DB37-T 4415-2021 β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鉴定及牛奶中β-乳球蛋白的检测技术

ICS67.050CCSX04ICS67.050CCSX04山 东 省 地 方 标 准DB37/T4415—2021β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鉴定及牛奶中β-乳球蛋白的检测技术Detectionofβ-lactoglobulingeneknockoutcowandβ-lactoglobulinincow'smilkDetectionofβ-lactoglobulingeneknockoutcowandβ-lactoglobulinincow'smilk2021101820211118山东省市场监督管理局发布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。β-乳球蛋白基因敲除奶牛的鉴定及牛奶中β-乳球蛋白的检测技术范围本文件确立了β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛的定性聚合酶链式反应（PCR）鉴定方法，以及牛奶中β-乳球蛋白（BLG）的定性免疫印迹（Western-Blot）和定量酶联免疫吸附（ELISA）检测方法。本文件适用于β-乳球蛋白（BLG）基因敲除奶牛以及牛奶中β-乳球蛋白的检测。（GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测GB/T27642—2011牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法NY/T1663—2008乳与乳制品中β-乳球蛋白的测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法NY/T1672—2008绵羊多胎主效基因FecB分子检测技术规程NY/T2695—2015牛遗传缺陷基因检测技术规程SN/T2497.16—2010进出口危险化学品安全试验方法第16部分：Western-Blot实验农业部2031号公告-14-2013转基因动物及其产品成分检测普通牛(Bostaurus)内标准基因定性PCR方法下列术语和定义适用于本文件。3.1牛β-乳球蛋白基因Bostaurusβ-lactoglobulinBLGBLG（NCBIReferencesequence:NC_037338.1）PAEP（Bostaurus），编码β-乳球蛋白的基因。注：基因全长4900bp，由7个外显子和6个内含子组成，编码252个氨基酸。3.2β-乳球蛋白基因敲除奶牛β-lactoglobulinknockoutcow利用基因编辑技术敲除β-乳球蛋白基因的奶牛。（PCR）原理通过设计特异引物，扩增出包含牛BLG基因全长的DNA片段，对扩增产物进行测序分析。依据BLG基因编码序列是否发生突变，并提前引入终止密码子，造成蛋白质编码异常，判断是否敲除BLG基因。除非另有规定，仅使用分析纯试剂。4.2.1水：GB/T668250×TETri-base2422g571mL.5ol/LEDT(pH80)10m，1000mL1×TAE。11g1×TAE100mLBLG——上游引物：5′-GCCTCTCGCATCTGACACTT-3′；——下游引物：5′-AGTTTCAAAGAGCCGTAGATGTGTG-3′；6728bp2031-14-2013。10μmol/LPCR4℃～992096×0.2mL12000r/min24×2。4.3.30.001g～100g0.001g0V～600V0mA～100mA4.3.7样品3mL～5mL4.3.7样品3mL～5mLACD，-20）0.1g～0.3g752020～3075-200.2mL～0.5mL1～2DNA基因组DNA提取按照GB/T27642—2011附录B规定执行。DNADNA浓度和纯度检测按照NY/T1672—2008中7.3的规定执行。PCRPCRPCR反应体系及反应程序按照农业部2031号公告-14-2013。PCR4.5.3.1.2.1PCRTaqDNA0.5PCRbuffer25Mixture(2.58μL(10μM)1.0μLDNA200ng～1μg50μL4.5.31.22PCR94℃1i94℃30s52℃30s72℃6i357210m，4.5.3.2对照PCR扩增16bpBLGDNA（B）除DNA模板外，对照PCR扩增条件与4.5.3.1.2相同。PCR按照NY/T2695—2015中6.4.2的规定执行。将检测合格的PCR产物进行全长测序分析。PCRBLGPCRPCR扩增的β-乳球蛋白基因片段参考序列（野生型）见附录A。对测序结果和参考序列进行比对，判定样品是否发生基因敲除。BLGBLG（Western-Blot）原理对预处理的牛奶样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，使用牛β-乳球蛋白特异性第一抗体和辣根过氧化物酶标记的第二抗体进行检测，根据条带位置和着色深度判定样品中是否含有β-乳球蛋白。