生物微量元素研究生物利用性与生物强化

生物微量元素研究—生物利用性与生物强化

BioavailabilityandBiofortificationofTraceElements(TEs)学术沙龙报告之三主讲：胡广林（应化系）2012-11-291第一页，共七十四页。TopicstoCoverIntroductiontoBiologicalTraceElements12ModelstoEvaluateTraceElementsBioavailability3BiofortificationofTraceElements2第二页，共七十四页。TraceElements

Definitions

MacroelementsVS.MicroelementsMacronutrientsVS.Micronutrients

AbsorptionofTraceElements

Functions&DeficienciesofTraceElements

Iron(Fe),Zinc(Zn),Iodine(I),Selenium(Se)

WhyDoTraceElementsDeficienciesOccur?3第三页，共七十四页。Definitions

Marcoelements

Includecalcium(Ca),phosphorus(P),magnesium(Mg),sodium(Na),potassium(K)andchloride(Cl),etc.Macroelementsarerequiredinamountsgreaterthan100mg/day.占人体质量万分之一以上4第四页，共七十四页。Definitions

Microelements

Includeiron(Fe),zinc(Zn),copper(Cu),selenium(Se),fluorine(F),iodine(I),etc.低于人体质量万分之一Requiredinsmallquantitiesandarealsoknownas‘traceelements’5第五页，共七十四页。

Macronutrientsinclude：MacronutrientsVS.Micronutrients

Protein

Lipids

Carbohydrates6第六页，共七十四页。MacronutrientsVS.Micronutrients

Micronutrientsinclude:macromicro

Minerals

Vitaminsfatsoluble(VitaminA,D)watersoluble(VitaminB,C)维持人体的正常生理代谢，摄入不足会导致严重的疾病，甚至造成死亡！7第七页，共七十四页。AbsorptionofTEs

Digestion/absorption

吸收：胃肠道，呼吸道，也可以是皮肤8第八页，共七十四页。AbsorptionofTEs

Excretion

主要通过消化道（粪便）、肾脏（尿），呼吸、汗液也可排出少量9第九页，共七十四页。AbsorptionofTEs

pHaffectsabsorptionofTEsSomeminerals(Ca,Fe,Zn,Cu)arepresentinfoodsasinsolublesalts.Mineralsfromfoodsaresolubilizedinthestomachduetotheacidity(HCl).Thissolubilitydoesnotlastlong,sincetheintestineismorealkaline(pH~7).10第十页，共七十四页。AbsorptionofTEs

pHaffectsabsorptionofTEs

Anantacidwithourfoodsdonot

favorthesolubilityandabsorptionofTEs.Why?pHofstomachisincreased.Inalkalineenvironments,TEstendtoprecipitateandnotbeabsorbed(insteadareexcreted).WhetherprecipitationofTEshappenornotdependsonthepresenceofcertainfoodcomponentsthatbindtotheTEs,andenhancetheirabsorption(‘enhancers’)Therearealsomineral‘inhibitors’.enhancer(VitC)inhibitor(phytate)11第十一页，共七十四页。AbsorptionofTEs

FoodscomponentsaffecttheabsorptionofsomeTEs

Iron(Fe)absorption：

EnhancedbyvitaminCandmeat

Inhibitedbyfiber,phytate,tannins(tea),

oxalate(spinach)andcertainproteins(soybeanprotein,eggprotein,casein)meatteaspinacheggoxalatetannin12第十二页，共七十四页。AbsorptionofTEsZinc(Zn)absorption：

Inhibitedbyfiber,phytateandtannins(tea)andoxalate(spinach)

Oxalate(oroxalicacid)presentinfoodslikechocolateandspinachbindstoTEsandinhibitstheirabsorption.Likewise,phytate(orphyticacid)presentinmanyplantcrops,isamineralinhibitor.oxalatephytatefiber13第十三页，共七十四页。Functions&DeficienciesofTEs

Functions

Catalyticfunctionsofenzymesystem

Essential/assistantcomponentofhormoneandvitamin

FunctionalproteinImmunefunctionNucleicacid血红蛋白(Fe)维生素B12(Co)锌指(Zn)谷胱甘肽过氧化物酶(Se)14第十四页，共七十四页。Functions&DeficienciesofTEs

