啤酒发酵酵母扩培学习资料

啤酒发酵酵母扩培学习资料啤酒厂取得接种酵母的方式有三种方式，其优缺点见图2.1：这三种方式是：购买酵母泥；购买纯种酵母；自己保留和培育纯种酵母。图2.1啤酒取得酵母的方式和其优缺点第一节纯种酵母的培育一、培育啤酒纯种酵母工艺原理酵母是一种兼性微生物，这就是说，细胞的新陈代谢和繁衍即可以在有氧的状态下也可以在无氧的状态下进行。啤酒酵母菌的的繁衍进程分为四个阶段（见图2.7）：1．迟缓期：在此期间，虽有营养物质存在，但酵母大体不繁衍；2．对数生长期：此期间酵母繁衍最为迅速；3.稳按期：此时，代谢产物CO2和酒精的积累使酵母繁衍逐渐变慢，活菌数最高；4．衰亡期：营养物质耗尽和有毒代谢产物大量积累，酵母菌死亡率增加，活菌数减少。酵母培育中，最重要的阶段是对数生长期，此时的营养、氧气供给及其他条件如：酵母细胞浓度和温度都必需达到最佳。酵母由于不断地消耗氧气，必需持续通入足够的无菌空气。因为氧气缺乏时，其中一部份酵母会进行发酵，从而产生CO2和酒精，而不是产生新细胞，这样生成的有活力的细胞数就减少了。

二、啤酒纯种酵母的分离培育啤酒酵母的分离培育就是利用特殊的分离技术，将优良强壮的单细胞酵母从原菌中分离出来，加以扩大培育，供生产利用。分离培育的方式很多，工厂常常利用的是平板分离法或划线分离法。取得原菌的方式：(1)从实验室保留的原菌种中分离，原菌种必需先通过几回培育活化的再行分离；(2)从生产中的酵母泥或主发酵液中分离。.平板分离培育法(又称稀释分离法，见图2.2)这种方式简单易行，适合于工厂现场利用。先将盛有麦汁的琼脂试管培育基放在热水中融化，冷却至42〜45C,再将准备分离培育的酵母原菌用白金针移植到已融化的培育基内。如分离培育发酵液的酵母，则先使之静置,倾出上部清液，留少量发酵液，混合均匀后接种。如分离培育酵母泥，需加少量无无菌水或麦汁，稀释后再接种。增殖培葬

篇被9ml无菌水\无菌水X无菌水\无的水\无茵水\将分离培育的酵母移植于融化的培育基内后，充分振荡，使混合均匀，用白金针从该试管挑少量移植到第2支试管中，随即将第1支试管中的培育基倾注在已灭菌的培育皿中，均匀散布在培育皿底面，使之凝固。用一样方式再从第2支试管移植到第3支，而后第4支试管内，别离将取样后的培育基倾注在培育皿内，如图所示。然后，将培育皿置25〜27C增殖培葬

篇被9ml无菌水\无菌水X无菌水\无的水\无茵水\图2.2平板分离培养法.划线分离培育法此法和平板分离法的按照是相似的，各有长处。划线法简单，速度较快;平板法在平板上分离的菌落单一均匀，取得纯种的机率略高。用接种针挑取适当稀释的菌液，直接在已灭菌的平面皿培育基上划线(图2.3),在第3或第4划线区可能取得单一菌落。然后将所需要的菌落移植到斜面培育基上，以待进一步检查。这个方式一般用于分离纯化生产上已有的菌种。

