参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γgcs活性及表达的影响

引言境污染、药物治疗[支气管舒张剂〔β2冲动剂、抗胆碱药及甲基黄嘌呤类〕，抗菌药，糖皮质激素，祛痰药，抗氧化剂，免疫调节剂，疫苗，中医药等]、外科治疗、氧疗、康复治疗。住院期间加用机械通气疗法[6]。COPD多属中医咳嗽、喘证、肺胀的范畴，目前普遍认为其为本虚标实性疾病，本虚属肺脾肾虚，标实乃风〔寒〕热痰夹瘀[7]。COPD的治疗，应根据标本缓急的不同，在发作期急那么治其标，以清热、化痰、化瘀等为法；在缓解期，那么应以补益肺肾之法图其本[9]。导师从COPD的中医“本虚标实〞病机〔本虚为肺肾两虚，标实为血瘀〕出发，采用西洋参、三七、冬虫夏草等药组成参七虫草胶囊，该药具有益气养阴、活血化瘀、益肺固肾之成效，与COPD肺肾亏虚、血瘀内存的“虚瘀〞机制相符合。在临床观察中发现该药可提高COPD患者的免疫功能；能显著地减少COPD患者的下呼吸道急性感染次数、发病持续时间及抗生素的应用时间；长期应用参七虫草胶囊对减缓COPD患者的肺功能下降有一定的作用[10]。动物实验结果说明其能调节干扰素-γ〔IFN-γ〕、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-4(IL-4)、白介素-10(IL-10)等炎症因子，从而抑制气道的慢性炎症及气道壁结构的重塑，到达治疗作用[11][12]。本课题为国家自然科学基金工程?参七虫草胶囊逆转慢阻模型气道重塑的机理研究?〔30472216〕的一局部，给予COPD大鼠模型参七虫草胶囊干预，以金水宝胶囊作对照，测定血清GSH、活性氧〔ROS〕、总抗氧化能力〔T-AOC〕及γ-GCS的水平，检测肺组织中γ-GCS表达水平。通过对参七虫草胶囊对COPD大鼠模型γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶〔γ-GCS〕活性与表达的影响的研究来探讨其对COPD干预作用的机制。6参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ-GCS活性及表达的影响实验一参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型肺组织形态学及肺功能的影响1.1材料动物的选择与分组3月龄清洁级健康Wistar雄性大鼠50只，体重在200±20g之间，实验动物由郑州大学实验动物中心提供。随机分为5组，每组10只，即空白对照组，COPD模型组，金水宝胶囊组，参七虫草胶囊低剂量组，参七虫草胶囊高剂量组。饲养环境动物饲养室为清洁级，室温控制在22±2℃，相对湿度为60﹪-80﹪，自然光线采光，清洁级饲料。适应性饲养7天后开始实验。主要试剂与药品香烟：香梅牌，烤烟型，焦油量14mg，烟气烟碱量11mg，由安徽中烟公司出产；脂多糖〔LPS〕来自HUALVYUANBIOTECHNOLOGY，批号为050730；注射用生理盐水：上海第一生化药业出品，批号为050210；实验药物参七虫草胶囊〔每粒0.4g〕：安徽中医学院第一附属医院药剂科提供，由西洋参、参三七、冬虫夏草等药物组成，采用水提醇沉法，制成胶囊。批号为20050520；金水宝胶囊〔每粒0.33g〕：主要成份为发酵虫草菌粉，江西金水宝制药有限公司出品，批号为050313。主要仪器与设备徕卡2135型石蜡切片机OLIMPUSBX-51型显微镜OLIMPUSDP-70显微照相设备JSM—T300型扫描电镜ZeissEM10C型透射电镜小动物呼吸机动物体描箱

7

〔德国徕卡公司〕〔日本OLIMPUS光学工业株氏社〕〔日本OLIMPUS光学工业株氏社〕〔省立医院病理科〕〔省立医院病理科〕〔北京贝兰博科技〕〔北京贝兰博科技〕实验一参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型肺组织形态学及肺功能的影响信号放大系统USB接口高速数据采集卡AniRes2003软件分析系统负压系统计算机小动物熏烟箱80cm*60cm*50cm

