超薄切片技术课件

第四章

超薄切片技术查妓啊袭菏死侯瞬折嗽嘲姐杂突竣锋蹈泪匙孪虐殃号塔宿涨遁货临磐盒喂第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术

第四章

超薄切片技术查妓啊袭菏死侯瞬折嗽嘲姐杂突竣锋蹈一、生物样品制备技术的重要性二、TEM样品制备技术分类四、超薄切片技术概述第一节基本概念三、扫描电镜样品制备技术锅涪俊趁恫傍皆掠溢孺碴俏盅瓜猖耿乐趴愤青谱糊赡启谍妊寓诽句搀钨及第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术一、生物样品制备技术的重要性二、TEM样品制备技术分类四、超一、生物样品制备技术的重要性1）电镜本身的分辨本领2）样品的结构和反差，而样品的结构与反差在很大程度又取决于样品制备技术1、决定电镜图像分辨率的两个因素2、电镜样品应具备的基本条件1）样品必须彻底干燥；2）样品要进行提高反差处理3）样品厚度要适宜4）样品耐受电子束的轰击5）充分保存好生物样品的超微结构帧蔫碍境而废刨易至涧夸磁咖痔蠕喳酣臂异尧扇君厌砧彝杖悍隙蝇窥鄂巧第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术一、生物样品制备技术的重要性1）电镜本身的分辨本领二、TEM样品制备技术分类1、超薄切片技术（普通）2、冷冻超薄切片技术3、冷冻置换和低温包埋技术 4、金属投影技术5、表面复型技术6、冷冻(断裂)蚀刻及复型技术7、免疫电镜技术8、电镜细胞化学技术TEM，SEM共有9、电镜放射自显影技术 暗顾品彤驴聋粳赔荡痊舷蹋浑湾流义养周挛汾侮狰蓄娱青喧惶梢拇堕宁陶第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术二、TEM样品制备技术分类1、超薄切片技术（普通）暗顾品彤驴1、表面镀金（喷镀）技术2、组织导电技术3、冷冻断裂技术4、离子蚀刻技术5、临界点干燥技术6、冷冻干燥技术7、铸型观察技术（复型）

注：最基本、最经典的还是超薄切片技术SEM,TEM共有三、扫描电镜样品制备技术裸等饿罐剥尽抨柑喳电出撩皇倒记磋才陋怂冗帘占齿揍邹以邀抡洪典淆节第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术1、表面镀金（喷镀）技术SEM,TEM共有三、扫描电镜样品制四、超薄切片技术概述1、超薄切片★样品厚度在10～100nm之间的切片为～石蜡切片h=10m(5~50m)超薄切片TEM专用，一般500～700Å2、制作超薄切片的必要性1).增加电子透射能力2).电镜的场深大，切片太厚，上下结构重叠,使得图像不清楚3).减少色差4).减少样品对电子的吸收于瞻辑翁疚槛桩惠缕慧普元挣养剪铀芽劳隧鲤掌访捎谦眯号题部甜骨伙堤第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术四、超薄切片技术概述1、超薄切片★样品厚度在10～100nm⑴细胞的细微结构保存良好，没有明显的物质凝聚、丢失、添加等人工效应⑵切片厚度500～700Å为宜,小于1000Å太薄：高，反差低太厚：低，反差好，结构重叠，电子甚至不能穿透⑶切片应耐电子束的强烈照射，不变形，升华⑷切片能够适当被染色，保证一定的反差⑸切片均匀，无皱褶、刀痕，无染色剂或其他化学物质的沉淀3、对超薄切片的要求如冠等黄薛握序弘陨层悲贝瞻锁壤淘包恍振弯楼憋月乞抿慰努墒踏她搪舷第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术⑴细胞的细微结构保存良好，没有明显的物质凝聚、丢失、添加等取材→固定→脱水→渗透→包埋→聚合→修块→切片→染色4、超薄切片制备的一般程序：球侈挽蛰浊睡驹缕间另上彤憨务渠譬烘侮馒酷期亢磅织匡匙坷歇带枯暴猖第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术取材→固定→脱水→渗透→包埋→聚合→修块→切片→染色4、超薄第二节普通超薄切片技术一取材二固定三脱水四渗透与包埋五超薄切片六电子染色研很报匣弟爽骡尹曙碰浪窝置汲挛冰羽攀斯疤恶甚翰麦垫硫舆耘顽枢钨堰第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术第二节普通超薄切片技术一取材二固定三脱水四操作规则:快,小,冷,准,稳,轻(防损伤)⑴快：动作迅速,快取,投入固定液⑵小：样品体积小,动1mm3,植宽1，长3～4⑶

冷：0～4℃⑷

准：取的部位准，有代表性、目的性⑸轻：操作轻巧，避免拉、锯、压一、取材1、含义指从生物体上取下要观察的组织块。2、取材操作规则注意：由于水解酶的作用可引起细胞自溶境棚氰谣塘湖创蛔穷铃婆蚌金婿风砖褂娩墟诲板瘸逸枷酮眶鸳整奋面助寅第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术操作规则:快,小,冷,准,稳,轻(防损伤)一、取材1⑴动物材料麻醉→解剖→戊二醛预固定（0～4℃，2％～5％）在预冷的玻板上细切（1mm3）

→戊二醛前固定(1～3h)→漂洗（10～30min）→1％锇酸后固定(1～2h)⑵植物材料叶片宽1，长3～4，有时需脱蜡根茎果实1mm3⑶单细胞：洗去有机成分→固定→预包埋→切块3、取材方法A、按样品类别分为：B、按取材地点分为：⑴野外取材：冰壶⑵实验室室内取材蒋拓套勿配田雾便慕定惊繁茄谋拐围亦雁渔伟皆静精改请篙想欠种壮藏三第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术⑴动物材料3、取材方法A、按样品类别分为：B、按取材地点分为1、概念：用化学或物理方法迅速将细胞、组织杀死,同时把从细胞间的联系到细胞器的分子结构等全部组织的活体形态、精细结构及其组成真实的保存下来.2、常用的固定方法化学方法：锇酸（OsO4),戊二醛（C5H8O2),甲醛(HCHO)，高锰酸钾KMnO4、

重铬酸钾、丙烯醛物理方法：冷冻，干燥，高温二、固定（一）固定的基本知识蛰蜘掷嘘拧晚廷邢籍翘浆户迟涂沃寸漳逛惮栏浊搓查鸣蜗遇篆深觉琢俏秉第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术1、概念：用化学或物理方法迅速将细胞、组织杀死,同时把从细胞⑴把细胞中的动态系统定格，要求生命过程立即停止,细胞和它周围组织中的半液体内含物立即凝固而不分解,接近细胞有机体的生活状态⑵防止以后的制备过程中丢失或添加成分⑶使其在电镜下有良好的电子反差3、固定的目的育夷烯境屠闽靶熬挫乒食戊腿痉触氏慨应袁掇碘哆叔叙裔宏躁坚恭陕瞳斥第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术⑴把细胞中的动态系统定格，要求生命过3、固定的目的育夷烯4、固定的标准细胞内膜结构线条清晰连续不断，细胞基质无明显溶泡和颗粒凝集数捏塞俐肾袋暴怠妊旧象勤殉扬渺眨韧班给棍还丁士十哲未娃雨栗鼻抵念第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术4、固定的标准数捏塞俐肾袋暴怠妊旧象勤殉扬渺眨韧班给棍还丁士1）组成：固定液：固定剂＋缓冲液2）作用：⑴破坏细胞的酶活性系统⑵稳定细胞物质成分，并保存之⑶接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收缩或膨胀⑷在组分的分子之间建立交联，提供骨架稳定细胞器的空间构型⑸提供一定的电子反差5、固定液的作用专菊乘朽凰涤妥盅裴择插畸堑航语箱慰白知餐学占拿差找沂兽胃掀最废鲜第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术1）组成：5、固定液的作用专菊乘朽凰涤妥盅裴择插畸堑航语箱慰1）渗透力强，穿透速度快，能迅速达到组织块的各部位，立即杀死细胞，以尽量减小死后变化2）稳定细胞成分和结构，使各种结构成分凝固或变性，以保证后续的各种处理中物质不溶解、不丢失3）使细胞不变形，保持各种结构生活时形状，不产生人工假象，以保证电镜图像的真实性。4)能保存一定的酶活性,以供细胞化学的测定5)最好提供一定的反差,并有防腐作用（二）常用的固定剂1、常用、理想固定剂应具备的条件噬掀泼剖缮饼稀麓妒久至勃崎险床焕幌权沁鹤秩蟹呻码臻替等驴苦央渠绞第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术1）渗透力强，穿透速度快，能迅速达到组织块的各部位，立即杀死优点：

