Neon 细胞电转仪中文说明书(MPK5000)

，简单的3步骤程序。将收集到的细胞和待转染的分子（例如DNA,RNA,siRNA）的混合物加入到提取物中。2.将带专用枪头的移液器插入带有电极杯的移液器座中;在设备上选择程序,然后按开始。拔下移液器,将转染的细胞转移到含有适当培养基的培养容器中。注：1.为了避免污染,强烈建议只使用电极杯10次。建议在切换到不同质粒DNA/siRNA或细胞类型时更换电极杯和缓冲液为了确保重复性和排除转染条件的变化,建议不要使用枪头超过2次二,软件操作程序1•按下电源开关（位于设备背面，第vii页）打开Neon®设备。本机检查确保Neon®移液器站已连接到设备，然后显示启动屏幕。2•按Voltage启动数字键盘输入电压值。按所需的电压值，然后按Done保存该值。注意：如果任何输入值超出限制,则会显示错误信息，并自动设置最小的限制值。按Width激活数字键盘输入宽度值。按所需的宽度值，然后按Done保存该值。按Pulses激活数字键盘以输入脉冲值。按所需的脉冲值，然后按Done保存该值。如果要保存这些电穿孔参数，请按主屏幕上的’Save”将程序保存在数据库中。按所需的程序号码编辑程序。选定的程序会突出显示。显示“Edit”屏幕后，按键盘按钮输入用户名。光标自动移动到下一个字段协议，并突出显示为红色。继续输入Voltage，Width和Pulses信息。按Enter键将信息保存在数据库中。继续准备细胞和DNA，并设置用于电穿孔的移液器座三，细胞与DNA混合物准备注意事项：将纯化的DNA重悬于1-5Ug/UL浓度的去离子水或TE缓冲液(10mMTrisHCI,1mMEDTA,pH8.0)中。浓度可能因细胞类型而异。DNA量不应超过使用总体积的10％。通过测量A260/280比例来检查纯化的DNA制剂的纯度。电穿孔的比例应至少为1.8。该装置已经用4-7kb质粒进行常规测试，质粒高达约20kb不应该是问题。使用大于20kb的质粒很可能降低转染效率。不要用乙醇沉淀DNA以浓缩DNA。通过乙醇沉淀的浓缩DNA显示差的转染效率和由于盐污染导致的细胞活力。6.不含Ca2+和Mg2+的D-PBS或磷酸盐缓冲盐水（PBS）（第40页）流程：用3mL电解缓冲液（使用缓冲液E,10uLNeon®Tip和BufferE2,100uLNeon®Tip）填充电转杯。（确保管子侧的电极完全浸入缓冲液中。）将电极杯插入移液器座，直到听到咔嗒声。确保Neon®管的侧面电极与Neon®移液器站的侧球柱塞良好连接见下图左侧正确位置）0BallplUng-frrSideel&ctrod^r0BallplUng-frrSideel&ctrod^r在电穿孔前一天，将细胞转移到具有新鲜生长培养基的培养瓶中，使得细胞在实验当天为70-90％汇合。对于大多数优化协议，每10uLNeon®Tip可提供5X104-2X105个细胞。（5X105-2X106个细胞每100uLNeon®Tip适用于大多数优化的方案。）将含有血清，PBS（不含Ca2+和Mg2+）和胰蛋白酶/EDTA溶液的培养基的等分试样预温至37°C。从培养瓶中吸出培养基，并使用PBS（不含Ca2+和Mg2+）冲洗细胞。使用胰蛋白酶/EDTA或TrypLEExpress（目录号12563）对细胞进行胰蛋白酶消化。取一等份的胰蛋白酶化细胞悬浮液并计数细胞以确定细胞密度。将细胞转移到1.5mL微量离心管或15mL锥形管中，并在室温下以100-400Xg离心细胞5分钟。通过在室温下以100-400Xg离心5分钟，用PBS（不含Ca2+和Mg2+）清洗细胞。吸出PBS并以1.0X107个细胞/mL的最终密度将细胞沉淀重悬于ResuspensionBufferR中。轻轻移液细胞以获得单细胞悬浮液。避免在室温下储存细胞悬浮液超过15-30分钟，从而降低细胞存活力和转染效率。可以调整重悬细胞密度以适应电穿孔方案（第18页）或优化方案（第24-29页）的推荐细胞数。通过用含有血清和补充剂的0.5mL培养基将孔插入24孔板，不用抗生素，并在潮湿的37C/5％CO2培养箱中预培养板。如果您使用其他培养板，请参见第18页电镀介质卷建议。对于每个电穿孔样品，下面列出了每孔的质粒DNA或siRNA的推荐量，细胞数量和电镀培养基的体积。使用再悬浮缓冲液T作为初级悬浮液FormatCellTypeDNA[pglsiRNAInN)Neon*TipVol.platingmediumCellno..BufferRorBufferT*9A-wellAdherent0.25-0.510-200lOpL100pL1-2x10*10pL/wellSuspension0.5-110pL口2-5*IO*10pL/welli8-wellAdherentD.25-110-20DlOpL250pL2.5-5kID410pL/wellSuspension0.5-210pLD5-12.5xID*10pL/well24-wellAdherentD.5-210-20DIDpL口500pLQ.5-1xID510pL/wellSuspension0.5-3lOpL1-2.5«ID510pL/well12-wellAdherenit0.5-310-20DlOpL1mL1-2x10s10pL/wellSui5pensiDnQ.5-3IDpL2-5xID510pL/well6-weLIAdherent0.5-3(WpL)5-30(1D0pL]1Q-20D1DpL/100pL2ML2-ix10s10pLar100pL/weLlSuispension0.5-3(WjiL)5-30(100pL]IDpL/IOQpL0.6-1xIO410pLar100pL/weLl60mmAdherent5-3010-20000pL5mL0.5-1xID6IOOjjL/wgUSuspension5-3000pL1-2ExID6100pMweL(IDcmAdherent5-3010-20000jjL10mL1-2kID6100pUweLlSuspension5-3000pL2-5kID1lOOjjL/well8.使用3mL电解缓冲液（使用缓冲液E,10uLNeon®Tip和缓冲液E2,100uLNeon®Tip）装入Neon®移液管根据您的单元格类型在设备上设置所需的脉冲条件将适量的质粒DNA/siRNA转移到无菌的1.5mL微量离心管中。将细胞加入到含有质粒DNA/siRNA的管中,轻轻混合。请参见上表,了解细胞浓度,DNA和电镀量。要将Neon®Tip插入Neon®移液器，请将移液器上的按钮按到第二个停止位置以打开夹具将Neon®移液器的顶部插入Neon®Tip，直到夹具完全拿起活塞的安装杆（见下图）