〔北京贝兰博科技〕〔北京贝兰博科技〕〔北京贝兰博科技〕〔北京贝兰博科技〕〔惠普电脑〕〔安徽省中医院〕1.2实验方法造模方法第1、14天气管内滴入脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)，第2-13天、15-60天那么每天熏香烟0.5h〕[13][14]。气管内滴入脂多糖法：上午九点大鼠空腹状态下，以20﹪的乌拉坦〔剂量为1ml/100g〕腹腔注射麻醉大鼠后，将其头部后仰，颈背部用纱布垫垫起并固定于鼠板上。修剪颈前部皮肤，碘酒酒精消毒。5号静脉注射套管针与皮肤成45度角斜行穿刺入气管，待有突空感并回抽出空气后，用1ml注射器抽取溶于生理盐水的LPS0.2ml〔浓度为1mg/1ml〕，注入药液。随后将鼠板竖起，左右旋转使LPS药液尽可能均匀地分布于两肺。穿刺点再次碘酒酒精消毒。熏香烟法：每日上午九时将大鼠置入自制的有机玻璃熏烟箱内〔大小为80cm×60cm×50cm，箱顶有一直径为1.2cm的通气孔〕，于箱内点燃10支香烟〔香梅牌，烤烟型，焦油量14mg，烟气烟碱量11mg，由安徽中烟公司出产〕，30分钟后将大鼠取出。每日一次。给药方法空白对照组：在模型组大鼠气管内滴入脂多糖的同时，按同样的方法气管内注入生理盐水，其余时间置于无烟环境中正常饲养至实验结束。慢阻肺模型组：生理盐水灌胃4周，4周后复制慢阻肺模型〔造模第1、14天气管内滴入LPS，第2-13天、15-60天那么每天熏香烟0.5h〕。造模期间继续生理盐水灌胃。参七虫草胶囊高剂量组：参七虫草胶囊〔0.5g／kg／d，相当于成人用量的l0倍〕灌胃4周，4周后复制慢阻肺模型〔造模第1、14天气管内滴入LPS，第2-138参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ-GCS活性及表达的影响天、15-60天那么每天熏香烟0.5h〕。造模期间继续药物灌胃。参七虫草胶囊低剂量组：参七虫草胶囊〔0.25g／kg／d，相当于成人用量的5倍〕灌胃4周，4周后复制慢阻肺模型〔造模第1、14天气管内滴入LPS，第2-13天、15-60天那么每天熏香烟0.5h〕。造模期间继续药物灌胃。金水宝胶囊组：金水宝胶囊(0.5g／kg／d，相当于成人用量的10倍)灌胃4周，4周后复制慢阻肺模型〔造模第1、14天气管内滴入LPS，第2-13天、15-60天那么每天熏香烟0.5h〕。造模期间继续药物灌胃。取材、组织固定方法大鼠处死后翻开胸腔，将右主支气管连同右肺剪下，右肺下叶置入含1/1000DEPC的4℅多聚甲醛溶液固定〔用于原位杂交〕，余肺组织置入10℅的甲醛溶液中固定。肺功能测定方法小动物肺功能仪由动物体描箱、信号放大系统、USB接口高速数据采集卡、AniRes2003软件分析系统、计算机、动物呼吸机、负压系统组成。将大鼠用3.3％的水合氯醛〔10ml/kg体重〕腹腔麻醉后，仰卧位置于小动物肺功能仪的体描箱内，行颈部正中气管切开，插入气管插管，气管插管一端与动物呼吸机相连。先描记一端平静呼吸，然后测用力肺活量〔FVC〕。FVC的测量自动进行，先由动物呼吸机向实验动物输入所设定的FVC气量〔通常为潮气量的4-6倍〕来模拟用力吸气，后由负压系统〔-25cmH2o〕抽气来模拟用力呼气的过程。动物呼吸时，胸廓的扩张与收缩改变了体描箱内的气体容积，容积的变化引起压力的改变。通过测量体描箱内气体压力的变化，间接获取肺容积的变化，经计算机处理后得到所需肺功能的各项指标。1.3观察指标形态学观察：肺组织形态大体观察:肉眼观察大鼠肺脏的大小、形态、色泽、质地、弹性等情况。肺组织形态光镜观察:肺脏在1.96kPa压力下以l00ml／L中性福尔马林灌注固定72小时，按规定部位各取组织7块，常规制片，HE染色。在光镜下观察肺组9实验一参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型肺组织形态学及肺功能的影响织形态学的变化并摄片。肺组织形态电镜观察:取气管组织，经25ml／L戊二醛固定，逐级乙醇脱水，JSM—T300型扫描电镜观察并摄片；取肺组织3小块，25ml／L戊二醛固定，逐级乙醇脱水，Epon8l2包埋，超薄切片用ZeissEM10C型透射电镜观察并摄片。肺功能的观察最大通气量〔MVV〕、用力肺活量〔FVC〕、第0.3秒用力呼气容积与用力呼气容积的百分比〔FEV0.3/FVC〕、最大呼气中段流量〔MMF〕、峰值呼气流量〔PEF〕、用力中期呼气流速〔FEF25-75〕。其中FEV0.3、FEV0.3/FVC用来代替FEV1、FEV1/FVC，两者表达的意义相近[15]。1.4统计方法__使用EXCEL软件统计，所有数据均以均数±标准差〔X±S〕来表示，样本均数间的两两比拟采用t检验。1.5结果形态学观察肺组织形态大体观察结果：空白对照组大鼠两肺正常大小，呈粉红色或紫红色，质地韧，弹性好。模型组大鼠两肺体积增大，外表苍白不平，可见多处棕褐色斑，边缘变钝，质地软，弹性差。肺组织形态光镜观察：〔参见附图一〕对照组大鼠支气管粘膜纤毛柱状上皮细胞排列整齐，只有少量杯状细胞，粘膜下层及固有层细胞数较少，气道腔、管壁及周围未见充血和炎性细胞浸润；各级细支气管壁粘膜上皮完整，管腔内几乎无细胞，周围血管壁未见炎性细胞浸润，肺泡壁完整，肺泡正常大小。模型组大鼠支气管粘膜纤毛上皮排列紊乱、局部脱落，其间杯状细胞大量增生，管壁各层均有较多炎性细胞浸润，道腔内亦有大量炎细胞聚集；终末细支气管粘膜上皮排列紊乱、水肿变性，管腔内有大量炎性细胞和分泌物，血管壁周围有较多炎性细胞浸润；肺泡结构紊乱肺泡壁变薄、断裂，肺泡腔扩大融合，局部融合成肺大疱，肺气肿形成。10参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ-GCS活性及表达的影响参七虫草胶囊高、低剂量组与金水宝胶囊组光镜下肺组织形态学改变介于对照组与模型组大鼠之间。肺组织形态电镜观察：〔参见附图二〕对照组大鼠支气管纤毛柱状上皮细胞胞浆未见肿胀，大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞未见增生，板层小体未见排空。上皮纤毛排列整齐。模型组支气管纤毛柱状上皮细胞胞浆肿胀，呈“大泡样〞向腔面突起，纤毛减少、变短，局部纤毛脱落；肺泡Ⅱ型细胞明显变性，结构不清，线粒体明显肿胀变性，嵴突破坏甚至消失，板层小体明显减少，细胞膜破坏。参七虫草胶囊高、低剂量组与金水宝胶囊组那么介于对照组与模型组大鼠之间。肺功能测定结果模型组大鼠FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、FEF25-75、MMF、PEF、MVV值均较空白对照组降低，差异有显著性。参七虫草胶囊高、低剂量组与金水宝胶囊组分别与模型组比拟，FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、FEF25-75、MMF、PEF、MVV值均有改善，差异有显著性。参七虫草胶囊高、低剂量组与金水宝胶囊组比拟，FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC差异无显著性，PEF、MVV差异有显著性。参七虫草胶囊高、低剂量组之间比拟，FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、FEF25-75、MMF、PEF、MVV值差异无显著性。表1

__参七虫草胶囊对大鼠肺功能的影响〔X±s〕Tab1TheeffectofSHENQICHONGCAOcapsuleonthelungfunctioninrats__〔X±s〕分组

例数

FVC〔ml〕

FEV0.3〔ml〕

FEV0.3/FVC(℅)

FEF25-75(ml/s)

MMF(ml/s)

PEF(ml/s)