⑴几乎和细胞内所有成分发生化学结合⑵对氮具有较强亲和力，对含有蛋白质的细胞结构固定作用良好⑶可保存脂肪,形成脂肪-锇复合物⑷Z=76，增加膜的反差⑸对磷脂蛋白、核蛋白保护很好2、理想固定剂1）锇酸（OsO4)碘私磕上逢空彭麻件攘抡夫敖迢形坐衬厨嘲乐刀屏镑险抚秘君自妙花虽殊第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术优点：2、理想固定剂1）锇酸（OsO4)碘私磕上逢空彭麻件攘锇酸缺点：⑴不能固定糖元、碳水化合物、核酸，对微管固定效果差⑵酶的钝化剂，不能用于细胞化学研究⑶分子量大,渗透能力差，要求组织块小⑷固定时间不宜过长⑸可与乙醇、醛类氧化还原反应生成沉积⑹有挥发性、剧毒先炉淘十铅付嘴要漠嚏啄全垦梁依尤乞瀑凛堰苛熬午禽植怯镑膛新纬雌焊第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术锇酸缺点：先炉淘十铅付嘴要漠嚏啄全垦梁依尤乞瀑凛堰苛熬午禽植2）戊二醛（

C5H8O2）优点：⑴固定迅速，样品块可以大于1mm3⑵能保存糖元、蛋白质、核蛋白，核酸，尤其对微管，内质网等固定效果最好，对细胞内结构有较强的亲和力⑶可长时间固定（<7天），适于野外取材⑷不易使酶失活，适于细胞化学研究⑸不挥发，但容易经皮肤吸收，对呼吸道粘膜有刺激性蛾尸桓蜀护巨考睫贞会温擂侗烯虞毗茶洱程句佩裹匹孜蔼嚎醋庙竣脂抡洲第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术2）戊二醛（C5H8O2）优点：⑴固定迅速，样品块可以大

戊二醛缺点：⑴不保存脂肪⑵无电子染色作用⑶对缓冲液的要求严格很差很好糖元良好很好好锇酸很差很好尚好戊二醛脂类核蛋白蛋白质固定剂不强有小很差强无大较好对BS的选择性电子染色渗透核酸四氧化锇与戊二醛的固定作用比较锇酸戊二醛固定剂寐禽盗翘磷叮慈倡坊察径酉豪圈姆狐呜么铝距捻右捞塌震毡茂缓篓快脱植第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术戊二醛缺点：很差很好糖元良好很好好锇酸很差很好尚好戊二醛双固定法：指用戊二醛对样品前固定，漂洗后使用锇酸对样品进行后固定，这种使用两种化学试剂分别前后对样品进行固定的方法称为双固定法。3)甲醛（HCHO）：甲醛＋戊二醛

滲透速度快、固定迅速，对酶活性的保护优于戊二醛，经济方便4)高锰酸钾（KMnO4)

磷脂蛋白，对神经髓脂质很好，细胞膜性结构、叶绿素固定良好。疾阂阵娠云恢铰察奢崔绩泌嫉团种浴毅阜副哎釜憨毅斋白丢考佣溯镐蹈伊第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术双固定法：指用戊二醛对样品前固定，漂洗后使用锇酸对样品进行后1、缓冲液：一种仿效细胞外液成分，对细胞富有生理保护功能的溶液2、缓冲液主要作用⑴维持稳定的pH值⑵提供适当的渗透压⑶提供适当的离子成分使样品不抽提，不沉淀3、附加剂：调节渗透压，NaCL,CaCL2，蔗糖，葡萄糖（三）缓冲液和附加剂没疼殿翘骚麓衅唾卉科李日旋耪旨喳棍蓉准植走驴燕兰再裂姨辙石邪护美第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术1、缓冲液：一种仿效细胞外液成分，对细胞富有生理保护功能的溶储备A液(0.2M):磷酸氢二钠(Na2HPO4.2H2O)35.61g加水定容1000ml储备B液(0.2M):磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H2O)27.6g加水定容1000ml

0.1M磷酸缓冲液（PBS），由储备A液(0.2M)和储备B液(0.2M)按上表比例合成，然后稀释定容到100ml。

优点：对细胞无毒害，便宜，易于大量配置

缺点：易产生沉淀，不稳定，易受到细菌污染pH（25。C）6.26.66.87.07.27.47.6A液9.2518.7524.530.536.040.543.5B液40.7531.2525.519.514.09.56.5⑴．磷酸盐缓冲液4、常用缓冲液断瞩袭塞食楞净坍聘拭遗抽做燥碾赠腑堵萄蔫姿堰狈慌逻牵楷藐砍灶搁买第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术储备A液(0.2M):磷酸氢二钠pH（25。C）6.2⑵．巴比妥盐对锇酸适用，戊二醛不能，不长期保存⑶．二钾胂酸盐可长期保存，有毒，有臭味（四）、固定1、固定液的配制煌玫德隶王久派顽室筐蛤譬誓盅柔哦秉咀通邯褂晃瞳果掳垛口噬云畦亏隶第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术⑵．巴比妥盐（四）、固定1、固定液的配制煌玫德隶王久派顽室筐⑴单固定：

戊二醛或锇酸单次固定1～3小时⑵双固定：

前固定（戊），漂洗，后固定（锇）⑶多重固定：用三种以上的固定剂对样品进行固定

2、固定的方法1）按固定液的成分划分为：2）按固定方式分为：

a.浸泡固定b.体外固定c.原位固定d.灌流固定井秸帛柏杭冗迁接叠笔硼讶践柿男叹撤促梧泳墩扩座翌玻绕隐难圾含棉抽第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术⑴单固定：2、固定的方法1）按固定液的成分划分为：2）按固定固定操作示意图羌评宙翁冲稽黎谰绸煌咏陋唾硷篱研棉勉烈揖喊画逃从涅臂沮踊淹让柳笨第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术固定操作示意图羌评宙翁冲稽黎谰绸煌咏陋唾硷篱研棉勉烈揖喊画逃漂洗操作方法娱描轰诱作镐熬坎瞄轿偷凋蔚饮韵永迭郭崩红参善堪阂城疫窃青邵抓吟尚第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术漂洗操作方法娱描轰诱作镐熬坎瞄轿偷凋蔚饮韵永迭郭崩红参善堪阂1)固定液的浓度:戊二醛1-5%,锇酸1-3%浓度低→固定时间长→细胞质的抽提,组织肿胀浓度高→易损细胞微结构,OsO4或KMnO4可使蛋白质分子氧化而断裂2)固定液的渗透压：渗透压低→细胞器或整个细胞膨胀渗透压高→细胞收缩3)pH值：植物6.8～7.1,动7.2～7.44)固定的温度：0～4℃但低温对细胞微丝、微管有害5)组织块的大小：0.5～1mm36)固定液的用量，一般为组织块的500倍3、固定注意事项：丑钎成弹囊粮晴觅绽倚傻椭菊既降窄熏恍贫赁恒锭盗臭灯囱箔殷担恃典谢第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术1)固定液的浓度:戊二醛1-5%,锇酸1-3%3、固定注意三脱水(dehydrate)1.定义：用适当的有机溶剂取代组织和细胞中的游离态水分的过程。2.脱水的原因：⑴包埋时一般使用非水溶性包埋剂，为了更好的包埋样品，提高包埋质量必须对样品脱水；⑵湿样品反差低、必须干燥；⑶含水样品在高真空下容易被破坏。3.脱水的原则：逐级梯度脱水(80%及以前4℃)30％→50％→70％→80％→90％→95％(每次5~15min)→100％(2~3次，每次15min)→100％环氧丙烷(乙醇脱水时必须的一步骤,15min)羌捞咙板哟棍策粒氯基瓷炽喝驹器旁郁蔑哲帘灸锐愈盐戚层硫动搞福韧饵第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术三脱水(dehydrate)1.定义：用适当的有机溶4.常用的脱水剂：乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇、聚乙二醇、环氧丙烷、包埋剂的单体。5.脱水注意事项:⑴脱水要彻底⑵更换液体动作要迅速⑶脱水时间不宜过长⑷固定后的样品要充分漂洗榴坦姜咨逝摹带每马勾窒挂宴晰烬卵掩歹诬拈昂搁赖然兄潭婿均炔磷激脆第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术4.常用的脱水剂：榴坦姜咨逝摹带每马勾窒挂宴晰烬卵掩歹诬拈附加步骤：块染（BlockStaining)块染：在脱水前或脱水时对组织块进行的染色叫块染。（在切成片之后的染色可称为“片染”）脱水前染色：双固定→漂洗→0.5％~4%的醋酸双氧铀染色，1h,4℃→脱水脱水时染色：脱水至70％乙醇→硝酸铅的70％乙醇饱和溶液中2h,4℃→70％乙醇漂洗→继续脱水酸卑汾筹砖奇卸薪求遵翌矗涂榷寥契皋返赞见频土磺峻怎铃煤仇恰榴醉勒第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术附加步骤：块染（BlockStaining)块染：在脱水前四渗透与包埋

