主要仪器：离心管、三角瓶、摇床、超净工作台、冷冻离心机、冰盒、碎冰、微量移液器等。主要试剂：LB培养基、大肠杆菌菌株、CaCl2溶液甘油等。【重要实验步骤和教学设计】：从大肠杆菌DH10B平板上挑取一个单菌落接于2ml的LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。取0.5ml菌液转接到一个含有50ml的LB液体培养基锥形瓶中，37℃振荡培养2～3h，此时，OD60≤0.4～0.6，细胞数务必＜108将菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min，使培养物冷却至0℃离心10min（4000r/min），回收细胞。倒出培养液，将管倒置1min以便培养液流尽。用冰冷的0.1mol/L10ml悬浮沉淀，立即放在冰上保温30min。0～4℃，4000r/min，离心10min回收细胞。用冰冷的0.1mol/LCaCl22ml悬浮细胞（务必放冰上）。分装细胞，每200µL一份。此细胞为感受态细胞。【实验注意事项】：严格无菌操作，谨防杂菌污染。实验中凡是涉及溶液的转移、分装等需要敞开实验器具的操作，均应该在无菌超净工作台进行。细胞最好是从-70℃和-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。所用的CaCl2应该是高纯度的。整个操作均需要在冰上操作，不要离开冰浴条件，否则细胞转化率将会降低。【思考题】：实验过程中应注意什么问题？制备出来的感受态细胞在什么时候做转化最佳？【实验后记】：实验9大肠杆菌感受态细胞的转化【时间安排】：3学时【实验类型】：基本训练【目的要求】：了解：转化大肠杆菌感受态细胞的原理；掌握：大肠杆菌感受态细胞的转化方法和技术；熟悉：转化大肠杆菌感受态细胞的实验步骤。【实验原理】：转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌，并使细菌细胞的生物学特性发生可遗传的改变的过程。用冰冷CaCl2溶液处理和短暂热休克处理是转化的常用方法，也是最便宜而简便的方法。其原理是当细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中时，菌体细胞膨胀造成球形，同时转化混合物中的DNA形成抗Dnase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经过42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长1小时后，球状细胞复原并分裂增殖，重组子中的基因在被转化的细菌中得到表达，再通过选择性培养基平板即可筛选出所需要的转化子。转化的方法还有：Hanahan方法、Inoue方法、PEG法、电击法等等。【仪器与试剂】：主要仪器：超净工作台、离心机、42℃恒温水浴锅、37℃培养箱、离心管、三角瓶、摇床、冰盒、碎冰、微量移液器等。主要试剂：感受态细胞、连接产物、LB培养基（含抗生素的培养基平板）、X-gal、IPTG等。【重要实验步骤和教学设计】：1制备含有Amp的LB培养基平板。取一管100µL的感受态细胞（如果是冰冻的则需要在冰上化冻后，进行操作），加入重组质粒（质粒与目的基因）的连接产物5µL(不要超过5µL)，轻轻用枪吹打均匀。置冰浴中20min。然后42℃保温90sec或37℃保温5min，迅速放入冰中，冰浴3－5min添加1mL的LB培养基，37℃振荡培养1hou。3000rpm离心5min,弃去上清，余下全部样品（约0.1µL）用枪轻轻吹匀，吸至含有Amp抗生素的LB培养基上，另添加20µL20mg/mL的X-gal和40µL100mmol/L的IPTG，均匀涂布。培养基正面放置37℃培养箱中30min后，倒置培养16个小时。【实验注意事项】：进行转化时的质粒量应该是感受态细胞总量的1/10以下。IPTG是针对具有lacZq基因型的大肠杆菌诱导表达lacZ而添加的，而对于不具有lacZq菌株则没有添加的必要。为了使蓝色菌落更明显，可以将培养基放于4℃冰箱中3hou。制备感受态细胞时一定要在冰上操作。【思考题】：转化过程中要注意什么问题？为什么要先在不含有抗生素的液体培养基中培养一个小时，然后再涂布于含有抗生素的平板上？除了热激转化外，还有什么转化方法？