MVV(ml/min)空白组

8

5.53±0.98

5.00±0.86

96.52±2.68

25.08±3.33

26.07±2.90

30.8±2.4

311.2±79.11模型组

8

88.68±2.61

21.12±3.21

21.75±2.97

金水宝组8

5.55±0.965.21±0.8895.05±2.4926.28±3.8326.66±2.931.46±2.6306.58±64.6低参七组84.92±1.15.06±0.8592.5±2.726.29±3.6127.56±3.0627.66±2.1

215.2±62.64高参七组85.24±0.675.14±0.6797.52±2.4824.41±3.94

24.8±3.4731.2±2.71301.5±55.8注：▲模型组与空白组比拟，P﹤0.01。◆参七虫草胶囊高、低剂量组与金水宝胶囊组分别与模型组比拟，P﹤0.05。113.65±0.923.95±0.8625.073.65±0.923.95±0.8625.07±2.5157.18±62.6实验一参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型肺组织形态学及肺功能的影响★参七虫草胶囊高、低剂量组与金水宝胶囊组比拟，P﹤0.05。30252015105

FVCFEV0.3FEF25-75MMF0

空白组

模型组

金水宝组

低参七组

高参七组图1

参七虫草胶囊对大鼠肺功能的影响-1Fig1TheeffectofSHENQICHONGCAOcapsuleonthelungfunctioninrats-135030025020015010050

FEV0.3/FVCPEFMVV0

空白组

模型组

金水宝组

低参七组

高参七组图2

参七虫草胶囊对大鼠肺功能的影响-2Fig2TheeffectofSHENQICHONGCAOcapsuleonthelungfunctioninrats-212参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ-GCS活性及表达的影响实验二参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ-GCS活性与表达的影响1.1材料实验动物与药物同实验一试剂GSH测定试剂盒，批号：20050830，南京建成生物工程研究所ROS测定试剂盒，批号：20050830，南京建成生物工程研究所T-AOC测定试剂盒，批号：20050830，南京建成生物工程研究所GCS原位杂交检测试剂盒，编号MK2197，批号：050801，武汉博士德生物工程兔抗γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶试剂盒，编号BA1627，批号：050801，武汉博士德生物工程主要仪器及设备721光电比色计80-2型离心机微量移液器BC/BD-210S型低温冷柜电热恒温水箱OLIMPUSBX-51型显微镜OLIMPUSDP-70显微照相设备捷达801形态学图象分析系统1.2方法造模及给药方法同实验一取材方法

13

上海第三分析仪器厂上海手术机械厂上海求精玻璃仪器厂海尔集团上海医用恒温设备厂〔日本OLIMPUS光学工业株氏社〕〔日本OLIMPUS光学工业株氏社〕江苏省捷达科技公司实验二参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ-GCS活性与表达的影响血清取材方法：实验大鼠行肺功能测定后，马上从体描箱内取出，剖腹从腹主动脉中取血4-5ml。所取血液随即离心，留血清置于低温冷柜中备用。肺组织取材方法：大鼠处死后翻开胸腔，将右主支气管连同右肺剪下，右肺下叶置入含1/1000焦碳酸二乙酯〔DEPC〕的4℅多聚甲醛溶液固定〔用于原位杂交〕，余肺组织置入10℅的甲醛溶液中固定〔用于免疫组化及肺组织形态学的观察〕。各观察指标的检测方法血清中γ-GCS活性的测定：γ-GCS活性的测量参考文献中经典方法〔双酶法〕，即在终体积为1ml的反响体系中340nm处观测吸光度值的的变化。通过NAD+形成的速率代表γ-GCS活性〔单位为U〕[16][17]。血清中GSH值的测定：按试剂盒说明操作。〔原理：GSH为组织中主要的非蛋白质的巯基化合物，二硫代二硝基苯甲酸与巯基化合物反响时能产生一种黄色化合物，可进行比色定量测定。〕血清中T-AOC值的测定：按试剂盒说明操作。〔原理：机体中有许多抗氧化物质，能使Fe3+复原成Fe2+，后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物，通过比色可测出其抗氧化能力的上下。〕血清中ROS值的测定：按试剂盒说明操作。原理：Fenton反响是最常见的产-受体后，用gress试剂显色，形成红色物质，其呈色与OH-的多少成正比关系。〕免疫组化法检测肺组织中γ-GCS表达：兔抗γ-GCS是通过与人类、小鼠、大鼠的谷氨酰半胱氨酸合成酶氨基酸序列的氨基端相一致的合成肽对兔免疫而获得的。在免疫组化染色中，它可特异性地定位于GCS上，与人类、兔、小鼠、大鼠的其他成分无交叉反响。步骤：石蜡切片经常规脱蜡至水、抗原修复及兔血清封闭，加γ-GCS抗体(浓度1:150)，生物素标记山羊抗兔IgG，经SABC孵育，经DAB显色，苏木精复染后，脱水封片。以PBS代替抗体作阴性对照。结果判读：胞浆中出现棕黄色为阳性，显微显影系统(日本Olympus公司)采集图像。选择内径100～200um的细支气管、肺泡及炎症细胞区，各随机取3个视14生羟自由基的化学反响，生羟自由基的化学反响，H2O2的量和Fenton反响产生的OH量成正比，当给予电子〔参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ-GCS活性及表达的影响野(×400)，计算机自动测量并计算阳性信号积分A值〔捷达801形态学图象分析系统〕。原位杂交检测肺组织中γ-GCSmRNA的表达：寡核苷酸探针为经地高辛标记的多聚核苷酸探针序列，针对小鼠、大鼠GCS靶基因的mRNA序列为：⑴5’-TGCAC