图2.3划线分离培育法3,4-别离表示第1,2,3,4次划线区.林德奈氏单细胞分离培育法（小滴培育法，见图2.4）此法是由汉生氏单细胞分离培育法演变而来的。将准备分离培育的酵母或发酵液，移植到已灭菌的麦汁培育基中，经多次稀释至每1滴麦汁仅含1个细胞为止。在无菌室顶用白金针取稀释液滴在盖玻片上，或凹形载玻片孔内，可滴3〜5排，每排3〜5个小点，点要均匀，距离要一致。将盖玻片翻过来，使有小滴的一面面向凹形载玻片的孔穴，穴内加1滴无菌水，盖玻片和载玻片间用凡士林密封。在显微镜下检查每一个小滴，将只有1个细胞的小滴位置记下，如图所示。将检片置25〜27C培育箱内，培育2〜3天，天天检查酵母细胞生长情况。小滴培育每次应做3个以上的检片，通过培育后，加以选择。挑选发育正常的菌落，用灭菌的三角形滤纸，把菌落吸出。移植到已灭菌的麦汁中，扩大培育，经生理特性鉴定后供生产利用。图2.4林德奈氏小滴培育法第二节啤酒酵母的实验室扩培啤酒酵母纯正与否，对啤酒发酵和啤酒质量的影响很大。啤酒生产企业利用的酵母由保留的纯种酵母，通过扩大培育，达到必然数量后，供生产现场利用鼻一个啤酒厂都应保留适合本厂利用的纯种酵母，以保证生产的啤酒具有稳定的风格和特性。啤酒酵母扩大培育的顺序如下：斜面试管（原菌种）一富氏瓶或试管培育一巴氏瓶或三角瓶培育一卡氏罐培育一汉生罐培育一酵母扩大培育罐一酵母繁衍罐一发酵罐。以上从斜面试管到卡氏罐培育为实验室扩大培育阶段；汉生罐以后为生产现场扩大培育阶段。实验室扩大培育酵母的顺序：.斜面试管一般是啤酒工厂保藏的纯粹原菌或由科学研究机构和菌种保藏单位供给。.富氏瓶培育富氏瓶内盛麦汁10mL灭菌后备用。将种酵母用白金针或巴氏滴管接种于富氏瓶内，在25〜27C保温箱中培育2〜3天，天天按时摇动，使沉淀的酵母从头散布到培育基中。同一种酵母每次培育2〜4瓶，扩大时加以选择。.巴氏瓶培育取500〜1000ml的巴氏瓶，加入250〜500ml麦汁，加热煮沸，使瓶内蒸汽从侧管喷出，30分钟后，吸出弯曲管内的凝结水，塞上棉花塞，冷却备用。在无菌室内，将试管中的酵母液由侧管接种入巴氏瓶内中，在25C保温箱中培育2天,天天检查培育情况。为了使啤酒酵母能逐渐适应低温环境，可将培育温度适当调节到20C左右，但培育时间要略长一些。巴氏瓶也可用大三角瓶或平底烧瓶代替。.卡氏培育罐实验室酵母扩培一般是利用装5ml麦汁的容器，将酵母菌接种于此容器中。酵母繁衍分几回进行，把处于高泡阶段的培育液倒入大约10倍的容器中。为保证酵母良好快速的生长繁衍，一般扩培倍数不超过10倍。实验室酵母扩培通常截止到不锈钢卡氏罐，这是与生产现场扩培的连接环节。通常所用容器体积及麦汁接种量见表2.1o卡氏罐的容量：小卡氏罐8〜10L,大卡氏罐20〜25L。表2.1扩培容器容积与接种麦汁量容器代号123容器体积/ml101001000无菌麦汁量/ml550500接种量/ml555总量/ml555555(1)卡氏罐的外形结构(见图2.5)451245123图2.5卡氏罐1—空气过滤器2—紧箍把3—绝缘手柄4一取样阀5—带橡皮膜的接种头(2)卡氏罐培育酵母的操作工艺流程(见图2.6)卡氏罐有3个紧箍使其密封，卡氏罐一般都带有绝缘手柄、无菌空气过滤器和取样阀。在卡氏罐内注入麦汁，其量约为总容量的50〜80%,将卡氏罐和麦汁一路加热煮沸灭菌，然后放置于冰箱或冷房间内冷却至接种温度备用。在加热灭菌时，先拔去侧管的棉塞，使蒸汽从侧管和弯曲管喷出30min,停止加热，然后塞上棉塞，吸去弯曲管内的冷凝水。麦汁中增添1L无菌水，以补充水分的蒸发。大多数卡氏罐都有带橡皮膜的接种头,在无菌条件下通过接头利用注射器接种。接入酵母时，接种量为100〜200ml。