DeficiencyVS.Excess

必需微量元素在机体中有一个最适浓度范围。当其不足即小于该范围时，就会导致生物体生长迟缓，繁殖衰退，甚至死亡；当其浓度超过某一限度时，则会引起中毒。15第十五页，共七十四页。Functions&DeficienciesofTEsTable1:Recommendeddailyintakes(RDIs)oftraceelements16第十六页，共七十四页。Functions&DeficienciesofTEs

Iron(Fe)

Irondeficiencyisthemicronutrientdeficiencymostprevalentintheworld.ItisfollowedbyvitaminA,iodineandzinc.Ironisapartofheme(亚铁血红素)presentin:hemoglobin(whichtransportsoxygeninblood)myoglobin(whichstoresoxygeninmuscle)cytochromesinvolvedintheelectrontransportchain(unit6)andincytochromeP450(involvedinmetabolismofdrugs,pesticides,carcinogens,alcoholmetabolism)血红蛋白(hemoglobin)肌红蛋白(myoglobin)17第十七页，共七十四页。Functions&DeficienciesofTEs细胞色素C(cytochrome)Iron(Fe)Ironisalsoformspartofmanymetalloenzymesinvolvedinmanyreactionsoccurringinthebody.NADH-Q还原酶18第十八页，共七十四页。Functions&DeficienciesofTEs

Irondeficiency

Deficiencyofironcanleadtofatigue,

anemia(wherehemoglobinlevelsdropbelow120g/dL),poorschoolperformanceandpoorimmunity,brainfunction,

prematurebirth,death.疲劳(fatigue)贫血(anemia)镰状红细胞贫血症19第十九页，共七十四页。Functions&DeficienciesofTEsToxicity

Toxicitycouldoccurdueto(a)oversupplementation,(b)repeatedbloodtransfusions,or(c)ageneticdisease

thatpredisposesindividualtoabsorbFe(hemochromatosis)Fedeficiencyisasdeleterioustohumanhealthasironoverload.Why?Feparticipatesinthe

Fentonreaction,whichresultsintheproductionoffreeradicals.Thesefreeradicals

damagecellmembranes(phospholipids),proteinsandDNA/RNA.芬顿反应20第二十页，共七十四页。Functions&DeficienciesofTEs

Zinc(Zn)

Zincplayskeyrolesingrowthandimmunity.生殖发育味觉和食欲视觉免疫功能21第二十一页，共七十四页。Functions&DeficienciesofTEs

HowtodetermineZnstatus?

Itisdifficulttodeterminewhetherapersoniszincdeficient.

MeasuringZnlevelsinbloodisnotreliable,sincezincchangeswiththetimeoftheday.Ithasacircadianrhythm.Znlevelsarealsoaffectedbyillnessandperiodsofrapidgrowth.Othersmethodsinvolve:Measuringlevelsofalkalinephosphataseoralcoholdehydrogenaseinbloodwhichareenzymesthat

requirezinc

ZincconcentrationsinhairItisdifficulttodiagnoseZndeficiencysincesymptomsaresimilartothoseofFedeficiency.碱性磷酸酶(ALP)乙醇脱氢酶22第二十二页，共七十四页。Functions&DeficienciesofTEs

Zincdeficiency营养性侏儒症(伊朗乡村病)肠源性肢体皮炎厌食原发性男性不育症(primarymaleinfertility)口腔溃疡(dentalulcer)夜盲症(visusdiurnus)23第二十三页，共七十四页。Functions&DeficienciesofTEs

Iodine(I)

Iodineformspartoftwohormonessynthesizedbythe

thyroidgland.

Tetraiodothyronine(T4)Triiodothyronine(T3)About90%ofthehormonereleasedbythethyroidglandisT4,while10%isT3.四碘甲腺原氨酸(T4)三碘甲腺原氨酸(T3)24第二十四页，共七十四页。Functions&DeficienciesofTEsIodinedeficiencydisorder(IDD)Iodinedeficiencyisthemostimportantcauseofbraindamageandmentalretardation.IDDconsistsofawidespectrumofdisordersrangingfromsimplegoiter,characterizedbyanenlargementofthethyroidgland,tocretinism,anirreversibleformofmentalretardation.甲状腺肿呆小症(克汀病)智力缺陷25第二十五页，共七十四页。Functions&DeficienciesofTEs

Selenium(Se)

Seleniumisincorporatedintoproteinstomakeselenoproteins,whichareimportantantioxidantenzymes.Theantioxidantpropertiesofselenoproteinshelppreventcellulardamagefromfreeradicals.Seleniumalsoparticipatesinthyroidhormonemetabolism.GSH-Px26第二十六页，共七十四页。Functions&DeficienciesofTEsSeleniumdeficiency克山病(Keshandisease)大骨节病(Kashin-Beksyndrome)白内障(caligolentis)27第二十七页，共七十四页。WhydoTEsdeficienciesoccur?