【实验后记】：实验10重组子的筛选【时间安排】：3学时【实验类型】：基本训练【目的要求】：了解：α互补原理以及其他筛选鉴定方法；掌握：通过本实验学会重组DNA（重组子）的筛选方法和技术；熟悉：重组DNA筛选的操作步骤。【实验原理】：重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选，利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。α互补是指E.coliβ-半乳糖苷酶的两个无活性片段组合而成为功能完整的酶的过程。该酶是把乳糖切成葡萄糖和半乳糖的酶，该酶基因来自大肠杆菌LacⅠ基因，删去LacⅠ基因中编码起始甲硫氨酸的5′区，翻将从下游的甲硫氨酸开始，从而产生酶的C端片段。现用的许多载体都含有β-半乳糖苷酶的前146各个氨基酸的编码序列及其调控序列，即N端片段序列，其中在编码序列中包含着保持读框的多克隆位点，会在酶的N中引入少量不影响其功能的氨基酸。当在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导着氨末端片段，基β-半乳糖苷酶的合成，从而互补β-半乳糖苷酶缺陷的宿主。合成的β-半乳糖苷酶可将无色的X-gal切割城半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝，在培养基平板上就形成蓝色菌落。但在多克隆位点插入外源DNA时，导致β-半乳糖苷酶的氨末端失活（即LacⅠ基因表达中断），从而不能进行α互补，因此带有重组载体质粒的细菌产生白色菌落，即通过在X-gal平板上的蓝/白颜色筛选重组子。除了α互补筛选法外，还有抗药性筛选法、营养缺陷型筛选法、电泳筛选法、PCR检测法、核酸碳针筛选法、DNA序列分析。【仪器与基本操作】：主要仪器：超净工作台、涂布工具、培养皿、恒温培养箱等。主要试剂：LB培养基（含抗生素氨苄青霉素、卡那霉素）、X-gal、IPTG等。【重要实验步骤和教学设计】：将含有重组子的并活化后的菌液均匀涂布于含Amp抗生素的并添加X-gal和IPTG的LB培养基上，培养至蓝/白斑出现。观察平板上长出的抗性菌落（转化子），有白色菌落和蓝色菌落，白色菌落可视为重组子，蓝色菌落为非重组子。统计蓝、白斑的比例。【实验注意事项】：转化后的大肠杆菌必须在含有适当抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素）的LB培养基中进行培养，然后抽提质粒。抽提质粒所挑选的菌落必须是单菌落。菌落长出后可以放到4℃稍培养，增加显色。【思考题】：α互补筛选重组子的原理是什么？白色菌落是否都是真正重组子？为什么？【实验后记】：实验11PCR鉴定重组子【时间安排】：3学时【实验类型】：验证【目的要求】：了解：PCR鉴定重组子的方法原理；掌握：通过本实验学会PCR鉴定重组子的方法和技术；熟悉：PCR鉴定重组子的操作步骤。【实验原理】：平板抗生素与蓝白斑筛选是非常重要，但并不精确，因为平板上许多菌落是假阳性的情况，如载体DNA缺失后自我连接引起的转化，非特异性片段插入组建载体的转化，而真正阳性重组体只有很小一部分。要确证外源目的基因片段插入载体，还要鉴定转化子中重组质粒DNA分子的大小。所以必须从转化子中鉴定出真正的重组子。PCR检测法是比较简便的方法。根据实验4，可以利用现有的引物，以含有重组子的菌液为模板，或先通过碱变性法提取质粒，再以质粒为模板，进行PCR扩增，检测构建质粒是否是所期望的重组质粒。其他方法还有酶切鉴定法、核酸探针分子杂交法、DNA序列分析法等。【仪器与基本操作】：主要仪器：超净工作台、涂布工具、培养皿、恒温培养箱、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽等。主要试剂：LB培养基（含抗生素氨苄青霉素、卡那霉素）、X-gal、IPTG、琼脂糖、电泳缓冲液、DNA标准Marker等。【重要实验步骤和教学设计】：按照蓝白斑筛选法，挑取白色单菌落接入1.5mL含抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养三个小时，取出2µL菌液作为模板进行PCR反应，反应体系其它成分同实验4。剩余菌液继续振荡培养至对数期，4℃保存备用。PCR产物电泳，以目的基因片断作为对照，确认出正确插入的重组质粒。