DB45-T 2171-2020甘蔗品种真实性鉴定 SSR分子标记法-（高清可复制）

ICS65.020.20B05

DB45广西壮族自治区地方标准DB45/T2171—2020甘蔗品种真实性鉴定SSR分子标记法SSR-basedmethodsforvarietygenuinenesstestingofsugarcane2020-10-292020-11-30广西壮族自治区市场监督管理局发布DB45/T2171—2020DB45/T2171—2020前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由广西壮族自治区分析测试研究中心提出并宣贯。本文件由广西糖业标准化技术委员会归口。术有限公司、广西壮族自治区分析测试研究中心。本文件主要起草人：梁俊、刘守廷、黄易勤、苏丽梅、杜寒春、黄小娟、刘巧频、何慧、梁群清、莫璋红、韦秋翠、韦秀兰。IIDB45/T2171—2020DB45/T2171—2020DB45/T2171—DB45/T2171—20206材料和试剂甘蔗品种真实性鉴定SSR分子标记法1范围本文件规定了利用简单重复序列（SSR）标记进行甘蔗品种真实性鉴定的操作程序、数据记录与统计、判定方法。本文件适用于甘蔗品种SSR指纹数据采集及品种真实性鉴定。2规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。下列术语和定义适用于本文件。3.1推荐引物recommendedprimer品种鉴定中优先选用一套简单重复序列（SSR）引物，其检测位点具有多态性高、重复性好等综合特性。3.2对照品种controlvariety对照品种具有所用SSR位点上不同等位变异的特性。对照品种用于辅助确定待测样品的等位变异，校正仪器设备的系统误差。4缩略语下列缩略语适用于本文件。SSR：简单重复序列（Simplesequencerepeats）；PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）；DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）。5原理依据甘蔗品种基因组中SSR的重复次数存在差异，通过PCR扩增及电泳技术可以鉴定甘蔗品种。1（含GB/T6682PCR用水要求达到一级水指标。试剂三羟甲基氨基甲烷（CHNO）：9%乙二胺四乙酸二钠(EDTA·2Na)：纯度≥99.0%。61硼酸（O）：ρ=143/m³，含量≥9.%6.1.4十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）：ρ=1.32g/mL，纯度≥99.0%。6.1.5氯化钠（NaCl）：ρ=2.165g/cm³，含量≥99.5%。6.1.6琼脂糖。61过硫酸铵（NH)O）ρ=198/m³，含量≥90%6.1.8氢氧化钠(NaOH）：ρ=2.13g/cm³，含量≥96.0%。61硝酸银（A）：ρ=45/m³，含量≥9.%6.1.10甲醛（HCHO）：ρ=0.815g/cm³。611液氮（N）ρ=081gcm。611三氯甲烷（H）：ρ=50gcm³611无水乙醇（HHH）：=.9/m³，含量≥97%DNALIZ500去离子甲酰胺（CHNO：ρ=113mL40%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液（Acryl/BisSolution(29:1)）。四甲基乙二胺（TEMED）：ρ=1.32g/mL。DNA（DNAmarker）：50bp～500bp2×TaqPlusPCR预混试剂：0.1U/μLTaqPlusPolymerase、500μMdNTPeach、20mMTi-C(=.)、00MKl、3mM溶液配制×E称取5.4g0.372g和2.75g0×E量取100mL浓度5×TBE缓冲液（6.2.1）于烧杯中，加入900mL纯水混匀称取4g（614138g（615121g（611、1.49g乙二胺四乙酸二钠（6.1.2）溶于70mL纯水，定容至200mL，在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。无菌纯水纯水在103.4kPa（121℃）条件下灭菌2021%琼脂糖溶液1g琼脂糖..6）溶00m的.5TE缓冲液622），当加热融化。10%过硫酸铵溶液称取10g过硫酸铵（6.1.7），加入100mL纯水溶解。6.2.7电泳缓冲液称取108g（6.1.1）7.44g（6.1.2）55g（6.1.3）0.8g氢氧化钠（6.1.8），加入10L纯水溶解。