世界针灸论文译文

短期穴位磁疗干预2型糖尿病肾病的作用及其分子机制探讨周子瑜#1,任丽伟杨含艳1,刘继章2,褚克丹1,翁建平2于志文1*1.福建中医药大学生物医药研发中心，福州350122,中国;2.中山大学第三附属医院内分泌科，广州510000,中国摘要目的：探讨穴位磁疗法是否能够延缓糖尿病肾病DKD的发展，并研究这一治疗作用的分子机制。方法:对28名2型糖尿病(T2D)患者在脾俞(BL20)、足三里(ST36)、肾俞(BL23)和胰俞等穴位进行为期4周的脉冲磁疗干预，以病人尿微量白蛋白排出量、血浆丙二醛含量和脂多糖水平作为评价疗效的指标。结果：磁疗干预后，病人尿微量白蛋白排出量较干预前明显下降(27.21幻1和D8.51±95,P<0.001),血浆丙二醛明显降低(MDA,16.46±17vs12.401・±P<0.05)和脂多糖水平明显下降(LPS,37.413.84vs21.633・±P<0.05),而其它代谢相关指标没有明显变化；磁疗法干预能够升高IKB■—炎症信号抑制蛋白含量(0・69±17vs1.300±9,P<0.01),并相应地降低炎症激活蛋白NF-KBp65(0.98±42vs0.430.2±,P<0.05和NF-KB50(1.19±40vs0.760.3±,P<0.05)的含量，磁疗法干预还能够抑制氧化酶 Nox4(1.32±40vs0.370人3,P<0.05)的表达。结论：短期磁疗干预T2D患者通过其潜在的抗氧化和抗炎作用延缓DKD发展。关键词：穴位磁疗；糖尿病肾病；尿白蛋白；氧化应激;淋巴细胞II型糖尿病(T2D)是一种全球流行疾病，且发病率逐年增加(1)。T2D的严重后果之一是引起糖尿病肾病这一并发症，它导致了 20-40%患病病人死亡⑵。因此，预防和治疗糖尿病肾病(DKD)显得十分迫切。研究表明，有多种病原学方面因素参与DKD的发病和进展⑶。重中之重便是糖代谢异常，高血糖通过引起氧化应激损伤肾组织和功能⑷。而氧化应激和炎症反应本质上是相关的，肾组织炎症反应是参与肾组织功能损害和病理性损伤的一个重要的病理生理学过程 [5]。过量的活性氧(ROS)能够导致氧化应激，活性氧通过激活烟酰胺腺嘌吟二核苷酸磷酸 (NADPH)氧化酶或者线粒体代谢⑹刃。基于这个原因，阻滞NADPH或线粒体ROS产生对于对抗氧化应激一包括DKD病程的发展十分重要。在ROS合成酶中，NADPH氧化酶4(Nox4)备受关注,因为它在肾组织中高丰度表达68】。进一步说，激活Nox4不但引起氧化应激而且导致炎症和凋亡反应最后造成肾损伤加重68】。目前已有实验研究支持这一说法，有研究者观察到在 DKD小鼠上高血糖能够上调Nox4蛋白表达，在肾细胞上给Nox4抑制剂或者进行Nox4基因沉默能够调节氧化还原以及肾损伤「9,io】。由于细胞在修复氧化还原平衡时具有清除 ROS的防御机制，目前关于抗氧化酶体系和DKD之间关系的研究也有很多「5,口忆。Nrf2系统是机体主要的抗氧化系统，我们实验组和其他研究者均已发现在胰岛素抵抗和糖尿病状态时 Nrf2系统功能受损，而这可能促使糖尿病综合征的发展「13,14】。证明这一发现的直接证据是以这一抗氧化系统作为药物靶点，激活后能够有效延缓DKD「io,ii】。近年来中医外治DKD方法多样，包括针灸疗法、穴位贴敷法、穴位注射、经穴埋线等「15】，上述治疗方法在临床应用时均需考虑选取相应的穴位。取穴治疗DKD是常用且有效的中医疗法之一。多个临床随机盲法实验报道证明，对早期 DKD进行的以肾俞、脾俞、足三里、胰俞等为主要穴位的埋线或针灸治疗较之单纯西医疗法在改善 DKD患者临床症状、降低尿微量白蛋白、改善肾功能或延缓肾功能恶化等方面具有更好的临床效果 「16-18】。在动物实验研究中，刘晓婷等发现，对DKD大鼠膈俞、脾俞、肾俞等背俞穴进行电针疗法， DKD大鼠的肾功能异常得到改善且肾脏病理损害在一定程度上减轻「19】。此外，胰俞作为经外奇穴，在临床上对其进行针刺加以药物治疗手段，能较好地改善早、中期糖尿病患者脂肪代谢紊乱 ，具有降低和稳定血糖的作用，因而可从改善病人代谢，间接起到治疗 DKD的作用「20】。现已证明磁疗在多种疾病中具有治疗作用「21】。已有报道表明，在代谢性疾病及糖尿病相关疾病中，磁疗对脂肪肝、糖尿病引起的骨流失和神经性病变具有治疗作用 「22-24】。尽管磁疗的分子机制尚未完全了解，但它对抗氧化应激和调节免疫的作用已得到实验证明 「25,26】，这两者皆和DKD发病过程密切相关「5,11】。我们因此认为，磁疗通过调节氧化还原平衡和炎性反应在延缓DKD发展中扮演了一个有利的角色。如果将其与穴位相结合，将会有助于提高疗效。