14.轻轻释放按钮，继续向移液器施加向下的压力，确保尖端密封在移液管上，没有间隙。注意：确保Neon®移液器和尖端紧密连接，无间隙（见左图），无故障移液和正确的电气连接15.将Neon®移液器上的按钮按到第一站，并将Neon®Tip浸入细胞DNA/siRNA混合物中。缓慢释放移液器上的按钮，将细胞DNA/siRNA混合物吸入Neon®Tip。

在移液过程中避免气泡，因为气泡在电穿孔期间导致电弧，导致转染降低或失败。如果您注意到尖端中有气泡，请丢弃样品，并小心地将新鲜样品再次吸入尖端，无任何气泡。16.将带有样品的Neon®移液器垂直插入放置在Neon®移液器站中的Neon®Tube，直至听到咔嗒声。确保移液器突起插入吸液管的槽中。

17.确保Neon®移液器的金属头与Neon®移液器支架内的球形活塞和Neon®Tube（见左图所示的正确位置）紧密连接。在传送电脉冲之前，Neon®设备会自动检查Neon®Tube和Neon®Pipette是否正确插入。在电穿孔期间监测Neon®Tip，以查看是否有由于尖端存在气泡引起的电弧（火花）。电弧导致转染效率低，细胞活力低。交付电脉冲后，触摸屏上将显示“Complete”以指示电穿孔完成。21.从Neon®移液器站慢慢移除Neon®移液器，并立即从Neon®Tip中将样品从移液器上按下第一个停留点，放入含有预热培养基的准备培养基中。22.我们强烈建议将电穿孔细胞加载到没有抗生素的生长培养基中，这可以大大降低转染后细胞的活力。要放弃Neon®Tip,请按第二个按钮的按钮进入适当的生物危险废物容器。对剩余的样品重复步骤7-16。使用两次后,请务必更换Neon®Tips，并在10次使用后更换Neon®Tubes。每个新的质粒DNA样品使用新的Neon®Tip和Neon®Tube轻轻摇动板，以确保细胞的均匀分布。在37°C下在加湿的CO2培养箱中孵育该板。1•如果您没有使用Neon®设备，将后面的电源开关转到OFF位置。避免在Neon®移液器台内溢出任何液体，以防止移液器台上的球塞上产生锈迹。如果您不小心将任何液体（如缓冲液，水，咖啡）溅入Neon®移液器站内，请将主机从主设备上断开，并用干燥的实验室纸擦拭。倒置并允许车站在室温下完全干燥24小时。

优化流程优化流程CelTypeCellLine PrimaryCellsf f 叫AdherentJ厂 ISuspension」 JResupensionBunbrRResuspensionBufferR,*Examplesinclude:3T3-L1,HEK293,CO&-7,C2G12.HeLaPHCT-15rPC-12,MDCK,Raw264.7tU-2OS&tamplasInclude:CEM.HL-60.K-562.Jurkat.LCLrRsmos,U-W7L_ _JAdherentL J厂Suspension- J|ResuspenstonBufferRr \ExamplQBindude：NeuronalStem,Hapatocyte,HUVEC,Macrophage,DendriticL JExamplesInclude;T-cells,B-cell^NKcelkPBMC,hJoiocytesL_ _J确保您按照第16-17页所述制备细胞，使用DNA或siRNA,并制备含有0.5mL含有血清和无抗生素的培养基的24孔板，以转移电穿孔细胞。准备足够的细胞和质粒DNA/siRNA进行至少30次转染。对于使用24孔格式的10uLNeon®Tip的每个电穿孔样品，请参见下表。对于以24孔格式使用100uLNeon®Tip,请将下表中列出的数值适当调整10倍。CelltypoCellno.□NAdRMAResuspenfiionBufferRAdlheinent1k107welL0.5pgDMA/welL15pg/plate50pmclin10pL.tip100nMperwell10p_/well285pL/pLateSuspension2，107welL1pgDNA/well30pg/pUte100pmollinID[iLtip200nMperwell10pL/well270pLypLatc使用3mL电解缓冲液（将缓冲液E用于10uLNeon®Tip和缓冲液E2,100uLNeon®Tip）置于含有细胞DNA/siRNA混合物的Neon®移液站中，如第15页所述。按优化和加载优化协议开始电穿孔使用下列参数。SampleWeUno”PulsevoltageFuhewidthPulseno.AesiilisTransfectionefficiencyCellviability1AlUsepne*optimizedparametercrcontrolwithoutelectroporation.2A2201A315flD2Q1右A41600201/r/