6.2.8染色液称取0.2g硝酸银（6.1.9），加入400mL纯水溶解。6.2.9显色液称取4g氢氧化钠（6.1.8），加入400mL纯水溶解，临用时再加1.6mL甲醛（6.1.10）。7仪器和设备0.1mg。1515000rpm。PCR垂直板电泳系统。凝胶成像系统。毛细管电泳仪。8SSR引物序列信息引物序列信息见附录A。9操作步骤9.1样品采集采集或送检的甘蔗青叶片做好标识，于-18℃冰箱中保存备用。9.2DNA的提取取9.1中适量甘蔗叶片用自来水冲洗干净，再用纯水冲洗两遍，自然晾干后用不锈钢剪刀剪碎放入研钵中，加入液氮（6.1.11）研磨成粉末状，分取100mg放入1.5mL离心管中，加入750µLCTAB提取溶液（6.2.3），涡旋振荡混匀后于65℃水浴45min～60min，期间每隔15min颠倒离心管混匀；加入500µL的三氯甲烷（6.1.12），颠倒混匀，12000rpm离心3min，转移上清液约0.5mL至新离心管中，加入等体积（0.5mL）约4℃的无水乙醇（6.1.13），颠倒混匀，于-18℃冰箱中静置1h，12000rpm离心3min，去上清，室温下干燥至乙醇挥发完全；加入50µL无菌纯水（6.2.4）于4℃条件下保存备用。3DD4/122DB45/T2171—2020DB45/T2171—2020注：以上为推荐的DNA提取方法。其他能够达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法也适用于本文件。PCRPCRPCR反应体系见表1。表1PCR反应体系试剂终浓度体积无菌纯水-8.5µL2×TaqPlusPCR预混试剂1×12.5µL10µmol/L正向引物0.4µmol/L1.0µL10µmol/L反向引物0.4µmol/L1.0µL25ng/µLDNA模板2.0µmol/L2.0µL总体积25.0µLPCR94℃预变性2min；94℃变性30s，退火30s（退火温度见附录A推荐引物表），72℃延伸30s，35个循环；最后72℃下延伸2min。PCR毛细管电泳检测PCR（附录1µL按序号加入到DNA分析仪专用96孔板孔中，板中各孔分别再加入0.1µLDNA分析仪用LIZ500分子量内标(6.1.14)和8.9µL去离子甲酰胺（6.1.15）。将样品在PCR仪上95℃变性5min，取出，迅速置于碎冰块上，冷却10min～15min。将整个96孔板置于离心机中，离心10s后放置到DNA分析仪上待检。电泳检测数据。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测聚丙烯酰胺凝胶制备在一对玻璃板间插入1.0mm宽的间隔片，在封口处注入1%琼脂糖溶液（6.2.5），让其凝固密封。在50mL中依次加入.5m5T（62175mL4%丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺溶液(:)（6.1.16），搅拌并用纯水定容至30mL；加入200µL10%过硫酸铵溶液（6.2.6）和12µL四甲基乙二胺（6.1.17），混匀后倒入凝胶板之间，随即插好样品梳，使其在50min～60min内聚合凝固，凝胶高度应不小于10cm。4电泳将玻璃板固定于垂直电泳槽上，在电泳槽中加入电泳缓冲液（6.2.7），小心拔下样品梳。用加器吸取1µL不同引物（附录A）PCR产物，加入样品孔中，同时在同一块胶中加入1µLDNA分子量标准（6.1.18）。电泳选用的电压梯度为1V/cm～5V/cm，2×TaqPlusPCR预混试剂（6.1.19）的蓝色指示带到达胶板2/3处（大约1h）后，可结束电泳。银染显色将附着凝胶的玻璃板用纯水冲洗30s～60s后，将凝胶放入方形不锈钢盘中，加入染色液（6.2.8）覆盖凝胶，轻摇5min～10min进行染色；倒掉染色液，用纯水快速漂洗，放入显色液（6.2.9）中，轻摇至显色出清晰带纹；取出凝胶用纯水冲洗两遍，沥干后进行拍照。10数据记录与统计样品每个SSR位点等位变异采用毛细管电泳使用对照品种消除DNA分析仪间可能存在的系统误差，使用片段分析软件读取位点等位变异。对于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将待检样品与对照品种的等位变异片段进行比较确待检样品位点等位变异。示例1：1160bp，160/160。示例2：2160bp165160/16511判定方法当待检样品和对照品种间差异位点数≥2，则判定为“不同品种”。当待检样品和对照品种间差异位点数=1，判定为“近似品种”。