具体操作方法间实验3【实验注意事项】：转化后的大肠杆菌必须在含有适当抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素）的LB培养基中进行培养，然后再以菌液为模板，或抽提质粒，抽提质粒所挑选的菌落必须是单菌落。电泳操作中要注意溴化乙锭的安全使用方法。【思考题】：以菌液做模板和以质粒做模板进行扩增有什么区别？还有什么方法可以鉴定重组子？【实验后记】：实验12酶切鉴定重组子【时间安排】：3学时【实验类型】：验证【目的要求】：了解：酶切鉴定重组子方法的原理；掌握：通过本实验学会酶切鉴定重组子的方法和技术；熟悉：酶切鉴定重组子的操作步骤。【实验原理】：平板抗生素与蓝白斑筛选是非常重要，但并不精确，因为平板上许多菌落是假阳性的情况，如载体DNA缺失后自我连接引起的转化，非特异性片段插入组建载体的转化，而真正阳性重组体只有很小一部分。要确证外源目的基因片段插入载体，还要鉴定转化子中重组质粒DNA分子的大小。所以必须从转化子中鉴定出真正的重组子。酶切电泳也是比较常用的方法。即从转化子中，利用碱变性法提取质粒，通过琼脂糖凝胶电泳测定它们的大小，并用酶切后电泳进一步验证质粒的重组情况。但对于插入片段大小相似的非目的基因片段，电泳法仍不能鉴别出假阳性重组子。其他方法还有核酸探针分子杂交法、DNA序列分析法等。【仪器与基本操作】：主要仪器：超净工作台、涂布工具、培养皿、恒温培养箱、电泳仪、电泳槽、等。主要试剂：LB培养基（含抗生素氨苄青霉素、卡那霉素）、X-gal、IPTG、提取质粒的试剂、限制性内切酶、琼脂糖、电泳缓冲液、DNA标准Marker等。【重要实验步骤和教学设计】：转化后的细胞在含有抗生素的LB平板上，培养过夜后，在平板上会长出许多抗性菌落(转化子)，其中有白色菌落（可视为重组子）和蓝色菌落（可视为非重组子）。挑取白色单菌落接入5mL含抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。取1.5mL菌液提取质粒（具体方法见实验1），另取0.5mL菌液至一新的eppendorf管，于4℃保存备用。电泳检测提取出来的质粒。按如下体系建立酶切反应H2O7µL如果前面自己设计的不是这两种酶，则使用自己设计的酶重组质粒10µL(约2µg)如果前面自己设计的不是这两种酶，则使用自己设计的酶10X通用Buffer2µLHindⅢ(10U/µL)0.5µLBamHⅠ(10U/µL)0.5µLTotalvolume20µL37℃利用空载体与目的基因片断作为对照，对酶切后的重组质粒进行电泳，从酶切后的片断的数目及大小上进行确认。【实验注意事项】：转化后的大肠杆菌必须在含有适当抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素）的LB培养基中进行培养，然后抽提质粒。抽提质粒所挑选的菌落必须是单菌落。酶切反应体系各个成分的准确性、电泳操作中要注意溴化乙锭的安全使用方法。【思考题】：酶切电泳法鉴定重组子有什么不足的地方？还有什么方法可以鉴定重组子？你认为哪种方法最好？【实验后记】：实验13表达载体的构建【时间安排】：3学时【实验类型】：设计【目的要求】：了解：表达载体构建的常用方法；掌握：表达载体构建的实验技术；熟悉：表达载体构建的技术路线和实验流程。【实验原理】：外源基因在受体细胞内表达与表达载体构建有密切关系。原核生物中表达载体的构建一般要求：（1）有一个强的原核启动子及两侧的调控序列；（2）位于读码框上游的SD序列与起始密码子AUG之间有合适的距离；（3）在外源基因和启动子之间有正确的读码框；（4）外源基因下游应加入不依赖ρ因子的转录终止区。一般表达载体都具有多克隆位点，对表达载体和外源基因用相同的两种酶双酶切后，再用T4DNA连接酶把外源基因连入表达载体中，通过酶切、PCR鉴定，如果插入的片段大小和方向与外源基因一致，则成功构建重组子。pET系列质粒具有强启动子、RBS、基因标签（如T7-Tag、His-Tag等）3个成一组，目前许多基因表达载体都是由三种成一组的三个位相载体构成的，即每种载体相对于起始密码ATG的转译位相的位点是不同的，所以在与外源基因拼接时，其中必有一种位相可以保证外源基因处于正确的阅读框架之中。如：pET-28a、b和c(+)，它们具有BamHI、EcoRI、SacI、SalI、HindIII、NotI、XhoI等酶切位点，His标签以及T7标签，外源基因可与N-端的His标签或T7标签相融合，以提高外源基因的表达量。