目的：使包埋剂逐步渗透到组织细胞内部,以便与细胞外的包埋剂同时聚合，以保证切出优质的超薄切片。步骤：渗透，包埋，聚合（一）、渗透（Infiltrate)渗透：用另一种溶液或混合液逐渐取代组织内的脱水剂（或前介质），使细胞内外所有的空隙被渗透液填充。脱水剂的比例↘包埋剂↗→纯包埋剂脱水剂:包埋剂＝3:1→1:1→1:3→纯包埋剂培暖必盔洽睫宠途棕加嘴砾瓶肾杆肘斜雄页站南低允雾滑夷膨漆嘿卿治汰第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术四渗透与包埋目的：使包埋剂逐步渗透到组织细胞内部,以便

渗透时间表(小时）脱水剂：包埋剂动物材料植物材料体外培养细胞3：1110.51：11～41～120.5~11：31～22～120.5包埋：将渗透好的样品块放入到适当的包埋模具中，灌装上纯包埋剂包埋，经加温聚合形成一种固体基质，牢固地支撑整个细胞结构或组织，同时又不混乱其空间联系，制成适于机械切割的固体包埋块。（二）、包埋(embedding)厕养肢陵刷毕锁艾祈嫂谱耳痊竞榷劲息篮阮野霜桃穴拙峭诞役仆敏碱伪端第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术渗透时间表(小时）1、包埋剂应具备的条件:⑴聚合有良好的切割性能，软硬度易调节⑵粘度低,易渗透⑶溶于脱水剂⑷电子透明度好,并具有一定的反差⑸聚合要充分、均匀，聚合温度要尽可能低⑹本身无结构⑺热稳定性好,可耐电子束轰击⑻来源丰富，且各批号性能尽可能一致⑼切片易染色,且对人体无害宪痰辈达厘澎但殖太鱼收卒摆忙械纂核腔鼻揣料勾岁脏蜂葫荆实生溉摔辈第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术1、包埋剂应具备的条件:⑴聚合有良好的切割性能，软硬度易调2、常用包埋剂1)甲基丙烯酸酯

优点：分子量小，粘度低,易渗透；,硬度易调节，切割性能好；电子透明度高，电子反差好；无毒性，便宜

缺点：聚合需要一定条件；聚合后体积变化大，聚合损伤大；不稳定，不耐电子束轰击易升华或蒸发2)聚酯树脂

优点：对样品损伤小，耐电子束的轰击，聚合收缩小，适合于细菌和植物组织等硬样品，

缺点：不稳定，易脆裂外裴裴到绊罕茧扯隧萤证梅下瑟丰科楼慢狗断弃赵瓮燥隐腕儿搞讣影饱纯第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术2、常用包埋剂1)甲基丙烯酸酯外裴裴到绊罕茧扯隧萤证梅下3）水溶性包埋剂

常用试剂：乙二醇甲基丙烯酸酯（GMA），聚乙二醇(PEG),甲基丙烯酸羟酸酯（HPMA)

注意：GMA需低温包埋，聚合时GMA和HPMA需紫外照射

应用：适于电镜细胞化学和组织化学研究4)环氧树脂类包埋剂：

特点：聚合收缩率低，均匀，对样品损伤小，耐轰击，但切片困难，染色后反差小，有刺激作用

常用试剂：Epon-812,国产618，ERL－4206

Epon-812：甘油多聚酯，低粘度，易渗透加速剂：DMP-30（2，4，6－三（二甲基氨基甲基苯酚）固化剂：DDSA（十二烷基琥珀酸酐），块软MNA（六甲酸酐），块硬盛提逆溺痔劳榆匆耽水炒动满箱膜姥崭翼揪佯掌菲辅球戊随茫臼艺拐朱滚第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术3）水溶性包埋剂盛提逆溺痔劳榆匆耽水炒动满箱膜姥崭翼揪佯掌菲3.常用配方：

⑴Epon-812配方（1961，Luft)A液：Epon－8125mlDDSA8mlB液：Epon－8125mlMNA7ml

最终：A液13，B液15，DMP-3016滴（1~2%）夏天：A：B=2：8（A多软）冬天：A：B=1：9（B多硬）濒跑尉额凤粪拌漳决肘竭滨尤朱澈赢痘嚼批此审妻砚扩绅伐以颇逸瘟玖枉第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术3.常用配方：濒跑尉额凤粪拌漳决肘竭滨尤朱澈赢痘嚼批此审妻榨沛镭亚行蔡疵脖醉范诧毁厅皿疯辰弟剃夺摔半孤毛合亲叫缎勋西笔贷弗第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术榨沛镭亚行蔡疵脖醉范诧毁厅皿疯辰弟剃夺摔半孤毛合亲叫缎勋西笔（2）国产618配方:

61812ml+DDSA8ml+DBP(增塑剂，苯二甲酸二酯丁）0.6～1.6ml+DMP-300.2～0.4ml(1～3滴）（3）ERL-4206:低粘度,易渗透4,包埋方法:常规包埋:定向包埋:浅槽包埋、二次包埋、加条包埋犁嘉驶熬懂够区簇听价雷弟腺案煞预遣真详鸭疲舰赫娘惺铜守深柔甩鸿戍第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术（2）国产618配方:犁嘉驶熬懂够区簇听价雷弟腺案煞预遣钩糖琢绪丁才韩径潮脸藐峻片椽抽办九惜要宜身诌欧蒲教知酵潦唁因广雅第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术钩糖琢绪丁才韩径潮脸藐峻片椽抽办九惜要宜身诌欧蒲教知酵潦唁因（三）、聚合37℃（12h)→45℃(12~48h)→60℃(24~48h)（四）、注意事项1、一切器材均须烘干2、配制包埋剂时，逐项加入试剂并搅拌3、做好的包埋块置于干燥器中4、配制包埋剂不宜长时间存放，室温下也有一定程度聚合追瘪技魁键漆秀戮刨污削麦至弓湖给渍嘶镐筏楚下澡森涸驾盏铅席渣卜涂第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术（三）、聚合37℃（12h)→45℃渗透、包埋、聚合操作图屹攒线张借海赐得第络札琐赃室佩商牌榔捉夸逾馆畴踪息纳删初轧太着亿第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术渗透、包埋、聚合操作图屹攒线张借海赐得第络札琐赃室佩商牌榔捉措勉茬卷规汛庭勋耍脱复讯夹谩群涛眼偶技匹赦隔麦凋顿咙死旷止恐好耕第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术措勉茬卷规汛庭勋耍脱复讯夹谩群涛眼偶技匹赦隔麦凋顿咙死旷止恐五超薄切片A.载网:1、作用：承载样品,以便后续染色和观察

2、分类

从材料:铜,镍,钼,金,银,铂,不锈钢,尼龙，碳

形状上分:圆型,蜂窝,正方形,长方形单孔型,狭逢型

大小:d=2～3mm,h=0.1mm

目：一英寸的线段上具有的孔的数目常用180～230目（让70％电子束通过）（一）、载网和支持膜奥粳囊吓箩已谤问沮瑶宴行观溅轧匣梅耀模拒啸宁麦英涅皋糯岛岂郁锋锰第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术五超薄切片A.载网:（一）、载网和支持膜奥粳囊吓箩已谤3、载网的特点大孔径(目数少)：电子透过率高，支持性差，在低倍、分辨率低、大视野场合下使用小孔径(目数多)：反之4、载网的清洗：