通过取样阀上的无菌空气接头，使无菌空气通过垂直升液管从底部进入麦汁以增进酵母繁衍。若已达到期望的酵母细胞数,则将通过空气过滤机的紧缩空气压入,酵母菌液从垂直液管和取样阀被压出,送入汉生罐。利用后,卡氏罐必需拆开用清洗剂进行人工清洗,并于利用前检查过滤器是不是清洁和完好。卡氏罐一般接入1〜2个巴氏瓶的酵母液，摇动混合均匀后，置于15〜20℃下保温3〜5天，即可进行扩大培育，或可供约100L麦汁发酵用。一般情况下，卡氏罐的最大工作压力为0.2MPa。（3）卡氏罐的长处麦汁杀菌可利用杀菌锅,也可利用燃气炉或电热炉代替；适于麦汁通氧；给酵母转移提供了安全的条件；较易清洗；运输方便。麦汁量大时,不能在实验室进行酵母扩培,因为送输很困难。因此,需要在车间的酵母扩培设备中继续进行扩大培育。加热图2.6卡氏罐酵母培养流程5．实验室扩大培育的技术要求（1）一切培育用具必需完全刷洗干净,塞好棉塞,干热灭菌,灭菌温度170℃左右；（2）培育用的培育基,应利用现场加酒花的麦汁,加热煮沸并加蛋白澄清,利用蒸汽间歇灭菌后，在25℃保温箱中贮存2〜3天，证明无污染后，方可利用；（3）每次扩大稀释倍数约10倍以下；（4）每次移植接种后,要镜检酵母细胞的发育情况；（5）随着每阶段的扩大培育,培育温度慢慢降低,以适应现场发酵情况；（6）每一个扩大培育阶段，均应做平行培育：试管4〜5只，巴氏瓶2〜3个，卡氏罐2个,选择优者进行扩大培育。图图2.8传统开放式酵母扩培第三节啤酒酵母的车间扩培卡氏罐培育后，酵母进入现场扩大培育。酵母扩大繁衍的方式可按照工厂具体条件进行。啤酒厂一般都有汉生(Hansen)罐培育设备，可持续利用1株酵母，反复多次扩培而不需换种，直至酵母出现衰退和染菌等异样情况。酵母生理状态与扩培工艺之间的关系见图2.7o细胞数稳定期同化法L联统酵母扩培图2.7酵母生理状态与扩培工艺之间的关系一、开放式酵母扩培生产规模较小的啤酒厂一般不配置专用的酵母纯种扩培设备，有的往往直接从大啤酒厂购买酵母泥。以这种方式进行生产，虽然启动生产很方便，但由于容器卫生和运输问题,实际上很难保证酵母的卫生和质量。在这种情况下，啤酒厂可自行实施酵母的简易扩培。.传统的开放式酵母扩培方式(见图2.8)其工作方式与实验室的扩培大致相同。从试管到小三角瓶，再从小三角瓶到4X5L的大三角瓶，酵母数量慢慢扩大。最后用带盖的、容量约200L的金属容器进行扩培，然后进入生产，在较小的发酵池中继续增殖和发酵，其参数见表2.2。表2.2发酵池体积与接种酵母液量采用这种方式进行扩培，人们很方便地就可以够将酵母培育液扩大化至5吨。从试管到三角瓶的酵母培育要利用无菌麦汁，以后的培育进程则全数利用生产麦汁。.小罐式酵母扩培方式这种扩培方式是，酵母在一个容量为40L、且容易清洗的金属罐中增殖培育。按照生产规模，也可利用多个罐。但其中一个必需作为原种罐，用于下一次扩培。此种方式简单、方便，是一种很实用的酵母扩培方式。工作方式如下（见图2.9）：图2.9罐式酵母扩培1-40L罐中接种25L嫩啤酒2—纯种培养池将一个罐完全清洗干净，用蒸汽灭菌，然后接入20L经高温灭菌的无酒花麦汁，在大约20C的温度下，酵母很快增殖，并形成丰硕的泡沫。这时，把罐中的酵母培育液别离加入到另外4个已注入20L冷却麦汁的罐中，通过大约2〜4天的培育后，各个罐中的酵母培育液已达到高泡阶段。