ATCTA

CCACG

CAGTC

AAGGA

CCGGC-3’；⑵5’-ATATT

CAGTC

CACAA

ACTGG

CAGAC

AATGA-3’；⑶5’-AGTAC

ACGTCCATGA

GCATA

GACAC

CATCA-3’。杂交步骤：⑴.固定后的肺组织常规脱水、浸腊、包埋。切片厚度6-8um。⑵.玻片经多聚赖氨酸处理。⑶.石蜡切片经常规脱蜡至水。3%过氧化氢室温处理10min灭活内源性过氧化物酶。⑷.3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶消化以暴露mRNA核酸片段。⑸.后固定：胃蛋白酶消化用含1‰DEPC的4℅多聚甲醛/0.1M磷酸盐缓冲液〔PBS〕溶液固定。⑹.按每张切片20ul滴加预杂交液预杂交。⑺.按每张切片20ul滴加杂交液杂交，湿盒置于恒温箱内38-42℃过夜。⑻.杂交后SSC液〔1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠8.8g〕洗涤，滴加封闭液封闭。⑼.滴加生物素化鼠抗地高辛，链霉亲和素-生物素复合体(SABC)孵育。⑽.滴加生物素化过氧化物酶，经二氨基联苯胺(DAB)显色、苏木精复染后，酒精脱水、二甲苯透明、封片。以不加探针和以PBS代替探针作阴性对照。结果判读：GCSmRNA的细胞胞浆着色呈棕黄色。显微显影系统采集图像。选择内径100～200um的细支气管、肺泡及炎症细胞区，各随机取3个视野(×400)，计算机自动测量并计算阳性信号积分A值〔捷达801形态学图象分析系统〕。考前须知：⑴及时固定，并在固定液中参加1‰DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。⑵防止过度固定，其对原位杂交有明显的不利影响。⑶由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数，加上基因仅由四个碱基排列组合而成，原位杂交容易出现非特异性染色。可通过阴性对照来判别。1.3观察指标血清中γ-GCS活性；血清中GSH值；血清中T-AOC值；血清中ROS值；肺组织中γ-GCS〔蛋白质〕表达〔免疫组化法〕；肺组织中γ-GCSmRNA〔核酸〕的表达〔原位杂交法〕。15实验二参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ-GCS活性与表达的影响1.4统计方法__使用EXCEL软件统计，所有数据均以均数±标准差〔X±S〕来表示，样本均数间的两两比拟采用t检验。1.5结果模型组大鼠与空白对照组比拟，血清γ-GCS、GSH、T-AOC、ROS值和肺组织γ-GCS〔免疫组化法〕、γ-GCS〔原位杂交法〕阳性信号积分A值升高，差异有显著性。参七虫草胶囊高、低剂量组分别与模型组比拟，血清γ-GCS、GSH、T-AOC值和肺组织γ-GCS〔免疫组化法〕、γ-GCS〔原位杂交法〕阳性信号积分A值升高，差异有显著性；而ROS值差异无显著性。金水宝胶囊组与模型组比拟，血清γ-GCS、GSH值和肺组织γ-GCS〔免疫组化法〕、γ-GCS〔原位杂交法〕阳性信号积分A值升高，差异有显著性；而T-AOC、ROS值差异无显著性。参七虫草胶囊高、低剂量组与金水宝胶囊组比拟，血清γ-GCS、ROS差异无显著性；而血清GSH、T-AOC值和肺组织γ-GCS〔免疫组化法〕、γ-GCS〔原位杂交法〕阳性信号积分A值升高，差异有显著性。参七虫草胶囊高、低剂量组之间比拟，血清γ-GCS、GSH、T-AOC、ROS值和肺组织γ-GCS〔免疫组化法〕、γ-GCS〔原位杂交法〕阳性信号积分A值差异无显著性。肺组织γ-GCS蛋白质〔免疫组化法〕表达图片见附图三肺组织γ-GCSmRNA〔原位杂交法〕表达图片见附图四__表2参七虫草胶囊对大鼠γ-GCS、GSH、T-AOC、ROS活性及表达的影响〔X±s〕Tab2TheeffectofSHENQICHONGCAOcapsuleontheactivityandexpressionofγ-GCS、GSH、T-AOC、ROSinrats分组例数γ-GCSGSHT-AOCROS

γ-GCS

γ-GCS〔U/ml〕〔mg/l〕〔U/ml〕〔U/ml〕〔免疫组化〕〔原位杂交〕空白组

8

2.0±0.2

322.34±49.4

3.25±2.7

757.45±14.54

0.24±0.025

0.317±0.028模型组

8

▲

409.91±54.03

▲

▲

781.51±14.48

▲

0.275±0.021

0.425±0.023金水宝组8

3.4±0.1470.67±44.77

6.01±3.07

791.46±16.66

0.295±0.018

◆

0.455±0.024

◆★

★

791.73±16.80

0.346±0.019

◆★

0.496±0.022

◆★高参七组8

3.5±0.2547.48±45.76

★

11.94±2.9

★

788.50±16.78

0.333±0.026

◆★

0.501±0.021

◆★163.0±0.27.62±3.11低参七组83.4±0.2535.97±46.3914.563.0±0.27.62±3.11低参七组83.4±0.2535.97±46.3914.56±3.08参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ-GCS活性及表达的影响注：▲模型组与空白组比拟，P﹤0.01。◆参七虫草胶囊高、低剂量组与金水宝胶囊组分别与模型组比拟，P﹤0.05。★参七虫草胶囊高、低剂量组与金水宝胶囊组比拟，P﹤0.01。1614121086420

γ-GCST-AOC空白组

模型组

金水宝组

低参七组

高参七组图3

参七虫草胶囊对大鼠γ-GCS、T-AOC的影响Fig3TheeffectofSHENQICHONGCAOcapsuleontheactivityofγ-GCS、T-AOCinrats10008006004002000

GSHROS空白组

模型组

金水宝组

低参七组

高参七组图4

参七虫草胶囊对大鼠GSH、ROS活性的影响Fig4TheeffectofSHENQICHONGCAOcapsuleontheactivityofGSH、ROSinrats0.60.50.40.30.20.10

GCS免GCS原空白组

模型组

金水宝组

低参七组

高参七组图5

参七虫草胶囊对大鼠γ-GCS表达的影响Fig5TheeffectofSHENQICHONGCAOcapsuleontheexpressionofγ-GCSinrats17实验二参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ-GCS活性与表达的影响1.6上述指标相关性的分析大鼠肺功能与γ-GCS活性和表达的相关性分析表3

大鼠肺功能与γ-GCS活性和表达的相关性分析Tab3Therelationshipoflungfunctionandtheactivityandexpressionofγ-GCSinrats血清中γ-GCS值

血清中GSH值

血清中ROS值

血清中T-AOC值

肺中γ-GCS值肺中γ-GCS值〔免疫组化法〕〔原位杂交法〕FVCFev0.30Fev0.3…

r=-0.084r=0.139r=-0.064

r=-0.039r=0.179r=0.251

r=0.06r=0.17r=-0.043

r=0.106r=0.128r=0.095

r=0.034r=0.245r=0.204

r=-0.029r=-0.114r=-0.017FEF25…MMFPEFMVV

r=0.063r=0.007r=-0.02r=-0.036

r=0.081r=0.076r=0.136r=0.049

r=0.404r=0.163r=-0.1r=-0.08

▲

r=0.054r=-0.013r=0.258r=0.242

r=0.153r=0.087★r=0.218

r=0.048r=-0.017r=0.005r=-0.021注：▲P值﹤0.01，FEF25-75与血清中ROS值呈正的中度相关。★P值﹤0.05，PEF与肺中γ-GCS值〔免疫组化法〕呈正的低度相关。大鼠γ-GCS活性和表达之间的相关性分析表4

