开题报告-钱深课件

微生物法生产烟酰胺高活性菌株的选育姓名：钱深导师：杨生玉1.课题研究背景

烟酰胺是辅酶I和辅酶Ⅱ等的组成部分之一,参与机体多种氧化还原反应,医学上用于治疗糙皮病、口炎、舌炎、肝脏疾病及日光性皮炎;大剂量可降低胆固醇和甘油三酯,其生理作用与烟酸相仿,但水溶性较好,无明显扩张血管作用。据了解,近几年国外烟酰胺产品价格比较稳定,始终稳定在815～915美元/kg。我国的烟酰胺生产技术处于开发和发展中,生产厂家较少且生产技术落后,规模小、产量低、成本高,原料难以得到且质量不稳定。年产量800t左右,几年来产量和生产能力一直变化不大,无法满足市场的需求,更无法使产品打入国际市场。烟酰胺又称尼克酰胺，维生素B3，(Nicotinamide),分子量122.13，熔点128~131℃，比重1.400.易溶于水、醇、甘油。在空气中稳定，不吸潮。为白色粉末,无臭,带苦味。干燥状态50℃以下极稳,与无机酸和碱一起加热则水解成烟酸。易溶于水、丙酮、氯仿、丁醇等。简称VB3或NSA,微毒，LD=2500～3500mg/kg(大鼠皮下为1700mg/kg)。分子式C6H6N2O,分子量1221.13,结构式为:烟酰胺有三种商品规格，即食品级、饲料和医药级。主要作为饲料的营养性添加剂（水溶性维生素），也用于食品、医药、染料的中间体，同时用作电镀液的添加剂和生化试剂。其应用分别为饲料添加剂40～50﹪,食品添加剂25～30﹪，医药和其它方面20～25﹪。合成方法主要有：化学法（MPDA法、乙醛法或丙烯醛法、3-氰基吡啶水解法、烟酰胺脱水法）；生物合成法（腈水合酶水解法）。检测方法主要有Ph指示剂吸收度比值法、RP-HPLC荧光检测法、紫外分光光度法、近红外光谱法、HPLC法。2.研究目标通过诱变获取腈水合酶高产菌株。找到适合发酵主要产物（烟酰胺）测定的方法和提取工艺。菌株的活化菌株的诱变菌株的筛选与保藏种子培养发酵培养获得高活性菌体腈水合酶催化反应产物的测定及转化率的计算保藏转化率高的菌株遗传稳定性实验4.实验过程流程图菌株活化：经平板培养挑选菌落形态较为优势的单菌落，然后转接至斜面。菌株诱变：出发菌株对数生长期菌体收集菌体无菌生理盐水洗涤并重悬UV照射避光冷藏24h稀释涂布于平板培养基挑取形态较大的单菌落摇瓶复筛突变菌株斜面保藏液体培养基培养36h4000rpm离心20min照射时间为存活率在30%左右的时间28℃4天腈水合酶催化反应：在经29℃恒温的19mL磷酸缓冲液(pH值7.O，O.1mol/L)中加入1mL稀释适当倍数的菌体和1mL一定浓度的烟腈溶液，在28℃的摇床中反应15min，用lml．4mol/L盐酸终止反应，在6000r/min下离心20min，取上清液,对反应液中产物烟酰胺进行检测。遗传稳定性试验：将诱变后的突变株在固体培养基上连续传代5次，分别发酵测定每一代的生物量和转化率。5.已完成实验内容种子液中菌株生长曲线（200rpm，28℃）5.1发酵液中菌株生长曲线（200rpm，28℃）5.25.3产物检测方法应用高铁盐配位-分光光度法测定烟酰胺的含量原理：烟酰胺结构中的酰胺基能与羟胺在碱性条件下生成异羟肟酸，生成物与高铁离子发生配位反应，生成紫红色配合物，在波长496nm处有最大吸收，在一定范围内，吸光度与烟酰胺浓度呈线性关系，可通过测定异羟肟酸铁的吸光度来测定烟酰胺的含量。实验方法：取烟酰胺标准液2.0ml，盐酸羟胺试液2.0ml于25ml比色管中，于60℃水浴中加热60min，取出冷却，加三氯化铁试液2.0ml，静置10min后，用水稀释至刻度，以水为空白，在496nm处测定其吸光度A。高铁盐配位-分光光度法缺陷1.只适用于标准品或纯品的测量。2.此方法使底物（烟腈）与产物（烟酰胺）都显色，在496nm处都有很强的吸收峰。查找到的其他检测方法大多是针对纯品的检测，无法在本实验应用，而唯一有效地方法为HPLC。5.4产物检测方法初探5.4.1主要采用GC-2014C（岛津气相色谱仪）对产物检测。进样量：0.5μL

条件编号气化室温度柱温检测温度1150℃120℃150℃2220℃170℃220℃3220℃150℃220℃条件编号实验结果原因分析1烟腈、烟酰胺及其混合物拖尾现象严重，而且混合物不能分离。1.气化室温度低2.柱温低2拖尾现象得到改善，但两物质出峰时间一致。1.气化室温度高2.柱温过高3拖尾现在明显，混合物不能分开。1.柱温低5.4.2利用薄层层析法对3-氰基吡啶与烟酰胺进行分离和定性分析。（参考文献：烟腈水解中3-氰基吡啶、烟酰胺及烟酸的薄层扫描定量法）所需器材及药品：硅胶GF254、玻璃板、展开槽、点样管及3-氰基吡啶（分析纯）、烟酰胺（分析纯）、烟酸（分析纯）展开剂：苯-氯仿-甲醇-二乙胺-水（1.5:2:0.5:0.05:0.05V/V）方法概述：用硅胶GF254制板，活化后点样，在展开剂中展层，距离薄板上端1cm处停止，烘干后在254nm紫外灯在观察。试验结果：层析板中三种物质的Rf值3-氰基吡啶>烟酰胺>烟酸试验结果：标样3-氰基吡啶、烟酰胺及两者混合液在同一层析板上展层