晚期非小细胞肺癌 ctDNA 检测及其临床意义的研究

晚期非小细胞肺癌ctDNA检测及其临床意义的研究〔〕:

摘要：目的CtDNA是来自于肿瘤细胞的血液游离DNA，可以有效反映肿瘤的分子特征，这为我们研究晚期肺癌提供了重要的手段。方法获得36例非小细胞肺癌外周血样本，腺癌28例，鳞癌8例，均为临床晚期患者。通过对患者外周血ctDNA二代测序获得NSCLC样本分子特征同时与临床预后进展分析。结果36例样本中，EGFR突变13例〔36.11%〕，PIK3CA，BRAF、KRAS、NRAS、MAP2K1和GNAQ均有突变。11例患者存在多驱动基因突变，包括8例患者存在双基因突变，2例患者存在四基因突变，1例患者存在三基因突变。36例患者中有27例为治疗后进展患者，通过对27例治疗后进展患者的无进展生存时间进展分析，发现EGFR突变组显著优于EGFR阴性组〔17.174.52〕mVS〔7.331.58〕m，P=0.047。根据血液基因检测结果进展相应的临床用药，单基因突变或者基因突变阴性患者的6个月生存率优于多基因突变患者。结论晚期肺癌基因突变更为复杂，ctDNA检测在晚期非小细胞肺癌治疗中具有重要的指导意义。

关键词：肺癌；ctDNA；二代测序

DetectionofctDNAinAdvancedNon-SmallCellLungCancerandItsClinicalSignificance

LINXiao1,DONGWen-tao2,LAIXiao-jing1,FENGWei1XIAOWen2,ZHENGXiao1*

(1.DepartmentofThoracicRadiotherapy,ZhejiangCancerHospital,Hangzhou,Zhejiang,310000;2.HangzhouHeyiGeneTechnologyCo.,Ltd.,Hangzhou,Zhejiang,310000)

ABSTRACT：ObjectiveCtDNAisbloodfreeDNAderivedfromtumorcellsandcaneffectivelyreflectthemolecularcharacteristicsoftumors.Thisprovidesanimportantmeansforustostudyadvancedlungcancer.Methods36casesofnon-smallcelllungcancerperipheralbloodsamples,28casesofadenocarcinomaand8casesofsquamouscellcarcinomawereobtained.ThemolecularcharacteristicsofNSCLCsampleswereobtainedbysequencingthectDNAoftheperipheralbloodofpatientsandtheclinicalprognosiswasanalyzed.ResultsInthe36samples,13(36.11%)EGFRmutations,PIK3CA,BRAF,KRAS,NRAS,MAP2K1andGNAQwereallmutations.Thereweremultipledrivergenemutationsin11patients,including8patientswithdoublegenemutations,2patientswithfourgenemutations,and1patientwiththreegenemutations.Twenty-sevenofthe36patientswerepost-treatmentpatients.Byanalyzingtheprogression-freesurvivalof27patientswhoprogressedaftertreatment,itwasfoundthattheEGFRmutationgroupwassignificantlybetterthantheEGFR-negativegroup(17.174.52)mVS(7.331.58)m,P=0.047)Accordingtotheresultsofbloodgenetictesting,the6-monthsurvivalrateofpatientswithsinglegenemutationorgenemutationnegativeisbetterthanthatofpatientswithmultiplegenemutations.ConclusionThegenemutationofadvancedlungcancerismoreplicated,andctDNAdetectionhasimportantguidingsignificanceinthetreatmentofadvancednon-smallcelllungcancer.