Poorconsumptionofminerals.

lowtraceelementsintakeHighconsumptionoffoodsthatinhibittheirabsorption.

Phytate(plantfoods)inhibitsCa,Zn,Fe;chemicalspresentincassava,cabbage,turnipsaffectsImetabolism;oxalates(spinach)affectsCa&Fe

lowtraceelementsbioavailability28第二十八页，共七十四页。BioavailabilityofTEs

Definition

HowtoEvaluateBioavailabilityofTraceelements?

Invivomodel

InvitromodelCellmodelOurresearchwork29第二十九页，共七十四页。BioavailabilityofTEs

Definition

Bioavailability,i.e.thepercentage

oftheingestedamountoftheelementthatcanbeabsorbedduringdigestionandsubsequentlytransformedintometabolicallyactivespecies.

HowtoevaluatethebioavailabilityofTraceElements

Invivomodel

InvitromodelCellmodel人体消化系统30第三十页，共七十四页。InVivoModel

Bioavailabilityshouldbedeterminedbyinvivo

measurements

Ideally,thiskindofresearchshouldhavebeenperformedinhumans.

Advantage:ideal,reliableandactualmethodAnimalassays(mice,wistar,rabbit,piggy)humanWistachickenminipigrabbitmodelanimals31第三十一页，共七十四页。InVivoModel

Bioavailabilityshouldbedeterminedbyinvivo

measurements

whereI=intake,F=faecalexcretion,andU=urinaryexcretion.

Disadvantageofinvivomodel

Invivomethodsusingradiotracersinhumansgivethebestestimationofbioavailability,buttheuseofradiotracerspresentproblemsinmanylaboratories(expensiveorunavailableformanykeytraceelements)

difficult&laboriousradiotracer32第三十二页，共七十四页。InVivoModel

Disadvantageofinvivomodel

ethicalscruple

oftheuseofhumansubjectssignificantdifferencebetweenindividualsanimalabsorptionstudiesaresomewhatlimitedbyuncertaintieswithregardtodifferencesinmetabolismbetweenanimalsandhumans.

33第三十三页，共七十四页。InVitroModel

Invitromethodshavebeendevelopedtoevaluatetraceelementsbioavailability

Milleretal.firstly(1981)developedaninvitromethodbasedonelementdialysabilitytodetermineironbioavailability.Theinvitromethodsareusuallybasedonthesimulationofgastricandintestinaldigestionoffoodandmeasurethefractionoftheelementavailableforabsorption.

Theinvitromethodsofferanappealingalternativetoanimalandhumanmodels.DennisD.Miller

gastricjuice:HCl(pH1.5~2.0),pepsin34第三十四页，共七十四页。InVitroModel

InvitromethodshavebeendevelopedtoevaluatetraceelementsbioavailabilityAdvantage:Thesemethodsaresimple,rapid,inexpensiveandeasytocontrol.EvaluationofbioavailabilityofTEsinvolvesmeasurementoftheTEs

solublefractionortheTEsfractionthatdialysesthroughasemipermeablemembraneofacertainporesize(molecularweightcutoff,MWCO).pancreaticjuice(pH7.8~8.4):pancreatin,bilesaltandHCO-3

Dialysis(passivetransport)35第三十五页，共七十四页。InVitroModelInvitrodigestionmethod(dialysismethod)36第三十六页，共七十四页。InVitroModelInvitrodigestionmethod(solubilitymethod)SAMPLE(25g)+75mLgastricjuice(pepsine,sodiumchloride,pH=1.8)Shakingwaterbath(pH=3,37℃,4h)Centrifugation3500rpmSupernatantatpH2.5AdjustpH=6.8(NaHCO3)+50mLintestinaljuice(pancreatin,sodiumchlorideandbilesalts)Shakingwaterbath(37℃,4h)AdjustpH=7,centrifugation3500rpm,filtration(0.45m)SupernatantatneutralpHGASTRICDIGESTIONINTESTINALDIGESTION37第三十七页，共七十四页。InVitroModel

Invitromethodshavebeendevelopedtoevaluatetraceelementsbioavailability

DisadvantagetheinvitromethodsonlymeasuretheamountofTEsavailableinthegastrointestinaltractforabsorption,i.e.,itsso-calledbioaccessibility.