尿液中过多的尿白蛋白排出被认为是DKD发病的早期症状之一⑵】。降低尿微量白蛋白排出能够延缓DKD发展「28】。为了检测磁疗是否对DKD具有治疗作用，T2D病人接受脉冲电磁场(PEMF)刺激干预，检测尿白蛋白排出。更进一步，我们还检测了一些与 DKD发展相关的病原因素，包括代谢控制和血浆氧化还原状态。由于糖尿病与低度炎症相关 「29】，而脂多糖(LPS)作为炎症媒介与DKD发展相关，因此我们检测了血浆LPS含量。此外，为了研究磁疗潜在的分子机制，我们对病人血液淋巴细胞中调节氧化还原平衡和炎性信号的蛋白进行了检测。材料与方法1■临床资料1.1一般资料本研究的T2D患者均来源于2013年5月-2013年10月佛山市中医院内分泌科。此研究通过了福建中医药大学伦理委员会同意且参与研究的患者均知情同意。本研究共28例患者，其中男性7例，年龄5980岁，平均66.6岁；病程最短3年，最长22年，平均8.8年；女性21例，年龄4882岁，平均68.3岁；病程最短2年，最长30年，平均10.6年。病人的一般情况及血糖、胰岛素和尿蛋白测定见表1Table“.GeneraldataofT2Dpatients(n=28)T2DpatientsSexMaleFemaleCases721Age(year)66.6±7(59-80)68.3 2;2(48-82)BMI23.1±223.7 ±2Courseofdisease(year)8.83±1910.617.43Systolicpressure(mmHg)123.5713.14128.457;31Diastolicpressure(mmHg)79.269.8577.657.11BG(mmol/L)6.820.768.182:41INS(mU/L)12.703.5016.774.41c-p(卩g/L)1.480.552.220.71U-mAlb(mg/L)22.429.9628.816.671.2诊断标准依据美国糖尿病协会制订的2型糖尿病的诊断标准[30]:①糖尿病症状+任意时间血浆葡萄糖水平〉11.1mmol/L(200mg/dl);②空腹血浆葡萄糖(FPG冰平〉7.0mmol/L(126mg/dl);③□服葡萄糖耐量试验(OGTT)中，2h血糖水平〉11・1mmol/L(200mg/dl)°3糖化血红蛋白＞6・5・1.3纳入标准①符合上述糖尿病诊断标准者；②愿意接受临床疗效观察且病人知情同意者。1.4排除标准①不符合上述诊断标准及纳入标准者；②排除1型糖尿病和由于其它急性感染、外伤、手术或明显应激情况引起的符合上述诊断标准的患者及妊娠期、哺乳期女性；③治疗期间改变原服用Figure125nhi±2nkiFigure125nhi±2nki药物及服用抗氧化剂患者，及曾接受其他相关治疗有可能影响本研究疗效观察者；④未能按规定试验方案配合治疗，自行退出、无法随访、资料不全或其他原因无法观察疗效者。2■磁疗仪器采用可用于人体的PEMF治疗仪（YX-200磁疗仪，专利号NO.CN200610036313・8佛山玉玄宫，中国）磁疗仪主要包括PEMF发射器，漆包线构成的线圈软磁导磁材料，线圈和导磁材料置于绝缘外壳中组成治疗头（图1）。发射器发射独立、单个、方形脉冲波，频率为 1HZ,波持续时间为25m±2ms。HD3■取穴及操作方法取脾俞（BL20）、足三里（ST36）、肾俞（BL23）和胰俞等穴位［16］，将磁疗头放于相应穴位上，以1.2Td20mT的磁场强度，每个穴位10分钟，每日两次，持续治疗4周。在磁疗干预期间，患者继续保持原有药物治疗。Table2.TheMedicationofT2Dpatients(n=28)

PatientNo.Medication(Dosage)Metformin(1g/day)andGlimepiride(2mg/day)Metformin(0.75g/day),Acarbose(50mg/day)andPioglitazoneHydrochloride(25mg/day)12345678910111213141516171819202122232425262728Gliclazide(80mg/day)andPioglitazoneHydrochloride(15mg/day)Insulin(23U/day)andGliclazide(100mg/day)Insulin(20U/day)Insulin(33U/day)Insulin(21U/day)andMetformin(1g/day)Metformin(0.75g/day)andGliclazide(100mg/day)Metformin(1g/day)andGliclazide(80mg/day)Insulin(19U/day)Insulin(29U/day)andAcarbose(100mg/day)Insulin(51U/day)Glimepiride(2mg/day)andPioglitazoneHydrochloride(25mg/day)Insulin(23U/day)Insulin(13U/day)Insulin(32U/day)Insulin(2U/day)Insulin(20U/day)andAcarbose(50mg/day)Acarbose(100mg/day)Insulin(35U/day)Insulin(19U/day)andGlimepiride(3mg/day)Insulin(31U/day)Insulin(29U/day)Insulin(35U/day)Insulin(18U/day)Insulin(28U/day)Insulin(37U/day)Glimepiride(2mg/day)andMetformin(1.25g/day)4.指标检测采用病例自身前后对照法评估穴位磁疗干预的治疗作用4.1疗效指标检测尿微量白蛋白(U-mAlb)分析收集夜尿于同一清洁容器中，用QuikReadU-mAlb酶联免疫(ELISA)试剂盒(OrionDiagnosticaOy,Espoo,芬兰)依照说明书分析U-mAlb含量。大于20mg/L视为不正常。代谢评估按报道方法采集病人磁疗干预前后空腹血液⑶］。血糖(FBG)、胰岛素(INS)、C肽(C-P)、甘油三酯(TG)，总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)等在临床检验室分析检测。4.2机制指标检测通过丙二醛（MDA）含量检测，观察机体的氧化应激水平；通过蛋白免疫印迹技术（WestenBlot）检测相应的炎症信号蛋白，女口IKBaNF-KBp65和NF-KBp5（等，氧化酶Nox4及Nf2抗氧化系统信号蛋白等。丙二醛（MDA）测定用MDA试剂盒（南京建成公司，南京，中国）测定血浆MDA含量，操作遵循说明书进行。LPS分析用LPSELISA试剂盒（CUSABIO,武汉，中国）测定血浆LPS含量，操作遵循说明书进行。淋巴细胞分离和蛋白免疫印迹分析采用血淋巴细胞提取试剂盒（上海科华生物工程，上海，中国）通过密度离心分离提取淋巴细胞。依据报道方法进行淋巴细胞蛋白制样和蛋白免疫印迹分析 [32]。抗体NF-KBp65,NF-KBp50,Nox4,Nf2和GAPDH购自SantaCruz（上海冲国）。抗体IKB%SOD1和SOD2购自Proteintech（广州，中国）。抗体HO-1,NQO-1,Bax和Bcl-2购自CellSignaling（广州冲国）。抗体caspase-3,caspase购自SangonBiotech上海，中国）。5.统计方法所有数据都表示为平均值土标准误差（SEM）。采用paired-sampleTTest或方差分析,p<0.05被认为具有统计学意义。结果1、穴位磁疗能有效降低T2D病人尿白蛋白排出，但不改变病人血糖水平。如图2所示磁疗干预前病人U-mAlb含量为27.21±51mg/L，而经过四周的磁疗干预后的U-mAlb大幅减少到8.50±5mg/L（约减少70%,n=28,p<0.001）。为了评估磁疗是否能改变肾脏功能，我们检测了血液中肌酐含量并计算肌酐清除率这一肾功能指标，发现并没有改变I;igurc213O-o13o2o2E2ELBAlterAfterMagneixMherapyBetbreAlterAfter100「30604020MaAneUi Before为了确定病人的代谢功能是否改变以及它与磁疗延缓DKD的相关性,我们检测了患者的代谢功能指标。如表2所示病人在磁疗干预后FBG和血脂包括TG,TC均未改变，仅血LDL-C含量下降。Table3.EffectsofAcumagnetotherapyonbloodglucoseandlipidlevels(n=28)MagnetictherapyBeforeAftert-valuep-valueBG(mmol/L)7.98±68.10±50.74NSINS(mU/L)14.98±316.75±51.13NSCP(ng/mL)2.04±52.10±80.93NSTC(mmol/L)5.81±65.65±50.80NSTG(mmol/L)1.86±01.78±80.87NSHDL-C(mmol/L)1.43±71.44±80.90NSLDL-C(mmol/L)4.02±62.93±33.58***2、穴位磁疗调节T2D病人血淋巴细胞中氧化还原平衡，并抑制ROS合成酶表达。我们测量病人血浆MDA水平以反映其氧化还原状态。观察到磁疗干预后患者血浆 MDA水平降低（约减少30%,前:16.46±17vs后:12.40±86,n=6p<0.05,图3）。增加ROS产生或清除能力能够影响氧化还原平衡。为进一步探索磁疗抗氧化作用的潜在机制，我们提取患者血淋巴细胞，用蛋白免疫印迹法检测ROS合成酶Nox4和Nf2抗氧化系统蛋白表达情况。我们观察到