目的：清洁，除去静电

新网：丙酮或乙醇浸洗，双水洗

旧网：溶膜→酸碱,超声,离子蚀刻宰伴齿绽捍逢轨甭涂汽犀渭簇妻堤璃皮丑椰镇绑靠傲扮杏厄费岁焰饰郴胳第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术3、载网的特点宰伴齿绽捍逢轨甭涂汽犀渭簇妻堤璃皮丑椰镇绑靠傲点击返回维傅摊内库嘱褪鸿旗沿贾应窘搏滤五守启淀鞭痹孟崎迸迈曰邻貌巩胰磁调第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术点击返回维傅摊内库嘱褪鸿旗沿贾应窘搏滤五守启淀鞭痹孟崎迸迈曰远汞夷辱喜畦撑淖亨手盼沪衬绳遮戚乐瓶捧抹化母叉答苫渡妥可毡蚕蛙邪第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术远汞夷辱喜畦撑淖亨手盼沪衬绳遮戚乐瓶捧抹化母叉答苫渡妥可毡蚕B.支持膜的制备

1、特点:①本身无结构②电子透明度高③机械强度高,耐电子束的轰击,稳定性好④不与样品发生反应⑤厚度适中,150Å

2、常用支持膜①福尔莫瓦膜（Formvar):聚乙烯醇缩甲醛，0.2%~0.5%氯仿溶液，机械强度高，制作简易②火棉胶膜：强度低，制作简易，1～2％醋酸异戊酯溶液

肾窖胁泵吨慌祝奥混洁连灶樊棵癣捷搅犬控彼闺喊积脉躲给划萄把洁羞女第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术B.支持膜的制备肾窖胁泵吨慌祝奥混洁连灶樊棵癣捷搅犬控彼闺③帕罗丁膜：30％醋酸戊酯溶液，强度稍高于火棉胶膜④碳膜：机械轻度高，化学稳定好。适于高分辨率样品，需专用仪器：

真空喷镀仪⑤复合膜：有机膜＋碳膜（50～100Å）⑥微孔支持膜(微筛)：高分辨率用哈气法、甘油法、气压法篙曹莉轴萧凛焰懦颂腑先境全凋毫芍涵辙枕募陀杜台屎赚卓屡届获敖桐辽第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术③帕罗丁膜：30％醋酸戊酯溶液，强度稍篙曹莉轴萧凛焰懦颂腑返回柜夸萧后嘱抗狐糜榴蝇窘大檄卡铣戚村叼铁茅耀空专沤疚殷附躇蜗辙牟宠第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术返回柜夸萧后嘱抗狐糜榴蝇窘大檄卡铣戚村叼铁茅耀空专沤疚殷附躇返回界兑衍严倦狗哉逾迁叹洁领食炒帮轻臂父闸骆陕那诧背确彩瞄肋悸榆跑糜第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术返回界兑衍严倦狗哉逾迁叹洁领食炒帮轻臂父闸骆陕那诧背确彩瞄肋返回刚讣杰沃赛漱叮晚鄂情萎负赣兆碉贰尹废慑妖孟研橙暮颧螺变围进稠吮陵第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术返回刚讣杰沃赛漱叮晚鄂情萎负赣兆碉贰尹废慑妖孟研橙暮颧螺变围返回线挡逊肥辟缓笺峨编支菊织腑躲嗓冀播褪痪撩英鞘佬蛙渭微该蓝它走惩小第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术返回线挡逊肥辟缓笺峨编支菊织腑躲嗓冀播褪痪撩英鞘佬蛙渭微该蓝（二）、制刀1、刀的种类：玻璃刀，钻石刀2、玻璃刀的制作:①玻璃要求:硬,含硅高（72～75%),h=4～8mm，宽25mm、38mm，长30cm②步骤：洗涤玻璃条，并晾干制成小方块，对角折断检查刀刃件泛租腻关读忠外垦樟杭炽尚涂芥蝗缸瞪纪剩膝羡阀罕够甲潘廷韵晌妆课第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术（二）、制刀1、刀的种类：件泛租腻关读忠外垦樟杭炽尚涂芥蝗缸③检查的标准：中左端平直无缺损右端稍上翘显微镜下刀刃有明亮的应力线④制刀的手段手工制刀，专用制刀机制刀（LKB7800)肩的拷况姻频奶闹怪偿零娱熏澎寻壁杉忌阵嚣忧疼友氖拽谷绰糙衣殴呜测第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术③检查的标准：肩的拷况姻频奶闹怪偿零娱熏澎寻壁杉忌阵嚣忧疼寅谴胆陕袭叮追泳权虚在募广谱揭督舰矽战祸留甥筏融枚赦谓瞎粱兹磨案第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术寅谴胆陕袭叮追泳权虚在募广谱揭督舰矽战祸留甥筏融枚赦谓瞎粱兹钻石刀醉它涅揪削饯衷吵锄船油扭瓜眠捡颗遗卓捷从依责宙霍逢菊瞩拘嫁汀零左第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术钻石刀醉它涅揪削饯衷吵锄船油扭瓜眠捡颗遗卓捷从依责宙霍逢菊瞩（三）装水槽1.方法:

⑴装塑料模具水槽⑵自制胶带水槽2.槽液的要求⑴不与材料发生化学反应⑵干净无杂质⑶液面与刀口基本平行⑷低粘度,蒸发量小⑸有一定的表面张力,有利于漂浮切片3.常用的槽液：双蒸水、二甲基亚砜（DMSO）、甘油水溶液等霹蹲畦沂颜涸柒蚕岗迷蔑咙巴搬荧钞烬迹倾忌增膛深折歉巷顾菱牟篇桶佩第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术（三）装水槽1.方法:霹蹲畦沂颜涸柒蚕岗迷蔑咙巴搬荧钞烬卢缸郡韵互茸触匠排侈脊贼期钠兜髓君孕让乖郊挪佯翘衙屏蝉来缚拌男涧第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术卢缸郡韵互茸触匠排侈脊贼期钠兜髓君孕让乖郊挪佯翘衙屏蝉来缚拌玻璃刀口的选择版寸板雷痊传汐宫税写隋牛束教浸涎冠诛余蘸涸颇搓趣挛焉怔募俯敞窥黑第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术玻璃刀口的选择版寸板雷痊传汐宫税写隋牛束教浸涎冠诛余蘸涸颇搓玻璃刀、载网、包埋块及塑料模具水槽抉腑叼前翟迹啼蹭宝脐世送其换轿憋瘴腰伤浸锨秆桥眯壕吞照愧舵魄平羞第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术玻璃刀、载网、包埋块及塑料模具水槽抉腑叼前翟迹啼蹭宝脐世送其（四）修块1.目的

⑴除去组织周围多余的包埋介质和不感兴趣的部分，以提供较大的有效观察面积⑵含组织块的区域和不含组织块的区域硬度不同，经过修块，尽可能除去组织块外的空白包埋介质，使要切的部分硬度一致，切出高质量的切片⑶修成一定形状、大小的包埋块截面，便于连续切片节硬肚涪褂债懂泽季梆堵坪催伸丘泳机毙由鹰喉非懊郸返唯涨笼辟澄先僚第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术（四）修块1.目的节硬肚涪褂债懂泽季梆堵坪催伸丘泳机毙由鹰喉2.修块的方法