passivetransportation

invivoconditionscanneverbecompletelysimulatedunderinvitroconditions.(factors:enzymeactivity,ioniccomposition,digestiontimesandpH)

staticgastrointestinalmodelsvs.dynamicgastrointestinalmodels38第三十八页，共七十四页。InVitroModel

Dynamicgastrointestinalmodels

afollowingstreamofdialyzingsolutiondialysatepHwasmonitoredAdynamiccontinuous-flowdialysismethodDialyzedcomponentswarecontinuouslyremovedinthedigestivetract39第三十九页，共七十四页。CellModel

Cellculturemodelshavealsobeenutilizedaspartofinvitrodigestionmodels.

TheCaco-2cell(thehumancolonadenocarcinomacelllines)culturemodelhasbeenwidelyusedasapredictivetoolfortheabsorptionofbioactivecomponentsfromfoodsandpharmaceuticalpreparations.Theinvitrodigestion/Caco-2cellculturemodeldevelopedbyGlahnetal.(1998)Othercellmodels：MDR1-MDCK,MDCK,ECV304.GlahnR.P.

40第四十页，共七十四页。Caco-2单层细胞模型

Caco-2单层细胞模型特点

在一定条件下培养时，能产生细胞极性，形成刷状缘，分化出绒毛面顶侧（Apical,AP）和基底侧（basolateral,BL），形成类似小肠上皮细胞。

优点：与人体小肠上皮细胞在形态和功能上十分相似。在肠腔侧分化出的绒毛面含有典型的小肠微绒毛水解酶（如蔗糖酶、氨基肽酶和蛋白酶等）和各种营养物质转运载体[如P-糖蛋白（P-gp），多药耐药蛋白（MRP）、二价金属离子转运载体等]。用于研究小肠的吸收特征。Caco-2细胞单层示意图（人体结肠及直肠癌细胞）41第四十一页，共七十四页。Caco-2单层细胞模型

Caco-2单层细胞培养

Caco-2细胞单层培养模型

Transwells聚碳酸酯膜测定跨膜电阻（transepitheliumelectricalresistance，TEER）

确定细胞单层的完整性和紧密性观测细胞形态特征，验证其完整性42第四十二页，共七十四页。Caco-2单层细胞模型

Caco-2单层细胞模型标准操作规程

转运实验示意图王夔院士（北大）

APBL或BLAP双向转运后，测定AP或BL侧培养液中待测物含量（转运量）和细胞中待测物含量（摄取量），两者总和为物质的吸收量，用于评估生物利用性。43第四十三页，共七十四页。Caco-2单层细胞模型

Caco-2单层细胞模型标准操作规程

测定加入转运蛋白抑制剂后TEs在Caco-2细胞单层模型中的表观渗透系数（apparentpermeabilitycoefficient,Papp），确定TEs的转运机制（主动运输或被动运输）。

Caco-2单层细胞模型缺点Caco-2细胞在模拟小肠上皮细胞时存在缺乏分泌粘液的杯状细胞，缺少小肠上皮中黏液层的模拟。44第四十四页，共七十四页。汞元素生物利用性研究

朱砂中汞元素生物利用性研究的实验条件（体外消化透析法）图1液/固比对朱砂中汞元素溶出率的影响图2

pH对朱砂中汞元素溶出率的影响45第四十五页，共七十四页。汞元素生物利用性研究

朱砂中汞元素生物利用性研究的实验条件（体外消化透析法）图3胃蛋白酶量对朱砂汞的溶出率的影响图4接触时间对朱砂中汞元素溶出率的影响46第四十六页，共七十四页。汞元素生物利用性研究

朱砂中汞元素生物利用性研究的实验条件（体外消化透析法）图5胰液胆盐量对朱砂中汞相对透析率影响图6透析时间对朱砂中汞透析率的影响47第四十七页，共七十四页。汞元素生物利用性研究含朱砂中成药中汞的健康风险评估指标的提出总汞量不能客观地反映出朱砂对人体的毒副作用。基于对朱砂和含朱砂中成药中汞元素生物可接受率的测定，提出评价含朱砂中成药汞的汞生物可接受量限度，以含朱砂中成药中汞的生物利用性评价其安全性。人体内蓄积汞量达到2mg•kg–1表现为中毒，以成人体重60kg计，易知人体内蓄积120mg汞可表现汞中毒。汞在人体内半衰期为65~70d，以70d计，设日摄入含朱砂中成药中汞生物可接受量为m（单位mg），服用f天后，人体内蓄积汞量N可表示为：