大鼠γ-GCS活性和表达之间的相关性分析Tab4Therelationshipoftheactivityandexpressionofγ-GCSinrats血清

血清

血清

血清

肺中γ-GCS

肺中γ-GCSγ-GCS

GSH

ROS

T-AOC〔免疫组化法〕原位杂交法〕血清γ-GCS/

★

r=0.635

■

r=0.588

■

r=0.751

★

r=0.896

★血清GSHr=0.796

★

/

r=0.505

■

r=0.619

■

r=0.781

★

r=0.829

★血清ROSr=0.635

■

r=0.505

■

/

r=0.377

▲

r=0.468

■

r=0.564

■血清T-AOCr=0.588

■

r=0.619

■

r=0.377

▲

/

r=0.704

★

r=0.642

■肺中γ-GCS〔免〕r=0.751

★

★

■

r=0.704

★

/

★肺中γ-GCS〔原〕r=0.896

★

r=0.829

★

r=0.564

■

r=0.642

■

r=0.792

★

/注：★P值﹤0.01，各指标之间[血清中γ-GCS值与血清中GSH值、肺中γ-GCS〔免疫组化法〕、肺中γ-GCS〔原位杂交法〕；血清中GSH值与肺中γ-GCS〔免疫组化法〕、肺中γ-GCS〔原位杂交法〕；血清中T-AOC值与肺中γ-GCS〔免疫组化法〕]呈正的重度相关。18r=0.317r=0.796r=0.781r=0.468r=0.792r=0.317r=0.796r=0.781r=0.468r=0.792参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ-GCS活性及表达的影响■P值﹤0.01，各指标之间[血清中γ-GCS值与血清中ROS值、血清中T-AOC值；血清中GSH值与血清中ROS值、血清中T-AOC值；血清中ROS值与肺中γ-GCS〔免疫组化法〕、肺中γ-GCS〔原位杂交法〕；血清中T-AOC值与肺中γ-GCS〔原位杂交法〕]呈正的中度相关。▲P值﹤0.05，血清中T-AOC值与血清中ROS值呈正的低度相关。19附图附图一：光镜图片图6：正常组HE×200Fig6:controlgroup图8：金水宝组HE×200Fig8:JINSHUIBAOcapsulegroup

图7：模型组HE×200Fig7:modelgroup图9：参七胶囊低剂量组HE×200Fig9:SHENQICHONGCAOcapsulelow-dosegroup图10：参七胶囊高剂量组HE×200Fig10:SHENQICHONGCAOcapsulehigh-dosegroup20参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ-GCS活性及表达的影响附图二：电镜图片图11：正常组-1〔EM×10000〕Fig11:controlgroup-1图13：模型组〔EM×6000〕Fig13:modelgroup图15：参七胶囊低剂量组〔EM×8000〕Fig15:SHENQICHONGCAOcapsulelow-dosegroup

21

图12：正常组-2〔EM×8000〕Fig12:modelgroup-2图14：金水宝组〔EM×8000〕Fig14:JINSHUIBAOcapsulegroup图16：参七胶囊高剂量组〔EM×8000〕Fig16:SHENQICHONGCAOcapsulehigh-dosegroup附图附图三：r-GCS的表达〔免疫组化法〕图17：正常组×400Fig17:controlgroup图19：金水宝组×400Fig19:JINSHUIBAOcapsulegroup

图18：模型组×400Fig18:modelgroup图20：参七胶囊低剂量组×400Fig20:SHENQICHONGCAOcapsulelow-dosegroup图21：参七胶囊高剂量组×400Fig21:SHENQICHONGCAOcapsulehigh-dosegroup22参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ-GCS活性及表达的影响附图四：r-GCSmRNA的表达〔原位杂交法〕图22：正常组×400Fig22:controlgroup图24：金水宝组×400Fig24:JINSHUIBAOcapsulegroup

图23：模型组×400Fig23:modelgroup图25：参七胶囊低剂量组×400Fig25:SHENQICHONGCAOcapsulelow-dosegroup图26：参七胶囊高剂量组×400Fig26:SHENQICHONGCAOcapsulehigh-dosegroup23讨论讨