KEYWORDS：Lungcancer;CTDNA;Secondgenerationsequencing

0引言

肺癌是一类严重威胁人类生命安康的恶性疾病，目前针对肺癌的治疗主要集中为手术、放化疗、靶向治疗等手段【1】。有研究报道，利用ctDNA检测EGFR-TKI治疗肺癌患者，发现EGFRT790M突变和MET扩增是导致晚期肺癌EGFR-TKI耐药的重要原因。本研究利用高通量测序技术，提取晚期肺癌患者血液DNA，通过生物信息学方法分析ctDNA突变特征，理解晚期肺癌药物治疗后的分子特征，为后续治疗提供指导，同时探寻基因突变与疾病预后之间的关系。

1资料与方法

1.1一般资料。研究对象为2022年1月至2022年10月在浙江省肿瘤医院行血液ctDNA检测的75例恶性肿瘤患者。挑选出36例晚期肺癌患者，经组织病理学确认为NSCLC，临床分期为ⅢB-IVB期〔UICC第8版TNM分期〕，治疗信息如附件。36例患者均采集外周血行ctDNA检测。

1.2二代测序

1.2.1血液样本及DNA提取：使用Streck采血管采集10mL外周血，轻柔颠倒10次，6℃-35℃保存，备用。DNeasyBloodTissuekit〔Qiagen〕用于血液DNA提取，提取的DNA〔1〕Nanodrop检测DNA的纯度〔OD260/280比值〕。琼脂糖凝胶电泳分析DNA降解程度以及是否有RNA、蛋白质污染。Qubit对DNA浓度进展准确定量。其中OD值在1.8-2.0之间，含量在20ng以上的DNA样品被用来建库。

1.2.2文库构建及靶向捕获：将获得的ctDNA经末端修复和加A尾后在片段两端分别连接上接头制备DNA文库。采用自主研发的靶向捕获芯片，经过建库和文库捕获进展目的DNA的高效富集，然后在IlluminaNextSeqCN500平台上进展高通量、高深度测序。建库使用的是KAPAHyperprepkit，测序使用的耗材为CN500配套中通量芯片，备案号：浙杭械备20220249，实验流程严格按照试剂盒和仪器说明书的最优化流程进展。

1.2.3测序及生信分析：根据库检合格文库的有效浓度及数据产出需求进展IlluminaCN500平台PE150测序。测序完毕获得原始测序序列〔RawData〕后，进展质控分析；变异信息通过BWA工具与人类基因组〔hg19〕进展比对，通过GATK对测序片段进展连接优化，SNP/Indel通过VarScan2获得，分析的结果通过千人基因组和dbSNP数据库进展过滤，以上分析均在杭州和壹基因科技完成。

1.3统计学处理。所有数据均使用SPSS22.0统计软件进展统计分析，计量资料结果均以均数标准差〔s〕表示，两两比拟采用Fisher准确检验，生存分析采用LogRank检验，以P

2结果

2.1患者信息。本研究回忆分析36例NSCLC患者，其中男18例，女18例；年龄33-74岁，平均62岁；病理分型按照世界卫生组织肺癌的组织学分类：腺癌28例，鳞癌8例；吸烟患者17例，不吸烟患者19例；首次治疗患者9例，治疗后进展患者27例，临床分期以IVB期为主。

2.2测序结果。本研究分析66个常见靶向用药基因，36例患者共获得43个用药位点突变，27例〔75%〕患者至少携带一个靶向用药位点突变，其中腺癌21例，鳞癌6例。28例腺癌患者中检测出突变率最高的基因为EGFR，突变率为42.86%〔12/28〕、其后依次为KRAS17.86%〔5/28〕、MAP2K110.71%〔3/28〕、PTEN10.71%〔3/28〕、PIK3CA7.14%〔2/28〕、BRAF7.14%〔2/28〕、HRAS3.57%〔1/28〕。8例鳞癌患者中检测出PTEN和GNAQ的突变率为25%〔2/8〕，EGFR、PIK3CA、KIT的突变率为12.5%〔1/8〕。详细结果如表1所示。

2.3多基因突变情况。共11例患者存在多驱动基因突变，包括8例患者存在双基因突变，2例患者存在四基因突变，1例患者存在三基因突变。多基因突变结果如表3所示。双基因突变中，与EGFRp.T790M共同突变的情况最多，占50%〔4/8〕。