48第四十八页，共七十四页。汞元素生物利用性研究

朱砂中汞元素生物利用性研究（体外消化透析法）

含朱砂中成药中汞的健康风险评估指标阈值：1.19mg/（人•天）49第四十九页，共七十四页。汞元素生物利用性研究

植物源成分对复方芦荟胶囊中汞生物利用性的影响图7几种植物化学物质源食品对复方芦荟胶囊中汞生物利用性的影响

50第五十页，共七十四页。汞元素生物利用性研究

植物源成分对复方芦荟胶囊中汞生物利用性的影响

图7几种植物化学物质源食品对复方芦荟胶囊中汞生物利用性的影响51第五十一页，共七十四页。汞元素生物利用性研究

植物源成分对复方芦荟胶囊中汞生物利用性的影响

图7几种植物化学物质源食品对复方芦荟胶囊中汞生物利用性的影响52第五十二页，共七十四页。汞元素生物利用性研究汞中毒剂量反推评估模型参考日本熊本和新泻水俣病患者所摄入有毒鱼贝的汞浓度和估计摄入量而推算出体内100mg的蓄积量为中毒剂量以及边振考等人曾报道人体汞蓄积中毒量为100mg。汞在人体内半衰期为65~70d，为计算简单此处以70d计，设日摄入含朱砂中成药中汞生物可接受量为m（单位mg），服用f

天后，人体内蓄积汞量N可表示为：

53第五十三页，共七十四页。汞元素生物利用性研究汞中毒剂量反推评估模型汞生物可接受量超过0.099mg/（人·天）将对人体存在较大中毒风险54第五十四页，共七十四页。生物强化研究概况

研究背景:人体微量营养素营养不良（MicronutrientMalnutrition，MNM

）

微量营养素（Micronutrients，即微量元素和维生素）是维持人体正常生命活动的必需营养物质，量微而作用大。如Fe、Zn、I、Se等微量元素在人体中承担着多种重要的功能。

Humansrequirevariousmineralelements.Somearerequiredinlargeamounts,butothers,suchasFe,Zn,Cu,IandSe,arerequiredintraceamountsbecausehigherconcentrationscanbeharmful.55第五十五页，共七十四页。生物强化研究概况56第五十六页，共七十四页。

基本上，这些矿质元素（mineralelements）都是通过植物（谷物等主食）进入人类食物链中。食用作物中矿质元素的缺乏以及人体对其较低的生物利用性（bioavailability），导致人体微量营养素缺乏，也称之为“隐形饥饿”（hiddenhunger）。生物强化研究概况57第五十七页，共七十四页。

原因：①主食（staplefood）中微量营养素本身（inherent）含量较低，尽管蔬菜、水果和动物源食品富含微量营养素；②植物生长的环境土壤中矿质元素缺乏；③植物对土壤中矿质元素利用能力（phytoavailablilty）较低。

食物中矿质元素的化学形态（chemicalform）决定了人体对其吸收和同化（absorbandassimilate）的能力。

Someessentialmineralelements,suchasKandNa,occursolelyassolubleinorganicionsinplants.However,mostmineralelementsalsooccurinorganiccompoundsorinorganicsalts,inbothsolubleandinsolubleforms.生物强化研究概况58第五十八页，共七十四页。植物体内含有促营养物质（promoter）和抗营养物质（antinutrients），影响人体对其必需矿质元素的吸收。促营养物质：抗坏血酸（ascorbate），β-胡萝卜素（β-carotene）和胱氨酸多肽（cysteine-richpolypeptides）等。抗营养物质：草酸（oxalate），鞣酸（polyphenolics）和植酸（phytate）等。

世界范围内人群受到微量营养素缺乏的不良影响。Itisestimatedthat,oftheworld’s6billionpeople,60-80%areFedeficient,>30%areZndeficient,30%areIdeficientandabout15%areSedeficient.生物强化研究概况59第五十九页，共七十四页。Itisestimatedthatatleast1/3oftheworldpopulationisaffectedbytheZndeficiencyproblem,particularlychildren.Nearly450000childrenunder5yearsdieannuallybecauseofZndeficiency.生物强化研究概况60第六十页，共七十四页。控制人体微量营养素缺乏的传统策略不能普遍成功。传统策略：饮食多样性（dietarydiversification），矿物质补充（mineralsupplementation），食