论中华医学会呼吸病学分会制定的?慢性阻塞性肺疾病学组慢性阻塞性肺疾病诊治指南?中将COPD定义为一种具有气流受限特征的疾病，气流受限不完全可逆，呈进行性开展，与肺部对有害气体或有害颗粒的异常炎症反响有关。无气流受限，那么不能诊断为COPD；气流受限具可逆性那么不属于COPD；一些病因或具有特征病理表现的气流受限疾病不属于COPD[6]。本病的治疗目标是：防止疾病进展，减轻患者病症，改善患者运动耐量，改善患者健康状况，防止和治疗并发症，防止和治疗急性加重以及降低病死率[18]。祖国医学无COPD之名。根据COPD的临床表现咳嗽、咳痰、气喘、胸满、紫绀、水肿等，相当于中医学的“肺胀〞或“喘证〞概念。COPD加重期，在西药治疗的同时，加以中医药治疗，疗效明显优裕、于单纯的西药治疗；COPD稳定期，中医药治疗可改善病症，提高免疫功能，减少发作次数。下面就动物模型的选择、参七虫草胶囊的组方依据与成效及实验指标意义展开讨论。1动物模型的选择1.1各种COPD动物实验模型方法2熏吸法将实验组大鼠暴露于250×10-5SO2气体中，5h/d,5d/week，共7周。[19]气道内滴入脂多糖和被动吸烟法自制吸烟染毒箱〔有机玻璃制成，100cm×70cm×70cm大小，上面有1.5cm×1.5cm通气孔〕，染毒箱底用铁丝网隔成吸烟小室〕，模型组大鼠关在染毒箱内，每天点燃烟后被动吸烟20支×3次×1月，每次30分钟，每次间隔3小时。对照组呼吸正常空气。在实验开始第1天和第15天时，两组大鼠均用10℅水合氯醛4ml/kg作腹腔注射麻醉，模型组大鼠气道内缓慢注入0.2ml含200ug的脂多糖水溶液，对照组那么注入0.2ml生理盐水。模型组大鼠当日不予被动吸烟。[12][20][21][22]24参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ-GCS活性及表达的影响烟熏与气管内滴入猪胰弹性蛋白酶的方法实验组大鼠采用香烟烟熏，将大鼠置入自制的60L(30cm×40cm×50cm)有机玻璃熏烟箱中，每次燃烧16支,每天上、下午各1次，每次30min，连续1个月后用速眠新0.5ml/1000g肌注麻醉，气管插管滴入猪胰弹性蛋白酶(porcinepancreaticelastase，PPE)20u/100g配成的0.5ml生理盐水，然后用小动物呼吸机以8ml潮气量和60次/min频率通气5次后将大鼠直立旋转,使PPE均匀进入双侧周边肺组织，全麻清醒后拔除气管插管笼中饲养，继续烟熏至3个月[23]。单纯香烟烟雾吸入法自制有机玻璃染毒箱〔80cm×60cm×50cm〕上方有一直径1.2cm的通气孔，吸烟小室3cm×1.5cm×1.5cm，每次吸烟时同时将2支点燃的香烟的过滤嘴局部与吸烟小室相连，烟雾经改进的注射器装置由吸烟小室吸出后注入染毒箱内。大鼠每日吸烟3次，每次持续吸入新鲜的香烟烟雾30min，两次吸烟间隔3h。第1天每次吸烟8支，第2、3天每次吸烟10支，第3天以后每次均吸入14支[24]。细菌感染法清洁级Wistar大鼠105只，体重185-220g,雌雄不拘,随机分为3组,每组35只，对照组经鼻腔注入细菌常规培养液0.1ml，每周2次，持续2个月。肺炎克雷伯杆菌感染组经鼻腔注入肺炎克雷伯杆菌液0.1ml，每周2次，持续2个月。肺炎链球菌感染组注入肺炎链球菌菌液0.1ml，方法和条件同上。经鼻腔注入具体方法为：以消毒的1ml注射器吸取培养液或细菌菌液0.1ml，针尖进入大鼠鼻腔内，趁大鼠吸气时注入液体，处理后第1天、第1周、第2周、第4周、第8周和第16周6个时间点分别处死各组5只大鼠，进行有关工程检测。结果证实，以适量肺炎克雷伯杆菌和肺炎链球菌，屡次经鼻腔注入大鼠肺内所复制的动物模型具有COPD的病理学特征[25]。多因素结合法〔熏烟、寒冷刺激4周,结合两次气管内注入脂多糖的多因素刺激〕25讨论模型制作第1天、第14天将大鼠以适量乙醚吸入麻醉后，暴露喉头，以静脉套管针替代气管导管行气管插管，向大鼠气管内注入LPS100ul(1mg/ml),完毕后将大鼠直立旋转10-20s,使LPS均匀分布于肺部。第2-13，15-28d，每天在有机玻璃密闭箱持续吸入新鲜的香烟雾30min，15支/d；每天熏烟后立刻用低于环境温度(20℃)5℃冷空气刺激1h，造模28d结束[26]。其它方法氯化镉诱导的模型；化学因素〔氧化物、污染物、臭氧等〕诱导的模型；饥饿诱发的模型〔严重饥饿可诱发大鼠、地鼠的肺气肿〕；基因突变小鼠的自发性肺气肿模型；细胞因子基因过度表达诱导的肺气肿模型；基因缺失诱导的肺气肿模型等[29]。1.2.各种造模方法的比拟SO2为一种化学物质，该法模拟了COPD病因中的环境因素〔职业性粉尘和化学物质〕的作用，能够使大鼠有程度不同并与人类相似的慢性支气管炎和肺气肿改变[19]。气道内滴入脂多糖和被动吸烟法与单纯香烟烟雾吸入法那么模拟COPD病因中的环境因素〔吸烟、感染〕的作用。熏香烟加气管注内毒素及较长期单纯熏香烟，均可复制较理想的COPD大鼠模型。但熏香烟所致病理较熏香烟加气管注内毒素过程进展缓慢。为加速模型的建立,可增加每日熏香烟量及次数,或适当延长熏香烟时间[27]。烟熏与气管内滴入猪胰弹性蛋白酶的方法模拟的是COPD病因中的环境因素〔感染〕的作用，而猪胰弹性蛋白酶又与COPD发病机制中的蛋白酶-抗蛋白酶失衡相吻合。该法可成功诱发大鼠的实验性肺气肿，其影像学、肺功能和组织病理学表现均与人类因长期吸烟造成的慢性阻塞性肺气肿相似，是研究人类慢性阻塞性肺气肿的较好实验动物模型[23]。细菌感染法与COPD病因中的环境因素〔感染〕的作用完全吻合。以肺炎克雷伯杆菌和肺炎链球菌，屡次经鼻腔注入大鼠肺内所复制的动物模型具有COPD的病26参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ-GCS活性及表达的影响理学特征[25]。