当样品间差异位点数=0，判定为“极近似品种或相同品种”示例1：1160bp，160/160。示例2：2160bp165160/16511判定方法当待检样品和对照品种间差异位点数≥2，则判定为“不同品种”。当待检样品和对照品种间差异位点数=1，判定为“近似品种”。当样品间差异位点数=0，判定为“极近似品种或相同品种”。5附录A（规范性）推荐引物推荐引物见表A.1。表A.1引物编号及引物扩增信息序号引物名称条带大小（bp）引物退火温度（℃）引物序列1SMC7CUQ158-17160正向：5’-GCCAAAGCAAGGGTCACTAGA-3’反向：5’-AGCTCTATCAGTTGAAACCGA-3’2mSSCIR36100-18054正向：5’-CAACAATAACTTAACTGGTA-3’反向：5’-CTGTCCTTTTTATTCTCTTT-3’3SMC182560-12056正向：5’-CACGTCCTTCCGCCTTGA-3’反向：5’-TCATCGTTCGTCGCACTG-3’4SMC24DUQ121-14264正向：5’-CGCAACGACATATACACTTCGG-3’反向：5’-CGACATCACGGAGCAATCAGT-3’5SMC31CUQ138-18562正向：5’-CATGCCAACTTCCAATACAGACT-3’反向：5’-AGTGCCAATCCATCTCAGAGA-3’6SMC36BUQ104-25464正向：5’-GGGTTTCATCTCTAGCCTACC-3’反向：5’-TCAGTAGCAGAGTCAGACGCTT-3’7SMC119CG105-13158正向：5’-TTCATCTCTAGCCTACCCCAA-3’反向：5’-AGCAGCCATTTACCCAGGA-3’8SMC278CS140-18264正向：5’-TTCTAGTGCCAATCCATCTCAGA-3’反向：5’-CATGCCAACTTCCAAACAGACT-3’9SMC334BS132-16560正向：5’-CAATTCTGACCGTGCAAAGAT-3’反向：5’-CGATGAGCTTGATTGCGAATG-3’10SMC336BS141-18562正向：5’-ATTCTAGTGCCAATCCATCTCA-3’反向：5’-CATGCCAACTTCCAAACAGAC-3’11SMC486CG224-24558正向：5’-GAAATTGCCTCCCAGGATTA-3’反向：5’-CCAACTTGAGAATTGAGATTCG-3’12SMC569CS165-23362正向：5’-GCGATGGTTCCTATGCAACTT-3’反向：5’-TTCGTGGCTGAGATTCACACTA-3’13SMC597CS144-17964正向：5’-GCACACCACTCGAATAACGGAT-3’反向：5’-AGTATATCGTCCCTGGCATTCA-3’14SMC703BS203-22962正向：5’-GCCTTTCTCCAAACCAATTAGT-3’反向：5’-GTTGTTTATGGAATGGTGAGGA-3’15SMC851MS127-15258正向：5’-ACTAAAATGGCAAGGGTGGT-3’反向：5’-CGTGAGCCCACATATCATGC-3’16SMC1604SA92-12758正向：5’-AGGGAAAAGGTAGCCTTGG-3’反向：5’-TTCCAACAGACTTGGGTGG-3’66表A.1(续)序号引物名称条带大小（bp）引物退火温度（℃）引物序列17SMC1751CL134-15460正向：5’-GCCATGCCCATGCTAAAGAT-3’反向：5’-ACGTTGGTCCCGGAACCG-3’18mSSCIR3160-19060正向：5’-ATAGCTCCCACACCAAATGC-3’反向：5’-GGACTACTCCACAATGATGC-3’19mSSCIR43168-25252正向：5’-ATTCAACGATTTTCACGAG-3’反向：5’-AACCTAGCAATTTACAAGAG-3’20mSSCIR66122-14648正向：5’-AGGTGATTTAGCAGCATA-3’反向：5’-CACAAATAAACCCAATGA-3’21mSSCIR64217-30054正向：5’-ATTGGATTCCTTCTGCTA-3’反向：5’-CATCACAACAGGTTTCAG-3’22SMC123790-16058正向：5’-TTCACGAACACCCCACCTA-3’反向：5’-GCGCCAGGTAACCTACTGAA-3’23SMC1814120-19064正向：5’-GGTTGACGATGAGAAGGACGTG-3’