【仪器与试剂】：主要仪器：离心管、电泳仪、电泳槽、微量移液器、离心机、超净工作台、恒温箱培养箱、恒温摇床等。主要试剂：扩增质粒和PCR产物、LB培养基、限制性内切酶、抗生素、琼脂糖、阳性克隆转化子、上样缓冲液等。【重要实验步骤和教学设计】：提取质粒PET28c或pGEX-2TK（实验1已做）质粒PET28c酶切，按照如下建立酶切反应体系（具体操作步骤如实验3）ddH2O7µL如果前面自己设计的不是这两种酶，则使用自己设计的酶PET28c质粒10µL(约2µg)如果前面自己设计的不是这两种酶，则使用自己设计的酶10X通用Buffer2µLHindⅢ(10U/µL)0.5µLBamHⅠ(10U/µL)0.5µL总体积20µL37℃保温3小时或过夜3电泳检测，具体操作过程如实验34以标准分子量marker做参照，回收目的条带（具体回收操作见回收试剂盒）5载体和目的基因的连接，按照如下体系建立连接反应具体操作步骤如实验4PCR酶切产物（实验2）6µL酶切质粒（PET28c）2µL10X连接buffer1µLT4DNA连接酶1µL总体积10µL6混匀后3000rpm短暂离心将液体全部甩到管底。16℃条件下保温过夜或4℃过夜。连接产物用于转化感受态细胞BL21。【实验注意事项】：转化操作如实验5，唯一的不同只是在LB培养基中加入一定浓度的潮霉素。在平板上长出的菌落为表达了目的基因的重组子。挑取单菌落，对重组子进行鉴定，详细操作步骤如实验6【思考题】：表达载体构建时要考虑什么因素？如何做到高效表达？【实验后记】：实验14外源基因的诱导表达【时间安排】：3学时【实验类型】：综合【目的要求】：了解：外源基因在受体细胞内表达及其影响因素；掌握：掌握通过诱导剂诱导目的基因表达的技术；熟悉：将目的基因插入表达载体中，表达完整目的基因的技术路线和实验流程。【实验原理】：外源基因在受体细胞内表达与否以及表达水平受多种因素制约：外源基因是否插入正确的阅读框架，只有与载体DNA的起始密码相吻合时，才算处于正确的阅读框架之中。靶基因的有效转录和及时的终止，如启动子的作用和核糖体RNA转录终止子的作用。mRNA的有效翻译，涉及到SD序列的作用，以及SD序列与起始密码子（AUG）的距离。④转录和翻译后适当修饰和加工。如合成的蛋白质向胞外分泌等。外源基因在原核生物中高效表达除了有合适的载体外，还要有适合的宿主菌以及一定的诱导因素。根据表达载体的不同有不同的诱导因素，如光、温度和化学物质等。如含有LacⅠ的启动子的载体（如PET28c（+））的基因表达是受诱导剂IPTG诱导；pBV211的基因表达是受温度控制，在42℃条件下可诱导外源基因的大量表达。原核表达载体启动子的转录常常是可以控制的，即一般情况下不转录，受诱导剂诱导时就能转录，从而带动外源基因的表达，提高目的蛋白的产量和质量。如pET由于带有来自大肠杆菌的乳糖操纵子，它由启动基因、分解产物基因活化担保（CAP）结合位点、操纵基因及部分半乳糖酶结构基因组成，受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控是通过CAP（catabolitegeneactivationprotein）因子和cAMP来激活启动子，促进转录；负调控则是由调控基因产生lacZ阻遏蛋白与操纵子结合，阻遏转录。乳糖的存在可以解除这种阻遏，其次IPTG是β-半乳糖苷酶底物类似物，具有很强的诱导能力，能与阻遏蛋白结合，使操纵子游离，促进转录（诱导lacZ启动子转录）。所以，可以通过在培养基中添加IPTG诱导基因表达。【仪器与试剂】：主要仪器：离心管、电泳仪、电泳槽、微量移液器、离心机、超净工作台、恒温箱培养箱、恒温摇床等。主要试剂：扩增质粒和PCR产物、LB培养基、限制性内切酶、抗生素、琼脂糖、阳性克隆转化子、上样缓冲液等。【重要实验步骤和教学设计】：仅以IPTG诱导pET重组子的表达为例：将含有pET28c和pET28c重组子的BL21菌落分别接种于2ml含卡那霉素（50µg/ml）的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。分别取100µL培养液（2％的接种量）于5ml含卡那霉素的LB培养基中，培养2－3小时，至OD600达0.5左右。取出1.0ml样品作为IPTG诱导前的样品。其余样品中添加12µL的100mMIPTG继续培养。分别在1、2、3、4、5小时后取出1.0ml样品作为IPTG诱导后的样品。将IPTG诱导前