除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.2.1水：GB/T6682牛β（10mg/mL）0.1gβ10mL10SDS10gSDS80mL100mL3029g1g60mL100mL1.5MTris-HCl(pH8.8181.65gTris800mLpH8.81000mL1MTris-HCl(pH=6.8)121.1gTris800mLpH6.8，定容1000mL1010g80mL100mL5.2.815SDS分离胶（5mL）：1.1mL蒸馏水，2.5mL30%丙烯酰胺溶液，1.3mL1.5Tris-HCl(pH8.8)，0.05mL10SDS，0.05mL100.002mLTEMED5.2.95SDS浓缩胶（2mL）：1.4mL蒸馏水，0.33mL300.25mL1.0Tris-HCl(pH6.8)，0.02mL10SDS，0.02mL100.002mLTEMED10×（500mL）：15.1gTris，75g500mL10×TBS（1L）：88g12.1gTris1LpH5.2.121×TBST（1L）：100mL10×TBS899mL1mL20BCAECL12000r/min24×2。5.3.20.001g～100g0.001g5.3.345℃～1350.255Mpa0V～600V0mA～1000V～600V0mA～100mA样品50mL，离心12000g，5min-805g50mL5.4.1使用BCA试剂盒测定样品中的蛋白浓度。30μg（β1μgβ5×SDS，10010min（SDS）采用NY/T1663—2008中的方法进行SDS凝胶电泳。转膜按照SN/T2497.16—2010中转膜方法执行。封闭将PVDF2h或4β-PVDF2洗膜用TBST10min/次，3～5PVDF1洗膜用TBST10min/次，3～5显影将ECLABmin～2β-乳球蛋白标准品检测到预期大小（18kD）的条带，空白和阴性对照无特异性条带，则表明Western-Blot检测方法正常；否则，需重新检测。SDSβ-Western-Blot18kDββ-“β-乳球18kDβ-β（ELISA）原理ββ-450nmββ除非另有规定，仅使用分析纯试剂。6.2.1水：GB/T66829696（812。100β1001001001×PBS1.44g0.4g8g氯化钠和02g氯化钾溶于800pH7.411BSAPBS1gBSA100mLPBS0.0520PBS50μL20100mLPBS（TMB）2M：10mL9860mL100mLβ-10μg/mL，2.5μg/mL，1.25μμg/mLβ（0μg/mL）12000r/min24×2。6.3.20.001g～100g0.001g45℃～1350.255Mpa5～80450nm样品按照5.4.1和5.4.21000β）（20℃～25。（μL50μL，3730min200μL2min2100μL3730min6.5.4590μLTMB3720min50μL450nmXβ-β-乳 X=C×式中：X——样品中β-乳球蛋白含量，单位为μg/mL；Cβ-μg/mL；N1000ELISA0.13μg/mL按照GB/T27403和GB/T19495.2规定执行。按照GB/T19495.2规定执行。附录A（资料性）PCR扩增的野生型牛β-乳球蛋白基因序列gcctctcgcatctgacacttgtgttcaaaccacccatgctggtgttcggggggccacctatggggaaggctcctcactgcaggggtgcccctgtcccctgagagatcagaagtcccagtctggatgtcgaatggccgagctccctccagaggctccagggagggatccttgccccctccgccgccgcctccagctcctggtgccgcacccttgggcccgatctcgtagacgcctcagtccagtctctgcctccgtgttcactggcattctccccatgtcccctctgtgtccccgttttctctcacaaggacaccggacataagattagcccccgttccagcatcacctgaacagctcacatctgtaaagacctagattccaaacaagattccatcctgaagttcctggtggacgtgagttctggagcgacgcccttcaaccccatcacagcttgcggttcatcgcaaaacacggaacctgggatttatcgtaaaacccaggttcttcgtgaaacactgagcttcgaggcttgttgcaagaattaaaggtgctaatacagatcagggcaaggaccgaagctggccaagcctcctctttccatcacaggaaagggaggtctgggggcggccgggggtctgctcccgtgggtgggctctttctggtacagtcaccaacagtctctccgggaaggaaaccagaggccagagagcaagccagagctagtctaggagatccctgagcctccacccaagatgccgaccagccagcgggccccctggaaagaccctacagtctagggggggaacaggagccgacccgccaggcccccgctatcaggagacaccccaaccttgctcctgttcccctaccccagtacgcccacccgacccctgagatgagtggtttacttgcttagaatgtcaattgaaggcttttgtaccccctttgccagtggcacagggcacccacagcccgctgggtactgatgcccatgtggactcagccaggaggactgtcctgcgccctccctgctcgggccccctccatactcagcgacacacccagcaccagcattcccaccactcctgaggtctgaaggcagctcgctgtggtctgagcggtgcggagggaagtgccctgggagatttaaaatgtgagaggtgggaggtgggaggttgggtcctgtaggccttcccatcccacgtgcctgcacggagccctagtgctactcagtcatgcccccgcagcacccctcaggtcactttcccatcctgggggttattatgactgttgtcattgttgttgcctttttgctaccctaactgggcagcgggtgcttgcagagccctcgatactgaccaggttcccccctcggagctcgacctgaaccccatgtcaccctcgccccagcctgcagagggtgaggtgactgcagagataccctttacccaaggccacagtcacatggtttggaggagatggtgcccaaggcagaagccaccctccaggacacacctgcccccagtgctggctctgacctgtccttgtctaagaggctgaccccagaagtgttcctggcgctggcagccagcctggacccagagcctggacaccccctgcgcccccacttctggggcgtaccaggaaccgtccaggcccagagggggcctTCCTGCTTGGCCTCGAATGGAAGAAGGCCTCCTATTGTCCTCGTAGAGGAAGCAACCCCAGGGCCCAAGGATAGGCCAGGGGGGATTCGGGGAACCGCGTGGCTGGGGGCCCGGCCCGGGCTGGCTGGCTGGCCCTCCTCCTGTATAAGGCCCCGAGCCCGCTGTCTCAGCCCTCCACTCCCTGCAGAGCTCAGAAGCGTGACCCCAGCTGCAGCCATGAAGTGCCTCCTGCTTGCCCTGGCCCTCACTTGTGGCGCCCAGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGATATCCAGAAGGTTCGAGGGTGCCCGGGTGGGTGGTGAGTTCGAGGGCTGGCTGGGGAGCTGGGCCTCAGAGACCAAGGGAGGCTGTGACGTCTGGGATTCCCATCAGTCAGCTAGAGCCGCCTGACAAATCGCCCGCCACAGGCTTCAACCAGGCCTTTAGTGTCTTGCATTCTGGAGGCTGGAAGCTGCAATCCGGGCATCGGCCCAGCTGGCTTCTCCTGCGGCCACTCTCCGGGGAGCAGACAGCCATCTTCTCCCTGTGTCCTTTGCGTGCCCTGGTTTCCTCTTCCTGTGAGGTCACCAGGCCTGCTGGATCCACGCCCGCCCACACAGCCTCACGTAACCTTTGTCATCTCTTTAAAGGCCGTGTCTCCAGTCCTGTGTTGAGGTTCTGGGGGTTAATGGGACACAGTTCAGCCCCTAAAAGAGTCCGCTCTGCCCCTCAAATTTTCCCCACCTCCAGCTATGGTCTCCCCAAGATCCAAATGTTGCCACGTGTGCGGGGGCTCATCTGGGTCCCTCTTTGGGCTCAGAGTGAGTCTGGGGAGAGCATTCCTCAGGGTGCCGAGTTGGGGGGAGGCATCTCAGGGCTGCCCAGGCCAGGGTGGGACAGAGAGCCCACTGTGGGGCTGGGGGCCCCTTCCCGCCCCTGGAGTGCAGCTCAAGGTCCCTCCCCAGGTGGCGGGGACTTGGTACTCCTTGGCCATGGCGGCCAGCGACATCTCCCTGCTGGACGCCCAGAGTGCCCCCCTGAGAGTGTATGTGGAGGAGCTGAAGCCCACCCCTGAGGGCGACCTGGAGATCCTGCTGCAGAAATGGTGGGCGTCCCCCCCAAAAAAAGCATGGAACCCCCACTCCCCAGGGATATGGACCCCCCGGGGTGGGGTGCAGGAGGGACCAGGGCCCCAGGGCTGGGGAACGGGGCTTGGAGTTTCCTGGTACCCCTGGAGGTCCACCCAAGGCTGCTTATCCAGGGCTTTCTCTTTCTTTTTTTCCCCCAACTTTTATTAATTTGATGCTTCAGAACATCATCAAACAAATGAACACAAAACATCATTTTCGTTAACTTGGAAGGGGAGATAAAATCCACTGAAGTGGAAATGCATAGGAAAGATACATACAGTAAGGCAGGTATTCTGAATTCGCTGTTAGTTTGAGGATTACAAATGCACTTGAGCAACAGAGAGACGTTTTCATTATTTCTCGGTCTGAACAGCTCAGTATCTAAAATGAACAAGATGTCATGGAGACAAAGCCGGCGGGGGAGAGGCCCGTGTGAAGGCCGCTGGGCGTGCAGACCTGGGTCCTCGGGGCCCAGGCAGTTCCCACTACCAGCCCTGTCCACCCTCAGACGGGGGTCAGAGTGCAGGAGAGAGCTGGGTGGGTGTGGGGCAGAGATGGGGACCTGAACCCCAGGACTGCCTTTTGGGGTGCCTGTGGTCAAGGCTCTCCCCAACCTTTTCTCCCTGGCTCCATCTGACTTCTCCTGGCCCATCCACCCGGTCACCTGTGGCCCCAGAGGTGACAGTGAGTGCAGCCAAGGCCGGTTGGCCAGCCGGCCCCCTATGCCCACGCCACCCGCCTCCAGAGGGAGAACGGTGAGTGTGCTCAGAAGAAGATCATTGCAGAAAAAACCAAGATCCCTGCGGTGTTCAAGATCGATGGTGAGTGCTGGGCTGGAACTCACTTTCCTCCCGTCTTGATCTCTTCCAGCCTTGAATGAGAACAAAGTCCTTGTGCTGGACACCGACTACAAAAAGTACCTGCTCTTCTGCATGGAGAACAGTGCTGAGCCCGAGCAAAGCCTGGCCTGCCAGTGCCTGGGTGGGTGCCAACCCTGGCTGCCCAGGGAGTTGACCCCGTCCCGGCCCCACAGTCAGGACCCCGGAGGTGGACGACGAGGCCCTGGAGAAATTCGACAAAGCCCTCAAGGCCCTGCCCATGCACATCCGGCTGTCCTTCAACCCAACCCAGCTGGAGGGTGAGCACCCAGGCCCCACCCTGCTCCTGGGGCAGGAAGCCACCCGGAGTGCCACATCTAGGTGAGCCCCTGCCGGCGCCTCTGGGGTAAGCTGCCTGCCCTGCCCCACGTCCTGGGCACACACATGGGGTAGGGtttcctggatgatgggccgggggtggagaaggcccgggacagggtggggagtggtctggctcagaggatgatggtagggctgggatccagggcgtctgcattacagtcttgtgacatctgggggcccacacacatctacggctctttgaaact注：下划线部分为引物序列位置；大写字母部分为β-乳球蛋白基因序列；大写加粗斜体ATG为起始密码子，TAG为终止密码子；大写加粗字体为编码序列。附录B（资料性）PCR扩增的16bp缺失牛β-乳球蛋白基因序列gcctctcgcatctgacacttgtgttcaaaccacccatgctggtgttcggggggccacctatggggaaggctcctcactgcaggggtgcccctgtcccctgagagatcagaagtcccagtctggatgtcgaatggccgagctccctccagaggctccagggagggatccttgccccctccgccgccgcctccagctcctggtgccgcacccttgggcccgatctcgtagacgcctcagtccagtctctgcctccgtgttcactggcattctccccatgtcccctctgtgtccccgttttctctcacaaggacaccggacataagattagcccccgttccagcatcacctgaacagctcacatctgtaaagacctagattccaaacaagattccatcctgaagttcctggtggacgtgagttctggagcgacgcccttcaaccccatcacagcttgcggttcatcgcaaaacacggaacctgggatttatcgtaaaacccaggttcttcgtgaaacactgagcttcgaggcttgttgcaagaattaaaggtgctaatacagatcagggcaaggaccgaagctggccaagcctcctctttccatcacaggaaagggaggtctgggggcggccgggggtctgctcccgtgggtgggctctttctggtacagtcaccaacagtctctccgggaaggaaaccagaggccagagagcaagccagagctagtctaggagatccctgagcctccacccaagatgccgaccagccagcgggccccctggaaagaccctacagtctagggggggaacaggagccgacccgccaggcccccgctatcaggagacaccccaaccttgctcctgttcccctaccccagtacgcccacccgacccctgagatgagtggtttacttgcttagaatgtcaattgaaggcttttgtaccccctttgccagtggcacagggcacccacagcccgctgggtactgatgcccatgtggactcagccaggaggactgtcctgcgccctccctgctcgggccccctccatactcagcgacacacccagcaccagcattcccaccactcctgaggtctgaaggcagctcgctgtggtctgagcggtgcggagggaagtgccctgggagatttaaaatgtgagaggtgggaggtgggaggttgggtcctgtaggccttcccatcccacgtgcctgcacggagccctagtgctactcagtcatgcccccgcagcacccctcaggtcactttcccatcctgggggttattatgactgttgtcattgttgttgcctttttgctaccctaactgggcagcgggtgcttgcagagccctcgatactgaccaggttcccccctcggagctcgacctgaaccccatgtcaccctcgccccagcctgcagagggtgaggtgactgcagagataccctttacccaaggccacagtcacatggtttggaggagatggtgcccaaggcagaagccaccctccaggacacacctgcccccagtgctggctctgacctgtccttgtctaagaggctgaccccagaagtgttcctggcgctggcagccagcctggacccagagcctggacaccccctgcgcccccacttctggggcgtaccaggaaccgtccaggcccagagggggcctTCCTGCTTGGCCTCGAATGGAAGAAGGCCTCCTATTGTCCTCGTAGAGGAAGCAACCCCAGGGCCCAAGGATAGGCCAGGGGGGATTCGGGGAACCGCGTGGCTGGGGGCCCGGCCCGGGCTGGCTGGCTGGCCCTCCTCCTGTATAAGGCCCCGAGCCCGCTGTCTCAGCCCTCCACTCCCTGCAGAGCTCAGAAGCGTGACCCCAGCTGCAGCCATGAAGTGCCTCCTGCTTGCCCTGGCCCTCACTTGTGGCGCCCAGGCCCTCATTGTCACCCAGACCATGAAGGGCCTGGATATCCAGAAGGTTCGAGGGTGCCCGGGTGGGTGGTGAGTTCGAGGGCTGGCTGGGGAGCTGGGCCTCAGAGACCAAGGGAGGCTGTGACGTCTGGGATTCCCATCAGTCAGCTAGAGCCGCCTGACAAATCGCCCGCCACAGGCTTCAACCAGGCCTTTAGTGTCTTGCATTCTGGAGGCTGGAAGCTGCAATCCGGGCATCGGCCCAGCTGGCTTCTCCTGCGGCCACTCTCCGGGGAGCAGACAGCCATCTTCTCCCTGTGTCCTTTGCGTGCCCTGGTTTCCTCTTCCTGTGAGGTCACCAGGCCTGCTGGATCCACGCCCGCCCACACAGCCTCACGTAACCTTTGTCATCTCTTTAAAGGCCGTGTCTCCAGTCCTGTGTTGAGGTTCTGGGGGTTAATGGGACACAGTTCAGCCCCTAAAAGAGTCCGCTCTGCCCCTCAAATTTTCCCCACCTCCAGCTATGGTCTCCCCAAGATCCAAATGTTGCCACGTGTGCGGGGGCTCATCTGGGTCCCTCTTTGGGCTCAGAGTGAGTCTGGGGAGAGCATTCCTCAGGGTGCCGAGTTGGGGGGAGGCATCTCAGGGCTGCCCAGGCCAGGGTGGGACAGAGAGCCCACTGTGGGGCTGGGGGCCCCTTCCCGCCCCTGGAGTGCAGCTCAAGGTCCCTCCCCAGGTGGCGGGGACTTGGTACTCCTTGGCCATGGCGGCCAGCGACATCTCCCTGCTGGACGCCCAGAGTGCCCCCCTGAGAGTGTATGTGGAGGAGCTGAAGCCCACCCCTGAGGGCGACCTGGAGATCCTGCTGCAGAAATGGTGGGCGTCCCCCCCAAAAAAAGCATGGAACCCCCACTCCCCAGGGATATGGACCCCCCGGGGTGGGGTGCAGGAGGGACCAGGGCCCCAG