在磁疗干预后Nox4蛋白含量明显降低（前：1・32±6vs后:0.38±9,n=6pv0.05图3b）,而Nrf2抗氧化系统（包括NQO-1,HO-1）并未同时改变（图3c和D）。Figure3此XSunctutlteiitpjtkluivAlkrr宀Qr-.和I计」—」丨4-?*ruv号〉X叶IIMgiicluLliirTapvtkrldfcFigure3此XSunctutlteiitpjtkluivAlkrr宀Qr-.和I计」—」丨4-?*ruv号〉X叶IIMgiicluLliirTapvtkrldfc(iAPOHNUMIjAPUHc MakWgntflulhcrigb卜ctnaksoiKGAFDHFan血3、穴位磁疗减少T2D病人血LPS水平，抑制血液淋巴细胞中炎症信号关于磁疗是否能够影响炎症系统，我们检测了血浆 LPS水平这一炎症指标，并观察到磁疗F预能够降低炎症水平（约减少45%,前:37.41±}4vs后:21・63出1,n=6,p<0・05,图4）。为检测

磁疗对炎症的潜在信号机制，我们检测了NF-kB抑制蛋白一一IKB的含量，发现在淋巴细胞中磁疗明显增加其蛋白含量表达（前：0・69±4vs后:1・30±2,n=6pv0.01,图4b和C）。此外,NF-kB的两个亚结构，NF-KBp65和NF-ka50.在磁疗干预后含量减少（图4b和C）o—药—药-1100-1100Magnetotherapy社2d520MaleIkB<zNiF-tBP65t-emaleC；APDUNF-kBP5(lGAPDHMaleIkB<zNiF-tBP65t-emaleC；APDUNF-kBP5(lGAPDH4、穴位磁疗抑制T2D病人血淋巴细胞凋亡蛋白信号表达。氧化应激和炎症可以引起细胞损伤和凋亡，这密切参与DKD病程的发展。外源性和内源性凋亡刺激均可激活凋亡蛋白caspase-8和3的表达。为了评估细胞凋亡过程能否被磁疗干预改变我们检测了caspase-3和caspase-8勺蛋白水平，并发现磁疗干预后蛋白表达减少 （图5A和B）o而与此相应的，促凋亡蛋白Bax被显著抑制约50%（前:0・24±2vs后:1・30±1,p<0.05，图5A和B），然而抗凋亡蛋白Bcl-2含量并未改变。

M^gnetutherapyt'aspase3Caspase8M^gnetutherapyt'aspase3Caspase8Be1-2GAPDH讨论中医对早期DKD辩证认为脾肾亏虚，瘀阻肾络是该病病机关键，治则当以健脾益肾为基本大法。本研究所选肾俞、脾俞、胰俞均为脏腑经气输注于腰背部的背俞穴，是内脏器官生理、病理状态在体表机能的感应点。肾俞具有滋阴补肾、培补元气作用；脾俞、足三里健脾益气；胰俞是治疗糖尿病的特定奇穴。诸穴合用，具有健脾益肾、益气养阴之功效，为早期DKD的主要治疗穴位「16,⑺。本研究主要发现在脾俞、足三里、肾俞、胰俞等穴位进行为期四周的PEMF磁疗干预能够显著降低T2D病人U-mAlb排泄，同时显著减少患者血浆MDA和LPS水平。因此，从磁疗方法角度深化了对针灸穴位治疗 DKD机理的认识。由于良好的代谢控制有利于预防和延缓包括DKD在内的糖尿病并发症进程633】，而短期磁疗不影响代谢控制，说明磁疗干预延缓DKD发展的有利作用可能独立于对机体代谢控制，而与它的抗氧化和抗炎功效有关。想直接获得磁疗对 DKD的作用的信号机制，最好的办法是进行肾活检。然而这个理想的实验方法由于对患者肾组织存在一定的侵入损伤性，不易被患者接受。因此，我们退而求其次选择提取患者血淋巴细胞这一简单可行的方法来研究磁疗的分子信号基础。我们在血淋巴细胞的结果表明磁疗干预调节氧化还原平衡主要通过抑制 ROS产生而非加强抗氧化系统能力，因为ROS合成酶Nox4蛋白表达明显降低，而与此同时Nf2抗氧化系统没有明显激活。在过去的报道中已表明了 Nox4参与DKD进展的重要性6io】。Nox4作为主要的ROS合成酶能够导致初期DKD的一些病理性病变⑹。更重要的是，目前已在体内和体外实验中证明使用Nox4抑制剂