这时，应及时将3个罐中的酵母培育液（约60L）倒入已完全清洗灭菌的纯种培育池中。第四个罐中的酵母培育液则用于下一批次的扩培接种。此进程可在一按时间内重复进行。二、密闭式酵母扩培方式最近几年来的现代化酵母扩培设备都是在汉生罐的基础上加以改良的，它由不同规格的密闭式不锈钢容器组成的，扩大培育在密闭系统中进行,直至达到发酵罐所需的酵母添加量。由于企业实际情况不同，酵母扩培的要求也不尽相同，其设备及扩培方式也出现了许形式，本书主要介绍典型的汉生罐培育法、一罐法、两罐法和持续增殖法。.汉生罐培育法汉生罐培育系统由1个麦汁杀菌罐和1〜2个酵母培育罐组成，容积为200〜300L,各罐都具有夹套，可以进行杀菌、冷却和保温，罐上装有手摇搅拌器或以通风搅拌。啤酒厂普遍应用的汉生罐酵母扩培工艺方式如下:

斜面25℃"10ml试管斜面25℃"10ml试管23℃*50ml三角瓶培养21℃*500ml三角瓶培养19℃*3000ml三角瓶培养17℃15L卡氏罐培养250L汉生罐培养1t1000L增殖罐培养*4000L扩大罐培养15℃13℃11℃9℃实验室按5〜10倍扩大培育，现场按3〜4倍转接，培育到对数生长期结束前2〜3小时为止，出芽率为75〜85%。操作流程：（1）在无菌条件下，用无菌空气将卡氏罐中的酵母压入灭菌后汉生罐，通风5〜10分钟。（2）同时将麦汁加入麦汁杀菌罐中，进行灭菌，冷却后打入已加入酵母的汉生罐。（3）维持品温10〜13℃,培育36〜48小时，此期间每隔数小时通风10分钟。（4）待培育液进入对数生长期后，将其中85%的酵母移植到下一级扩大培育罐，最后逐级扩培到必然数量，供现场发酵利用。（5）汉生罐中剩余15%酵母培育液，加入灭菌冷却后的麦汁，待起发后，冷却备下次扩培利用。汉生罐内保留的种酵母，应每一个月换一次麦汁，并检查保留的酵母是不是正常，有否污染和变异。正常情况下此种酵母可持续利用半年左右。.一罐法顾名思义，这种方式只利用一个扩培罐。扩培罐带有加热和冷却夹套（见图2.10）。它的主要特点是，在扩培进程中，要不断补充麦汁，一般不对麦汁进行二次灭菌；扩培结束后的酵母液并非全数打出进入发酵生产，而是保留一部份酵母液在扩培罐中，这部份培育液作为下一批次扩培的接种酵母利用。一罐法酵母扩培的关键是，要在酵母的对数生长期进行分割。一罐法酵母扩培的第一步是将大约1/3的麦汁送入通过严格清洗和灭菌的扩培罐中。然后，借助无菌空气经取样阀将卡氏罐中的纯种酵母（约6〜7L）压入扩培罐。接着开泵循环、通风，并按照需要进行冷却。扩培至高泡期即酵母的对数生长期时，再补充约1/3的麦汁，继续培育。当再次达到高泡期时，补充最后约1/3的麦汁。通过持续48小时的培育后，扩培结束，将大部份的扩培酵母液泵入发酵罐。剩余酵母则保留在扩培罐内，作为下一次扩培的接种酵母。通过一段时间的利用后，要将设备放空，进行完全的清洗和灭菌。用这种相对简单、经济的方式，1吨原接种麦汁量在一周内可繁衍酵母接种100吨麦汁。然财口然财口一罐法的长处是设备简单，投资低，酵母能够在最短时间内取得快速生长。借助控制系统可以维持恒定的条件，从而生产出质量恒定的扩培酵母。但这种方式存在微生物染菌的风险，因为无法对麦汁进行杀菌。由于在扩培罐中始终保留部份酵母作为接种酵母，酵母可能由于突变失去某些特性。