多因素结合法〔熏烟、寒冷刺激4周,结合两次气管内注入脂多糖的多因素刺激〕那么意图同时模拟更多的致病因素，从而使模型更加符合该病的临床进程。其所成功制备COPD大鼠模型，不仅病理形态学和肺功能的改变与人类COPD类似，而且在整体状况和运动能力方面的变化与人类COPD的临床病程和表现更接近[26]。氯化镉诱导的模型、化学因素〔氧化物、污染物、臭氧等〕诱导的模型的致伤因素与致病因子〔职业性粉尘和化学物质、空气污染〕相一致；饥饿诱发的模型〔严重饥饿可诱发大鼠、地鼠的肺气肿〕的致伤因素与致病因子〔社会经济地位〕相同；各种基因相关的肺气肿模型那么与引起COPD的危险因素中的个体因素〔如某些遗传因素〕相吻合[29]。复制COPD模型的目的在于：模拟COPD的发病因素病理过程和临床特征，研究COPD的发病机制及防治方法。一个符合临床实际的理想COPD动物模型应具备的标准是：致伤因素与临床COPD常见诱因根本一致；必须有气流阻塞存在，小气道阻力增、肺动态顺应性下降；气道重塑；可伴有气道高反响性[28]。很明显，以上的造模方法虽能模拟出COPD的病理变化，但并不与COPD的致伤因素、临床特征完全吻合。因此，到目前为止，尚无一个完美的造模方法。未来的趋势是：研究多因素干预的动物模型，尤其是具有基因表达异常和其他因素(如吸烟、有毒颗粒吸入等)共同干预的模型。这种模型将与COPD的致伤因素、病理变化、临床特征更加吻合，为研究COPD的发病机制及防治方法作出更大奉献[29]。中医证和西医病相结合的动物模型那么是研究中医药所必需的。1.3.肺组织形态学和肺功能指标的意义我院呼吸科对COPD的研究已有十数年的历史，对该模型的复制有着丰富的经验。在既往的实验中发现气道内滴入脂多糖和被动吸烟法复制的模型具有与人类COPD疾病较高的相似性，且重复性好、可靠性高、方法简便易行、符合经济原那么，故本实验采用该法复制模型。模型组大鼠在光镜下表现为支气管粘膜纤毛上皮排列紊乱、脱落，杯状细胞增生，管壁各层炎性细胞浸润，道腔内炎细胞聚集，血管壁周围有炎性细胞浸润；27讨论肺泡结构紊乱，肺泡壁变薄、断裂，肺泡腔扩大，局部融合成肺大疱，肺气肿形成。电镜下表现为支气管纤毛柱状上皮细胞胞浆肿胀，呈“大泡样〞向腔面突起，纤毛减少、变短，局部纤毛脱落；Ⅱ型肺泡上皮细胞增生，板层小体排空，肺泡腔内可见巨噬细胞及少许红细胞，巨噬细胞内可见丰富的初级和次级溶酶体。这些肺组织病理形态学的改变与人类COPD疾病特征性病理改变相吻合。模型组大鼠FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、FEF25-75、MMF、PEF、MVV值均较空白对照组降低，差异有显著性。其肺功能下降的表现与人类COPD疾病相一致。综合模型组大鼠肺组织病理形态学与肺功能的改变，确认模型复制成功。参七虫草胶囊高、低剂量组与金水宝胶囊组大鼠光镜及电镜下肺组织形态学改变介于对照组与模型组之间。说明两药均能延缓COPD的病理形态学进程。参七虫草胶囊高、低剂量组与金水宝胶囊组分别与模型组比拟，FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、FEF25-75、MMF、PEF、MVV值均有改善，差异有显著性。说明二药均能延缓COPD大鼠模型的肺功能下降。参七虫草胶囊高、低剂量组与金水宝胶囊组比拟，FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC差异无显著性，PEF、MVV差异有显著性。说明参七虫草胶囊在延缓肺功能下降作用上优于金水宝胶囊。参七虫草胶囊高、低剂量组之间比拟，FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、FEF25-75、MMF、PEF、MVV值差异无显著性。参七虫草胶囊在延缓肺功能下降时无剂量依赖性。2.参七虫草胶囊的组方依据与成效2.1.祖国医学对COPD的认识民国以前医家对COPD的认识根据COPD的临床表现咳嗽、咳痰、气喘、胸满、紫绀、水肿等，相当于中医学的“肺胀〞或“喘证〞的范畴。?内经?中已有肺胀的记载，并指出肺胀乃虚实相兼之复杂证候。如?灵枢・胀论?：“肺胀者，虚满而喘咳。〞?灵枢・经脉?篇：“肺手太阴之脉，……是动那么病肺胀满，膨膨而喘咳。〞汉・张仲景在内经的根底上，明确提出肺胀的病症有胸满、喘咳、烦躁、短28参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ-GCS活性及表达的影响气、面目浮肿等，并提出了相应的治法。如?金匮要略・肺痿肺痈咳嗽上气病脉证并治?：“上气，喘而燥者，属肺胀，欲作风水，发汗那么愈〞；“咳而上气，此为肺胀，其人喘，目如脱状，脉浮大者，越婢加半夏汤主之〞；“肺胀，咳而上气，烦躁而喘，脉浮者，心下有水，小青龙加石膏汤主之〞。隋・巢元方?诸病源侯论?明确提出肺胀的病机为肺虚感寒，邪正相搏，气聚于肺，肺气胀满，气逆而上。如?诸病源侯论・咳逆侯?：“由肺虚感微寒所成，寒搏于气，气不得宣，胃逆聚还肺，肺那么胀满，气逆不下，故为咳逆。〞?诸病源侯论・咳逆短气侯?：“肺虚为微寒所伤那么咳嗽，咳那么气还于肺间那么肺胀，肺胀那么气逆。〞唐・孙思邈及王焘在?备急千金药方?、?外台秘要?中增添了新的方药并对以前的方药作了汇总。如所记载的方药有白前汤、紫菀汤、一合汤、麦门冬丸、杏仁煎等。宋・王怀隐所辑的?太平圣惠方?中首次运用大黄通腑泻下的作用来缓解肺胀的病症，还指出久咳可以导致肺胀，病理层次可由气致血，由气逆致血瘀，但对血瘀的治疗没有重视。宋・窦材?扁鹊心书・神方?中认为肺胀是阳虚气逆所致，并用硫磺与苏子进行治疗。宋・杨仁斋在?仁斋直指方论・喘嗽方论?