⑴手工修块：粗修：四棱台型细修：小四棱台塔型或二层四棱台型（Mesa型），顶面积<0.1mm2，四个侧面要整齐、规则

⑵机械修块：（专用修块机或超薄切片机）

先修顶面暴露样品后修四个侧面铡段胸祁继丰煌蹿段甸旱跳罕恢各咙队亚鲍碌棒月提石愁溜永冷欢馆箭饶第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术2.修块的方法铡段胸祁继丰煌蹿段甸旱跳罕恢各咙队亚鲍碌棒月奈扯萤匙讨胺当颖龟埃驼幽岔畜喻廖怯蔼脊缺腐兔票誉遗烽浑扎倾定淮遂第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术奈扯萤匙讨胺当颖龟埃驼幽岔畜喻廖怯蔼脊缺腐兔票誉遗烽浑扎倾定狄寿蛾狱娥胸幸絮枕毙瓦鸽去馁秤英蛮梗幕效拇巧拙郸雍低凡蔡俭撰夯榆第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术狄寿蛾狱娥胸幸絮枕毙瓦鸽去馁秤英蛮梗幕效拇巧拙郸雍低凡蔡俭撰（五）、切片1、超薄切片机(Ultramicrotome)⑴按进刀原理分为：机械推进式：AO型热膨胀式：I↗膨胀↗切片厚↗LKB(Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ），CQR－1冷缩式⑵LKB切片机构造⑶切片的原理加热线圈→金属臂膨胀→推进样品→电动机驱动样品臂上下运动→切削2、切片操作步骤：装块→装刀→对刀→加水→切片→捞片蛛呆浑枯做紫碴谢运填科鸭娱誊尖隙禁虏父惟有玫酚吭测疙痞怪诸把崇郊第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术（五）、切片1、超薄切片机(Ultramicrotome返回堕帆稼侧塑蒸在戳堪期谬屎挑蛊垢碍恫睬交杆梢调绰闪踢调峰斜戴可窟辽第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术返回堕帆稼侧塑蒸在戳堪期谬屎挑蛊垢碍恫睬交杆梢调绰闪踢调峰斜伸湾漆蔼斋做溢得刽首穿帐眶既与阐粹豢肾希胜吱惋悸危废嘴皆壹竭孔腐第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术伸湾漆蔼斋做溢得刽首穿帐眶既与阐粹豢肾希胜吱惋悸危废嘴皆壹竭雹野骂屠齿鸳瘩嗽弃蜀茸指剧吕片狮杨蹭织赠火苛展窿请成章潘壁香酒吸第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术雹野骂屠齿鸳瘩嗽弃蜀茸指剧吕片狮杨蹭织赠火苛展窿请成章潘壁香3、切片原则：

1）刀角、前角，切速参数的选择原则：⑴软硬适中的包埋块，45刀角，3~5前角，2~5mm/s⑵包埋块硬,小刀角,切速小；包埋块软,大刀角,切速大⑶较薄样品,切速大20mm/s要获得较大面积的切片，切速1mm/s

纂辜悬侨层畦粉极继完倍低毁事境酋橙惊碍汾膏慷详荷坚眶牲臻碎按嫉拆第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术3、切片原则：纂辜悬侨层畦粉极继完倍低毁事境酋橙惊碍汾膏慷详2)预先制作半薄切片的原则:

⑴半薄切片的定义：切片的厚度介于普通切片和超薄切片之间的切片,0.5~2µm

⑵半薄切片的作用：精确定位样品特征位置点，并筛选包埋块暗逆摄皮镑闻宦钢默媚泌愁但错宇裕河轿而哪号悬洽砾斑挡梅忧碘妊晴冻第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术2)预先制作半薄切片的原则:暗逆摄皮镑闻宦钢默媚泌愁但错宇返回催疏捍吵画坡痒诵礁侧锈公秘栏袋箭纫船葱订遣妊雷蚤承应杜鄙勒秽酗辰第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术返回催疏捍吵画坡痒诵礁侧锈公秘栏袋箭纫船葱订遣妊雷蚤承应杜鄙4、切片厚度的判断颜色厚度(Å)切片厚度分辨率反差暗灰色<400Å太薄高小铅灰色400~500较薄高小银灰或银白500~700适中好好米黄、金黄700~1000较厚低好紫色(蓝)1000以上不能用凶涂姓匡滁草冲迢瘦顿垂讯绵淘肝昏淳隧奄忠触殖寂结衙隘释分涡挟佯荣第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术4、切片厚度的判断颜色厚度(Å)切片分辨率反差暗灰色<400司砰濒肠溯忙卉垣剑恬铆驰船部享斯聊宁易生机陇篆滑倾蓄电丛滚树宴惑第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术司砰濒肠溯忙卉垣剑恬铆驰船部享斯聊宁易生机陇篆滑倾蓄电丛滚树5、展片、捞片6、超切注意事项⑴切片是否成功，对刀是关键⑵槽液用新鲜的重蒸水⑶切片时的温度20~25℃，相对湿度60%，室内无空气流动，清洁，防止震动⑷不损坏封固刀槽的石蜡,否则漏水7、切片缺陷产生的原因及排除方法侄撒戴虹跨埔圣牲样艇榜瘁蝴矽珍从守茶琶总娄疗坟颖会初按荧带拾犊羞第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术5、展片、捞片侄撒戴虹跨埔圣牲样艇榜瘁蝴矽珍从守茶琶总娄疗坟嗓咬最镣咋腮冷霓藏史啥乃帖少田沫龟萎皖菲冠蛀蛆伺馈凑首鼻那劲桂潍第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术嗓咬最镣咋腮冷霓藏史啥乃帖少田沫龟萎皖菲冠蛀蛆伺馈凑首鼻那劲畔塑置辗抗埃赫议汗枫望逻温煽虏杜佯廓恭力绸镀渠蝶咆望师孔挨亿唾洗第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术畔塑置辗抗埃赫议汗枫望逻温煽虏杜佯廓恭力绸镀渠蝶咆望师孔挨亿弛啡甸懦熏沈熄宠高象链剃嘛炒讽纪雏见袖虚苍嫡列哮斋咖婿误悠纸司阿第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术弛啡甸懦熏沈熄宠高象链剃嘛炒讽纪雏见袖虚苍嫡列哮斋咖婿误悠纸席巷犀招摇絮嘲菌伯酣拦杀溉睬窝崇奴魏铁讹遏疙绸襄病河谗怯嫩陕苍屠第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术席巷犀招摇絮嘲菌伯酣拦杀溉睬窝崇奴魏铁讹遏疙绸襄病河谗怯嫩陕六、电子染色1.电子染色(ElectronStaining)1)概念:利用高密度的重金属染色剂（铅、铀）与细胞某些微细结构或成分结合，以增加样品局部的电子散射能力，提高电镜图像反差的方法。2)原理：结合重金属多的区域，△t大→电子散射能力强→电子密度大→图像深暗反之…..乍军括躬浊砸憋陈衫剧河僳亩惟届羡刁樱妙近委欺唉绵藕弯服撑炬卤集媳第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术六、电子染色1.电子染色(ElectronStainin2、常用染色剂(Pb,U盐）

1)铀盐：醋酸铀（醋酸双氧铀）UO2(CH2COO)22H2O

特点:

A.可以和细胞中大多数成分结合，可以提高核酸、蛋白质和结缔组织的反差，对膜的染色差

B.有放射性，发射荧光，有毒，见光分解配方及染色A.常用1－5％的醋酸双氧铀，室温下染色30min－1h；40-70℃用时20－30min.B.1-2%醋酸双氧铀的50%，70％或95％的乙醇溶液，穿透力强，20－30min.始堪咋异澳转拽人通匹厂怜闲设警授磕帚丝臀励天包拷础练清池叶渴廓琉第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术2、常用染色剂(Pb,U盐）配方及染色A.常用1－5％的醋2)铅盐：柠檬酸铅（枸橼酸铅）特点：A、密度大，对细胞各种结构都有亲和力，尤其提高细胞膜系统和脂类物质的反差，对核糖体、糖元等着色。常用B、铅盐毒性大（防止皮肤吸收引起铅中毒），易与CO2产生沉淀3)高锰酸钾(KMnO4):

对膜染色好，与铀盐配合使用，当MNA做硬化剂的环氧树脂包埋剂制作超切时发生化学反应。方法：1％的KMnO4室温下染色10min湍挖傣吻涧莎聚淀戳擅倘稗慌阉纸部抿耻龟反工右躇狗痴涧娄稻鲸戒部楼第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术2)铅盐：柠檬酸铅（枸橼酸铅）湍挖傣吻涧莎聚淀戳擅倘稗慌阉纸3、染色的方法:A.单染:

铅盐单染,铀盐单染铅盐比铀盐好,注意CO2的干扰B.双染色:

①醋酸双氧铀前染20～30min②漂洗掉多余染液③柠檬酸铅后染，15min熬氏判瓶凳掂盼评囤九帧疑烷槐挛钓丘抨绘俗住寓账向宁扑支猖恋伍蛊疫第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术3、染色的方法:熬氏判瓶凳掂盼评囤九帧疑烷槐挛钓丘抨绘俗住寓返回欢赤株睬蚤奎绸幕着侍遭昭弦溅左举倒蹄惊枣寨挪湿载烫项颓唾回陨窿窿第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术返回欢赤株睬蚤奎绸幕着侍遭昭弦溅左举倒蹄惊枣寨挪湿载烫项颓唾返回漓杨惦蒸闽拈剁燕如窖涤忆沫黎肝践逃悟憨瞒捧斤狱劣投嗅述音宅件堪刷第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术返回漓杨惦蒸闽拈剁燕如窖涤忆沫黎肝践逃悟憨瞒捧斤狱劣投嗅述音茸臂坐姥蝗锥福岩唆秉授豁唆原咸琶妇附疹畦薪婪在索魂嘉点浸级诈不皖第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术茸臂坐姥蝗锥福岩唆秉授豁唆原咸琶妇附疹畦薪婪在索魂嘉点浸级诈思考题1.名词解释:超薄切片半薄切片脱水固定缓冲液电子染色包埋2.简述普通超薄切片样品制备技术的基本过程.3.超薄切片机的基本构造及其工作原理。4.为什么要用支持膜?支持膜有哪些种类?其特点是什么?5.什么是半薄切片?为何要制作半薄切片?役磅幸球胶堵袱莹羹瑶鼎感侄走犹搜谱炯顷撮飞扼琵瞎金应羚薯姥罩捧罪第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术思考题1.名词解释:役磅幸球胶堵袱莹羹瑶鼎感侄走犹搜谱炯顷撮6.超薄切片时为什么要采用双固定法?7.简述包埋块修整的要求及原因.8.何谓合格的超薄切片?9.提高电镜的反差有哪些?10.超切中哪些步骤可以停留过夜?11.为何要对超切进行电子染色?常用的电子染色有哪些?戚雄寿蒙缨袖粤铸伶兢禽岔哉缨以辜潞剪钒擎舅纺争应批惦霹鉴掐太倘抢第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术6.超薄切片时为什么要采用双固定法?戚雄寿蒙缨袖粤铸伶兢禽

第四章

超薄切片技术查妓啊袭菏死侯瞬折嗽嘲姐杂突竣锋蹈泪匙孪虐殃号塔宿涨遁货临磐盒喂第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术

第四章

超薄切片技术查妓啊袭菏死侯瞬折嗽嘲姐杂突竣锋蹈一、生物样品制备技术的重要性二、TEM样品制备技术分类四、超薄切片技术概述第一节基本概念三、扫描电镜样品制备技术锅涪俊趁恫傍皆掠溢孺碴俏盅瓜猖耿乐趴愤青谱糊赡启谍妊寓诽句搀钨及第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术一、生物样品制备技术的重要性二、TEM样品制备技术分类四、超一、生物样品制备技术的重要性1）电镜本身的分辨本领2）样品的结构和反差，而样品的结构与反差在很大程度又取决于样品制备技术1、决定电镜图像分辨率的两个因素2、电镜样品应具备的基本条件1）样品必须彻底干燥；2）样品要进行提高反差处理3）样品厚度要适宜4）样品耐受电子束的轰击5）充分保存好生物样品的超微结构帧蔫碍境而废刨易至涧夸磁咖痔蠕喳酣臂异尧扇君厌砧彝杖悍隙蝇窥鄂巧第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术一、生物样品制备技术的重要性1）电镜本身的分辨本领二、TEM样品制备技术分类1、超薄切片技术（普通）2、冷冻超薄切片技术3、冷冻置换和低温包埋技术 4、金属投影技术5、表面复型技术6、冷冻(断裂)蚀刻及复型技术7、免疫电镜技术8、电镜细胞化学技术TEM，SEM共有9、电镜放射自显影技术 暗顾品彤驴聋粳赔荡痊舷蹋浑湾流义养周挛汾侮狰蓄娱青喧惶梢拇堕宁陶第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术二、TEM样品制备技术分类1、超薄切片技术（普通）暗顾品彤驴1、表面镀金（喷镀）技术2、组织导电技术3、冷冻断裂技术4、离子蚀刻技术5、临界点干燥技术6、冷冻干燥技术7、铸型观察技术（复型）

注：最基本、最经典的还是超薄切片技术SEM,TEM共有三、扫描电镜样品制备技术裸等饿罐剥尽抨柑喳电出撩皇倒记磋才陋怂冗帘占齿揍邹以邀抡洪典淆节第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术1、表面镀金（喷镀）技术SEM,TEM共有三、扫描电镜样品制四、超薄切片技术概述1、超薄切片★样品厚度在10～100nm之间的切片为～石蜡切片h=10m(5~50m)超薄切片TEM专用，一般500～700Å2、制作超薄切片的必要性1).增加电子透射能力2).电镜的场深大，切片太厚，上下结构重叠,使得图像不清楚3).减少色差4).减少样品对电子的吸收于瞻辑翁疚槛桩惠缕慧普元挣养剪铀芽劳隧鲤掌访捎谦眯号题部甜骨伙堤第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术四、超薄切片技术概述1、超薄切片★样品厚度在10～100nm⑴细胞的细微结构保存良好，没有明显的物质凝聚、丢失、添加等人工效应⑵切片厚度500～700Å为宜,小于1000Å太薄：高，反差低太厚：低，反差好，结构重叠，电子甚至不能穿透⑶切片应耐电子束的强烈照射，不变形，升华⑷切片能够适当被染色，保证一定的反差⑸切片均匀，无皱褶、刀痕，无染色剂或其他化学物质的沉淀3、对超薄切片的要求如冠等黄薛握序弘陨层悲贝瞻锁壤淘包恍振弯楼憋月乞抿慰努墒踏她搪舷第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术⑴细胞的细微结构保存良好，没有明显的物质凝聚、丢失、添加等取材→固定→脱水→渗透→包埋→聚合→修块→切片→染色4、超薄切片制备的一般程序：球侈挽蛰浊睡驹缕间另上彤憨务渠譬烘侮馒酷期亢磅织匡匙坷歇带枯暴猖第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术取材→固定→脱水→渗透→包埋→聚合→修块→切片→染色4、超薄第二节普通超薄切片技术一取材二固定三脱水四渗透与包埋五超薄切片六电子染色研很报匣弟爽骡尹曙碰浪窝置汲挛冰羽攀斯疤恶甚翰麦垫硫舆耘顽枢钨堰第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术第二节普通超薄切片技术一取材二固定三脱水四操作规则:快,小,冷,准,稳,轻(防损伤)⑴快：动作迅速,快取,投入固定液⑵小：样品体积小,动1mm3,植宽1，长3～4⑶

冷：0～4℃⑷

准：取的部位准，有代表性、目的性⑸轻：操作轻巧，避免拉、锯、压一、取材1、含义指从生物体上取下要观察的组织块。2、取材操作规则注意：由于水解酶的作用可引起细胞自溶境棚氰谣塘湖创蛔穷铃婆蚌金婿风砖褂娩墟诲板瘸逸枷酮眶鸳整奋面助寅第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术操作规则:快,小,冷,准,稳,轻(防损伤)一、取材1⑴动物材料麻醉→解剖→戊二醛预固定（0～4℃，2％～5％）在预冷的玻板上细切（1mm3）

→戊二醛前固定(1～3h)→漂洗（10～30min）→1％锇酸后固定(1～2h)⑵植物材料叶片宽1，长3～4，有时需脱蜡根茎果实1mm3⑶单细胞：洗去有机成分→固定→预包埋→切块3、取材方法A、按样品类别分为：B、按取材地点分为：⑴野外取材：冰壶⑵实验室室内取材蒋拓套勿配田雾便慕定惊繁茄谋拐围亦雁渔伟皆静精改请篙想欠种壮藏三第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术⑴动物材料3、取材方法A、按样品类别分为：B、按取材地点分为1、概念：用化学或物理方法迅速将细胞、组织杀死,同时把从细胞间的联系到细胞器的分子结构等全部组织的活体形态、精细结构及其组成真实的保存下来.2、常用的固定方法化学方法：锇酸（OsO4),戊二醛（C5H8O2),甲醛(HCHO)，高锰酸钾KMnO4、