3．两罐法两罐法是一种传统的酵母扩培方式，在每次扩培的起始阶段通风。酵母不仅处于好氧状态，还处于厌氧状态（犹如后续的发酵进程），即酵母必需适应厌氧环境进行物质互换而获取较低的能量，其扩培倍数较低，一般为3.5〜4倍。两罐法的特点是，每次培育都需要实验室纯种酵母接种，通过生产扩培用于生产后，对系统进行完全排空并杀菌，进入下一个培育进程。两罐法扩培系统（见图2.11）主要由预扩培罐（小罐4hl、5hl、6hl）、主扩培罐（大罐40hl、50hl、60hl）、循环泵、酵母输送、酵母添加、CIP入流和CIP回流组成。另外，还包括产品分派接管盘、本身的CIP装置和管道和控制柜。扩培工艺流程如下：（1）将小罐接满麦汁；（2）将小罐中的麦汁进行杀菌；（3）将杀菌后的麦汁冷却至接种温度；（4）将卡氏罐的菌种接到小罐中；（5）在小罐中进行酵母扩培；（6）将大罐接满麦汁；（7）将大罐中的麦汁进行杀菌；（8）将杀菌后的麦汁冷却至接种温度；（9）将小罐和大罐间的管线进行杀菌；（10）将小罐中的酵母倒入大罐中；（11）在大罐中进行酵母扩培；（12）连接大罐至发酵罐间的管线；（13）对管线进行CIP清洗和蒸汽杀菌；（14）将大罐中的酵母液倒入发酵罐；（15）对酵母扩培系统进行CIP清洗，整个扩培进程结束，开始下一次酵母扩培。两罐法是一种独立的、封密式的系统，通过麦汁杀菌保证不会出现染菌情况。自动化控制系统可以灵活地调整温度、通风和培育时间。使能生产的酵母质量均一。但两罐法的设备购买费用较高，刷洗和操作比较复杂。图图2.12酵母连续增殖扩培系统图2.11两罐法酵母扩培系统4.持续增殖法其工艺流程：首先把麦汁装入麦汁灭菌罐中，在100℃时灭菌至少30分钟，麦汁冷却至14〜16℃备用。然后，在无菌条件下将卡氏罐中的酵母添加到小的增殖罐中，接着将麦汁从灭菌麦汁罐中泵入增殖罐，达到所需容积后，再进行循环并同时通风（见图2.12）。容积测量利用称量装置进行。为使酵母加速增殖，麦汁必需强烈通风。大约一天以后（24〜36h）,即培育液达到高泡期时，在无菌条件下将小增殖罐中的培育液泵入下一个较大的增殖罐中。该进程持续进行至达到所需的酵母量为止。最后，当增殖罐中达到最高酵母量时，将正处于高泡期的嫩啤酒泵入发酵罐中进行发酵。为确保最佳的发酵，在发酵罐中需再次强烈通风。增殖罐中要保留必然量的高泡残液，并当即加入无菌麦汁，以开始下一次酵母增殖。清洗增殖罐之前，要把增殖罐中的内容物全数排空。利用这种追加式的酵母扩培方式在实际生产条件下，可在较短时间距离内持续进行纯种扩培，由此达到均匀的酵母质量。三、纯种酵母扩培存在的问题酵母扩培实际上是一个综合概念，在不同方面存在着各类观点。因此，有必要进一步考虑常常出现的问题。1．酵母扩培装置的设计要求为了达到酵母扩培的目的，即在最短时间内取得细胞数高、质量均一的酵母，在设计酵母扩培装置时，必需使其与啤酒厂具体工作条件相适应。酵母扩培装置的大体要求如下：（1）达到足够量的通风和氧气饱和，至于采用持续或中断方式，取决于相应的通风循环；（2）在扩培罐中进行均匀的混合和散布，保证酵母细胞、麦汁和气泡之间的猛烈接触；（3）在扩培阶段和在扩培结束冷却到接种温度时适当进行温度控制；（4）在良好的微生物条件下扩培；（5）适合的测量和调节技术，保证可再现的流程。2．酵母扩培中的酵母管理Wackerbauer教授曾简明扼腹地描述了酵母扩培的根本任务：“在无菌条件下和最短时间内生产尽可能多的酵母”。良好的酵母管理可以确保发酵和储酒阶段完美的进程，从而保证顺畅的啤酒生产。应该在完美的微生物条件下和最短时间内生产出质量均匀的酵母，所生产出的酵母应该具有很高的发酵能力、较低的死酵母数（＜1%）,细胞数介于0.1〜0.15亿个/ml。良好的发酵管理对发酵进程、后熟、啤酒的可滤性、抗染菌能力和啤酒质量具有特别踊跃的影响。3．是不是有必要对麦汁再次杀菌有些啤酒厂的扩培罐虽然带有麦汁加热装置，但在实际生产中不对麦汁进行再次杀菌。建议在去酵母间的管道上安装热互换器对麦汁进行巴氏杀菌。固然，是不是进行杀菌，还取决于各个啤酒厂的工作条件。4．肯定数量的最适合方式大体上存在三种可能性：压差测量、称重和流量测量。采用压差测量时，必需把底部的压力传感器放在适合的位置上，不然将致使在显示装置上出现压力波动。选择测量仪器时，必需保证在较低数量下也能作出反映。计量称可以准确地肯定重量。但必需采用弹性连接，管道连接处不能受力，这对机械连接和结构提出了更高的要求，投资费用也比较高。若是肯定采用流量测量，必需注意，不能使混合物中存在气泡和泡沫，必需考虑适合的流量计。5．对酵母进行通风通入无菌空气，一方面为了补充所需要的氧气，另一方面为了排除产生的二氧化碳气体。在实际生产中，可以采用不同的通风方式。实际工作中常常采用的通风方式有：（1）每5分钟通风1分钟；（2）在前24小时内每15分钟通风1分钟，在后24小时每5分钟通风1分钟；（3）通风量最高为120升/分，使麦汁中的氧含量达到10〜15mg/L。6．最佳扩培温度建议在扩培开始时维持在15℃，然后缓慢降温到10℃（实际生产中，常常把扩培温度维持在20℃，扩培结束时冷却至接种温度）。7．对酵母起泡采取的办法为了减少泡沫的形成，有些资料中谈到了在扩培罐中安装分派帽。这是一种简单实用的设计，可以避免在扩培罐中出现附件。8．应该达到多少细胞数传统扩培的目标是达到0.8〜1.0x108个/ml细胞数。细胞数不能超过1.5X108个/ml,不然，由于受到麦汁中营养成份的限制，将致使酵母的营养不良。9．酵母扩培质量酵母数不能超过1.5X108个/ml。必需注意，接种酵母中的死细胞数不能＞1%,接种浓度介于0.8〜1.0X106个/ml麦汁。同化结束时应达到以下指标：pH值3.8〜4.2,乙醇含量为1.0〜2.0%（重量比），二氧化碳含量0.5〜1.5g/kg。死细胞数低于1%（甲基兰）。10．同化的取历时间按照各项报告表明，可以在24小时后取用整体积的80〜85%。如能维持酵母扩培的流程条件,可以维持24小时的循环周期。在实际生产中,通常不准确区分各类方式,完全可利用各类转变方式,这取决于各个企业的具体生产条件。需要特别肯定的参数包括扩培温度、通风时间和通风距离、麦汁添加量和生长的时间阶段。这样,用两罐法时也可以将酵母生长维持在一罐法的对数生长阶段。四、酵母扩大培育的几项原则1．菌种条件酵母扩大培育的关键在于利用优良的单细胞动身菌。此动身菌应先经生理特性和生产性能鉴定,然后投入应用,并保证在扩大培育进程中无污染、无变异。每一步扩大后的残留液都应进行无污染和无变异的检查。2．培育温度培育前