2.4EGFR突变与病理分型的关系。肺腺癌患者中EGFR突变率最高，到达42.86%，而在肺鳞癌患者中EGFR突变率为12.5%。通过对EGFR突变率与NSCLC病理分型进展分析，发现肺腺癌EGFR突变率,高于肺鳞癌【2】。

2.5血液ctDNA检测基因分析。对上述21例患者耐药进展后进展血液ctDNA检测，发现9例组织学检测EGFR突变阴性患者中有8例检测出基因突变〔88.9%，8/9〕，其中EGFR突变3例〔33.3%，3/9〕，KRAS、PIK3CA、MAP2K1突变各1例〔11.1%，1/9〕，BRAF、PTEN双基因突变1例〔11.1%，1/9〕，KRAS、PTEN双基因突变1例〔11.1%，1/9〕。12例组织学检测EGFR突变患者中有3例在血液ctDNA检测中发现突变基因消失〔25%，3/12〕，有4例伴随有EGFRp.T790M突变〔33.3%，4/12〕，有3例发生突变基因改变〔25%，3/12〕，只有2例未发生改变〔16.7%，2/12〕。

对所有27例治疗后进展患者的血液ctDNA检测结果进展分析，有8例患者存在双基因突变〔突变数=2〕，19例患者存在单基因突变或者突变阴性〔突变数

3讨论

NSCLC是肺癌中最常见的类型，其病理分型主要为腺癌和鳞癌。目前认为组织活检是肺癌分子诊断的金标准。本研究通过对36例晚期NSCLC患者血液ctDNA靶向测序分析发现，27例患者存在至少一个基因突变，EGFR突变频率最高，到达36.11%，其中腺癌为42.86%，鳞癌为12.5%。既往有文献报道NSCLC血液ctDNA检测EGFR突变率为20.4-43.0%，我们的结果与主流报道结果相一致。

EGFR突变是肺癌中突变频率最高的用药基因，尤其在东方人群中。研究发现，在肺腺癌中EGFR突变高达47.9%-55.7%，而肺鳞癌突变频率要低的多。多基因突变在肺癌治疗中报道相对较少，过往研究报道多基因突变的频率为3.13%-8.33%。我们的研究发现36例患者中有11例存在多基因或多位点突变，突变频率到达30.56%，高于过往报道。我们推测可能有以下两个原因，首先，36例患者均为晚期患者，且大局部为治疗后出现进展的患者，因此多基因突变情况存在升高的可能。其次，本研究的样本组成差异导致检测结果与过往报道存在一定差异[3-4]。对27例治疗后进展患者的ctDNA检测结果进展分析，有8例患者存在双基因突变，19例患者存在单基因突变或突变阴性。根据血液ctDNA检测结果进展相应的临床用药，多基因突变患者的6个月生存率低于单基因突变和基因突变阴性患者，两者具有差异优势，但因局限于样本数量，差异不具有统计学意义。我们推测，多基因突变的患者，可能预示着更差的预后。

总之，本研究通过ctDNA二代测序提醒了一个真实世界晚期NSCLC患者治疗进展后的分子突变的特征，为液体活检用于肺癌晚期患者分子诊断提供了一个可能。同时我们发现对耐药进展后的患者行血液ctDNA检测，大局部患者发生了基因突变情况改变，因此对于耐药患者再次进展基因检测是非常必要以及重要的。研究中我们还发现，多基因突变患者的6个月生存率低于单基因突变和基因突变阴性患者，可能预示着更差的预后。综上，二次液体活检对后续NSCLC患者的治疗选择及预后提示具有重要意义。

参考文献

【1】Jemal,A.,etal.,Globalcancerstatistics,2022.CaACancerJournalforClinicians,2022,65(2):87.

【2】W,C.,etal.,CancerstatisticsinChina,2022.CA:ACancerJournalforClinicians,2022,66(2):115.

【3】Preusser,M.,etal.,Brainmetastases:pathobiologyandemergingtargetedtherapies.Acta