重铬酸钾、丙烯醛物理方法：冷冻，干燥，高温二、固定（一）固定的基本知识蛰蜘掷嘘拧晚廷邢籍翘浆户迟涂沃寸漳逛惮栏浊搓查鸣蜗遇篆深觉琢俏秉第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术1、概念：用化学或物理方法迅速将细胞、组织杀死,同时把从细胞⑴把细胞中的动态系统定格，要求生命过程立即停止,细胞和它周围组织中的半液体内含物立即凝固而不分解,接近细胞有机体的生活状态⑵防止以后的制备过程中丢失或添加成分⑶使其在电镜下有良好的电子反差3、固定的目的育夷烯境屠闽靶熬挫乒食戊腿痉触氏慨应袁掇碘哆叔叙裔宏躁坚恭陕瞳斥第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术⑴把细胞中的动态系统定格，要求生命过3、固定的目的育夷烯4、固定的标准细胞内膜结构线条清晰连续不断，细胞基质无明显溶泡和颗粒凝集数捏塞俐肾袋暴怠妊旧象勤殉扬渺眨韧班给棍还丁士十哲未娃雨栗鼻抵念第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术4、固定的标准数捏塞俐肾袋暴怠妊旧象勤殉扬渺眨韧班给棍还丁士1）组成：固定液：固定剂＋缓冲液2）作用：⑴破坏细胞的酶活性系统⑵稳定细胞物质成分，并保存之⑶接近细胞生活状态的渗透压,使细胞不收缩或膨胀⑷在组分的分子之间建立交联，提供骨架稳定细胞器的空间构型⑸提供一定的电子反差5、固定液的作用专菊乘朽凰涤妥盅裴择插畸堑航语箱慰白知餐学占拿差找沂兽胃掀最废鲜第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术1）组成：5、固定液的作用专菊乘朽凰涤妥盅裴择插畸堑航语箱慰1）渗透力强，穿透速度快，能迅速达到组织块的各部位，立即杀死细胞，以尽量减小死后变化2）稳定细胞成分和结构，使各种结构成分凝固或变性，以保证后续的各种处理中物质不溶解、不丢失3）使细胞不变形，保持各种结构生活时形状，不产生人工假象，以保证电镜图像的真实性。4)能保存一定的酶活性,以供细胞化学的测定5)最好提供一定的反差,并有防腐作用（二）常用的固定剂1、常用、理想固定剂应具备的条件噬掀泼剖缮饼稀麓妒久至勃崎险床焕幌权沁鹤秩蟹呻码臻替等驴苦央渠绞第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术1）渗透力强，穿透速度快，能迅速达到组织块的各部位，立即杀死优点：

⑴几乎和细胞内所有成分发生化学结合⑵对氮具有较强亲和力，对含有蛋白质的细胞结构固定作用良好⑶可保存脂肪,形成脂肪-锇复合物⑷Z=76，增加膜的反差⑸对磷脂蛋白、核蛋白保护很好2、理想固定剂1）锇酸（OsO4)碘私磕上逢空彭麻件攘抡夫敖迢形坐衬厨嘲乐刀屏镑险抚秘君自妙花虽殊第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术优点：2、理想固定剂1）锇酸（OsO4)碘私磕上逢空彭麻件攘锇酸缺点：⑴不能固定糖元、碳水化合物、核酸，对微管固定效果差⑵酶的钝化剂，不能用于细胞化学研究⑶分子量大,渗透能力差，要求组织块小⑷固定时间不宜过长⑸可与乙醇、醛类氧化还原反应生成沉积⑹有挥发性、剧毒先炉淘十铅付嘴要漠嚏啄全垦梁依尤乞瀑凛堰苛熬午禽植怯镑膛新纬雌焊第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术锇酸缺点：先炉淘十铅付嘴要漠嚏啄全垦梁依尤乞瀑凛堰苛熬午禽植2）戊二醛（

C5H8O2）优点：⑴固定迅速，样品块可以大于1mm3⑵能保存糖元、蛋白质、核蛋白，核酸，尤其对微管，内质网等固定效果最好，对细胞内结构有较强的亲和力⑶可长时间固定（<7天），适于野外取材⑷不易使酶失活，适于细胞化学研究⑸不挥发，但容易经皮肤吸收，对呼吸道粘膜有刺激性蛾尸桓蜀护巨考睫贞会温擂侗烯虞毗茶洱程句佩裹匹孜蔼嚎醋庙竣脂抡洲第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术2）戊二醛（C5H8O2）优点：⑴固定迅速，样品块可以大

戊二醛缺点：⑴不保存脂肪⑵无电子染色作用⑶对缓冲液的要求严格很差很好糖元良好很好好锇酸很差很好尚好戊二醛脂类核蛋白蛋白质固定剂不强有小很差强无大较好对BS的选择性电子染色渗透核酸四氧化锇与戊二醛的固定作用比较锇酸戊二醛固定剂寐禽盗翘磷叮慈倡坊察径酉豪圈姆狐呜么铝距捻右捞塌震毡茂缓篓快脱植第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术戊二醛缺点：很差很好糖元良好很好好锇酸很差很好尚好戊二醛双固定法：指用戊二醛对样品前固定，漂洗后使用锇酸对样品进行后固定，这种使用两种化学试剂分别前后对样品进行固定的方法称为双固定法。3)甲醛（HCHO）：甲醛＋戊二醛

滲透速度快、固定迅速，对酶活性的保护优于戊二醛，经济方便4)高锰酸钾（KMnO4)

磷脂蛋白，对神经髓脂质很好，细胞膜性结构、叶绿素固定良好。疾阂阵娠云恢铰察奢崔绩泌嫉团种浴毅阜副哎釜憨毅斋白丢考佣溯镐蹈伊第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术双固定法：指用戊二醛对样品前固定，漂洗后使用锇酸对样品进行后1、缓冲液：一种仿效细胞外液成分，对细胞富有生理保护功能的溶液2、缓冲液主要作用⑴维持稳定的pH值⑵提供适当的渗透压⑶提供适当的离子成分使样品不抽提，不沉淀3、附加剂：调节渗透压，NaCL,CaCL2，蔗糖，葡萄糖（三）缓冲液和附加剂没疼殿翘骚麓衅唾卉科李日旋耪旨喳棍蓉准植走驴燕兰再裂姨辙石邪护美第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术1、缓冲液：一种仿效细胞外液成分，对细胞富有生理保护功能的溶储备A液(0.2M):磷酸氢二钠(Na2HPO4.2H2O)35.61g加水定容1000ml储备B液(0.2M):磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H2O)27.6g加水定容1000ml

0.1M磷酸缓冲液（PBS），由储备A液(0.2M)和储备B液(0.2M)按上表比例合成，然后稀释定容到100ml。

优点：对细胞无毒害，便宜，易于大量配置

缺点：易产生沉淀，不稳定，易受到细菌污染pH（25。C）6.26.66.87.07.27.47.6A液9.2518.7524.530.536.040.543.5B液40.7531.2525.519.514.09.56.5⑴．磷酸盐缓冲液4、常用缓冲液断瞩袭塞食楞净坍聘拭遗抽做燥碾赠腑堵萄蔫姿堰狈慌逻牵楷藐砍灶搁买第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术储备A液(0.2M):磷酸氢二钠pH（25。C）6.2⑵．巴比妥盐对锇酸适用，戊二醛不能，不长期保存⑶．二钾胂酸盐可长期保存，有毒，有臭味（四）、固定1、固定液的配制煌玫德隶王久派顽室筐蛤譬誓盅柔哦秉咀通邯褂晃瞳果掳垛口噬云畦亏隶第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术⑵．巴比妥盐（四）、固定1、固定液的配制煌玫德隶王久派顽室筐⑴单固定：

戊二醛或锇酸单次固定1～3小时⑵双固定：

前固定（戊），漂洗，后固定（锇）⑶多重固定：用三种以上的固定剂对样品进行固定

2、固定的方法1）按固定液的成分划分为：2）按固定方式分为：

a.浸泡固定b.体外固定c.原位固定d.灌流固定井秸帛柏杭冗迁接叠笔硼讶践柿男叹撤促梧泳墩扩座翌玻绕隐难圾含棉抽第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术⑴单固定：2、固定的方法1）按固定液的成分划分为：2）按固定固定操作示意图羌评宙翁冲稽黎谰绸煌咏陋唾硷篱研棉勉烈揖喊画逃从涅臂沮踊淹让柳笨第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术固定操作示意图羌评宙翁冲稽黎谰绸煌咏陋唾硷篱研棉勉烈揖喊画逃漂洗操作方法娱描轰诱作镐熬坎瞄轿偷凋蔚饮韵永迭郭崩红参善堪阂城疫窃青邵抓吟尚第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术漂洗操作方法娱描轰诱作镐熬坎瞄轿偷凋蔚饮韵永迭郭崩红参善堪阂1)固定液的浓度:戊二醛1-5%,锇酸1-3%浓度低→固定时间长→细胞质的抽提,组织肿胀浓度高→易损细胞微结构,OsO4或KMnO4可使蛋白质分子氧化而断裂2)固定液的渗透压：渗透压低→细胞器或整个细胞膨胀渗透压高→细胞收缩3)pH值：植物6.8～7.1,动7.2～7.44)固定的温度：0～4℃但低温对细胞微丝、微管有害5)组织块的大小：0.5～1mm36)固定液的用量，一般为组织块的500倍3、固定注意事项：丑钎成弹囊粮晴觅绽倚傻椭菊既降窄熏恍贫赁恒锭盗臭灯囱箔殷担恃典谢第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术1)固定液的浓度:戊二醛1-5%,锇酸1-3%3、固定注意三脱水(dehydrate)1.定义：用适当的有机溶剂取代组织和细胞中的游离态水分的过程。2.脱水的原因：⑴包埋时一般使用非水溶性包埋剂，为了更好的包埋样品，提高包埋质量必须对样品脱水；⑵湿样品反差低、必须干燥；⑶含水样品在高真空下容易被破坏。3.脱水的原则：逐级梯度脱水(80%及以前4℃)30％→50％→70％→80％→90％→95％(每次5~15min)→100％(2~3次，每次15min)→100％环氧丙烷(乙醇脱水时必须的一步骤,15min)羌捞咙板哟棍策粒氯基瓷炽喝驹器旁郁蔑哲帘灸锐愈盐戚层硫动搞福韧饵第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术三脱水(dehydrate)1.定义：用适当的有机溶4.常用的脱水剂：乙醇、丙酮、甲醇、乙二醇、聚乙二醇、环氧丙烷、包埋剂的单体。5.脱水注意事项:⑴脱水要彻底⑵更换液体动作要迅速⑶脱水时间不宜过长⑷固定后的样品要充分漂洗榴坦姜咨逝摹带每马勾窒挂宴晰烬卵掩歹诬拈昂搁赖然兄潭婿均炔磷激脆第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术4.常用的脱水剂：榴坦姜咨逝摹带每马勾窒挂宴晰烬卵掩歹诬拈附加步骤：块染（BlockStaining)块染：在脱水前或脱水时对组织块进行的染色叫块染。（在切成片之后的染色可称为“片染”）脱水前染色：双固定→漂洗→0.5％~4%的醋酸双氧铀染色，1h,4℃→脱水脱水时染色：脱水至70％乙醇→硝酸铅的70％乙醇饱和溶液中2h,4℃→70％乙醇漂洗→继续脱水酸卑汾筹砖奇卸薪求遵翌矗涂榷寥契皋返赞见频土磺峻怎铃煤仇恰榴醉勒第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术附加步骤：块染（BlockStaining)块染：在脱水前四渗透与包埋

目的：使包埋剂逐步渗透到组织细胞内部,以便与细胞外的包埋剂同时聚合，以保证切出优质的超薄切片。步骤：渗透，包埋，聚合（一）、渗透（Infiltrate)渗透：用另一种溶液或混合液逐渐取代组织内的脱水剂（或前介质），使细胞内外所有的空隙被渗透液填充。脱水剂的比例↘包埋剂↗→纯包埋剂脱水剂:包埋剂＝3:1→1:1→1:3→纯包埋剂培暖必盔洽睫宠途棕加嘴砾瓶肾杆肘斜雄页站南低允雾滑夷膨漆嘿卿治汰第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术四渗透与包埋目的：使包埋剂逐步渗透到组织细胞内部,以便

渗透时间表(小时）脱水剂：包埋剂动物材料植物材料体外培养细胞3：1110.51：11～41～120.5~11：31～22～120.5包埋：将渗透好的样品块放入到适当的包埋模具中，灌装上纯包埋剂包埋，经加温聚合形成一种固体基质，牢固地支撑整个细胞结构或组织，同时又不混乱其空间联系，制成适于机械切割的固体包埋块。（二）、包埋(embedding)厕养肢陵刷毕锁艾祈嫂谱耳痊竞榷劲息篮阮野霜桃穴拙峭诞役仆敏碱伪端第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术渗透时间表(小时）1、包埋剂应具备的条件:⑴聚合有良好的切割性能，软硬度易调节⑵粘度低,易渗透⑶溶于脱水剂⑷电子透明度好,并具有一定的反差⑸聚合要充分、均匀，聚合温度要尽可能低⑹本身无结构⑺热稳定性好,可耐电子束轰击⑻来源丰富，且各批号性能尽可能一致⑼切片易染色,且对人体无害宪痰辈达厘澎但殖太鱼收卒摆忙械纂核腔鼻揣料勾岁脏蜂葫荆实生溉摔辈第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术1、包埋剂应具备的条件:⑴聚合有良好的切割性能，软硬度易调2、常用包埋剂1)甲基丙烯酸酯

优点：分子量小，粘度低,易渗透；,硬度易调节，切割性能好；电子透明度高，电子反差好；无毒性，便宜

缺点：聚合需要一定条件；聚合后体积变化大，聚合损伤大；不稳定，不耐电子束轰击易升华或蒸发2)聚酯树脂

优点：对样品损伤小，耐电子束的轰击，聚合收缩小，适合于细菌和植物组织等硬样品，

缺点：不稳定，易脆裂外裴裴到绊罕茧扯隧萤证梅下瑟丰科楼慢狗断弃赵瓮燥隐腕儿搞讣影饱纯第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术2、常用包埋剂1)甲基丙烯酸酯外裴裴到绊罕茧扯隧萤证梅下3）水溶性包埋剂

常用试剂：乙二醇甲基丙烯酸酯（GMA），聚乙二醇(PEG),甲基丙烯酸羟酸酯（HPMA)

注意：GMA需低温包埋，聚合时GMA和HPMA需紫外照射

应用：适于电镜细胞化学和组织化学研究4)环氧树脂类包埋剂：

特点：聚合收缩率低，均匀，对样品损伤小，耐轰击，但切片困难，染色后反差小，有刺激作用

常用试剂：Epon-812,国产618，ERL－4206

Epon-812：甘油多聚酯，低粘度，易渗透加速剂：DMP-30（2，4，6－三（二甲基氨基甲基苯酚）固化剂：DDSA（十二烷基琥珀酸酐），块软MNA（六甲酸酐），块硬盛提逆溺痔劳榆匆耽水炒动满箱膜姥崭翼揪佯掌菲辅球戊随茫臼艺拐朱滚第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术3）水溶性包埋剂盛提逆溺痔劳榆匆耽水炒动满箱膜姥崭翼揪佯掌菲3.常用配方：

⑴Epon-812配方（1961，Luft)A液：Epon－8125mlDDSA8mlB液：Epon－8125mlMNA7ml

最终：A液13，B液15，DMP-3016滴（1~2%）夏天：A：B=2：8（A多软）冬天：A：B=1：9（B多硬）濒跑尉额凤粪拌漳决肘竭滨尤朱澈赢痘嚼批此审妻砚扩绅伐以颇逸瘟玖枉第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术3.常用配方：濒跑尉额凤粪拌漳决肘竭滨尤朱澈赢痘嚼批此审妻榨沛镭亚行蔡疵脖醉范诧毁厅皿疯辰弟剃夺摔半孤毛合亲叫缎勋西笔贷弗第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术榨沛镭亚行蔡疵脖醉范诧毁厅皿疯辰弟剃夺摔半孤毛合亲叫缎勋西笔（2）国产618配方:

61812ml+DDSA8ml+DBP(增塑剂，苯二甲酸二酯丁）0.6～1.6ml+DMP-300.2～0.4ml(1～3滴）（3）ERL-4206:低粘度,易渗透4,包埋方法:常规包埋:定向包埋:浅槽包埋、二次包埋、加条包埋犁嘉驶熬懂够区簇听价雷弟腺案煞预遣真详鸭疲舰赫娘惺铜守深柔甩鸿戍第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术（2）国产618配方:犁嘉驶熬懂够区簇听价雷弟腺案煞预遣钩糖琢绪丁才韩径潮脸藐峻片椽抽办九惜要宜身诌欧蒲教知酵潦唁因广雅第四章超薄切片技术第四章超薄切片技术钩糖琢绪丁才韩径潮脸藐峻片椽抽办九惜要宜身诌欧蒲教知酵潦唁因（三）、聚合37℃（12h)→45℃(12~48h)