指出肺胀可见于喘证，且有气郁致肺胀而喘的临床症候。金・李杲在?脾胃论?中认为肺胀为气虚冲脉之火上逆所致，动辄气喘也是其病症之一；治疗以补气敛降为主，多用五味子，人参次之，麦门冬又次之，黄连少许；平居那么不喘，稍行动那么气促喘急以滋肾丸空心服。丹溪心法・咳嗽?：肺胀而咳，或左或右不得眠，此痰挟瘀血，碍气而病，宜养血流动于气，降火疏肝以清痰。〞可见朱丹溪认为本病病机为“痰挟瘀血，碍气而病〞。在治疗上相应为“养血以流动乎气，降火清肝以清痰〞，并提出具体方药为“四物汤加桃仁、青皮、姜汁、竹沥〞。明・赵献可在?医贯・喘论?中补充肺胀的临床症候有“先觉呼吸短气，两胁胀满，左尺大而虚。〞治疗上提出补肾疗法，在气虚中满论中论述五脏之胀为本虚标实，本虚为五脏虚，标实为水气夹相火上逆而成，以六味地黄加门冬五味大剂服之。明・李中梓?医宗必读・喘?：“肺胀嗽而上气，鼻扇肩抬，脉浮大者，29?“?“讨论越婢加半夏汤主之，无外邪而内虚之肺胀，宜柯子、海藻、香附、瓜蒌仁、半夏、杏仁、姜汁为末，蜜调含之。〞其明确指出喘证有肺胀，相当与哮喘肺残气量增加的状态，治疗方药遵仲景用越婢加半夏汤，继以参术补养肺金。清・喻昌力主大气之说，认为肺胀之喘乃痰浊溢入上窍，透出肺膜结为巢囊，窒塞关隘，不容呼吸出入；外因动其居下之浊气，随火势而上腾，清浊相干肺气胀满而发咳喘，呼吸不利，胸膺仰息，咳吐痰浊。李用粹在?证治汇补?中具体地概括了肺胀的分证治疗，“如痰挟瘀血碍气，宜养血以流动乎气，降火以清利起痰，用四物汤加桃仁、枳壳、陈皮、栝楼、竹沥。又风寒郁于肺中，不得发越，喘咳胀闷者，其症水入即吐，宜四苓散加葶苈子、桔梗、桑皮、石膏。有肾虚水枯，肺金不敢下降而胀者，其症干咳烦冤，宜六味丸加麦冬、五味。〞李冠仙认为本病乃肾气上逆所致，治以纳气归元为法，方用都气丸加减。许珊林认为肺胀之虚为肺脾两虚，无痰之喘可用西洋参、冬虫夏草、川贝、青盐、陈皮、阿胶、当归、枸杞、枇把叶、蒺藜、牡蛎等可达土金相生之妙。何仁认为本病为痰浊阻肺，肾元亏虚，以温降平喘为主，方用苏子降气汤加减。2.1.2.当代医家对COPD的认识朱慧志等认为肺气亏虚是COPD的前提和墓础；脾肾虚损是COPD的开展和转折；肺络郁滞是COPD脏腑损伤的载体和脏腑传变的通道；多脏器功能失调是COPD开展的趋向和结果。该病初起在肺，延及脾肾，病末累及心、脑等多脏，是一个由气及血，由血及气，再由气及血的循环往复的过程，每个循环在病势和病位上都存在着变化。络脉作为COPD本虚标实的力量交争场所，其病程中不同形式的病络即是这种变化过程的表达，其功能状态成为COPD脏腑病机转归的关健环节[32]。田正鉴等认为肺气虚是COPD发生和开展的内在条件；吸烟、六淫是导致COPD发生和开展的主要外因；痰瘀内阻贯穿COPD病程始终；多脏腑功能失调是COPD病情开展的必然结果[8]。陈玉龙等认为毒是一类不同于痰、瘀、六淫、疫疠之邪，具有强烈危害性的致病因素，它可以从口鼻、皮肤、胃肠而入或从体内化生损害肺脏，在COPD发生开展过程中占有重要位置，因此从毒论治COPD是必要的，但仍应结合扶正化痰祛瘀之法。在一般治疗的根底上加用解毒法对提高COPD的疗效，30参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ-GCS活性及表达的影响将具有重要作用[30]。余学庆等认为慢阻肺以本虚标实为主要病机,本虚以气阴虚为主，标实以痰阻、气滞、血瘀相结为主，辨证时尤应注重病期变化对证候的影响[37]。肖金等发现以肺胀Ⅱ号〔由黄芩、鱼腥草、法夏、杏仁、苏子、矮地茶、葶苈子、川芎、丹参等组成〕结合常规西医处理，总体疗效显著高于单纯西药治疗组[33]。中医药扶正固本法有抗衰老、抗氧化、改善肺通气功能等作用，它对于阻止慢阻肺(COPD)病症开展和疾病的反复加重;保持最适当的肺功能;改善和提高生活质童共有重要的意义和临床价值[34]。王鸿程等发现COPD患者细胞免疫功能受损严重，主要是T细胞亚群低下或失调。治疗组加用扶正中药，其T细胞亚群的恢复明显优于对照组。提示扶正中药对COPD患者细胞免疫功能的恢复有较好的疗效[36]。目前中医界较为一致的看法是本病的发生可由外感六淫、饮食失宜、劳倦过度、情志失调等诱发，但以外感风寒为主要诱因，多由久咳、久喘、久哮等肺系疾病反复发作、迁延不愈开展而成。本病关乎五脏，而重在肺、脾、肾三脏气阳之衰，气阳虚衰是发病的首要内因。气阳俱衰，痰浊内生，伏着于肺，气机不利，血行不畅而成瘀，瘀痰互生，痰瘀胶结，遂成窠臼，成为发病的宿根。痰瘀伏肺、肺气壅塞是本病的根本病机。气滞血瘀、痰瘀互结为后期常见的病理转归，也是本病缠绵难愈的原因。本病乃本虚标实之证，肺脾肾虚为本，痰瘀为标。急性期以标实为主，多见痰、瘀、热；稳定期以本虚为主，为肺脾肾虚损；外感是重要的诱发因素。在临床治疗中，中医以本虚标实立论，扶正固本与祛邪兼顾，急性期以祛邪为要，稳定期那么以扶正补虚为主。常用的治法为理肺祛痰、活血化瘀、通阳宣痹和扶正祛邪等[35]。2.2.慢阻肺稳定期“虚瘀〞理论导师张念志博士综合以上各家学说，结合自己丰富的临床经验，提出了慢阻肺稳定期“虚瘀〞理论假说。肺肾亏虚是慢性阻塞性肺病产生的根底肺主气，司呼吸，主宣发肃降，假设宣肃失司，呼吸异常，那么表现为咳、喘、哮等病证。正如?素问・阴阳应象大论?说：“天气通于肺。〞肺赖肃降以吸入天之清气，靠宣发以呼出体内浊气。由于这种吐故纳新的作用，使体内外气体得到交31讨论换，是维持人体生命活动的重要条件。肺为清虚之脏，无论外感六淫邪气犯肺，或是内生的痰湿、水饮阻肺，以及肝火等触及于肺，都可使清虚之体受扰，如?医学三字经・咳嗽?说：“脏腑之华盖，呼之那么虚，吸之那么满。只受得本然之正气受不得外来之客气。……亦只受得脏腑之清气，受不得脏腑之病气。〞由于肺虚卫外功能减弱，外邪易入；或气不布津，积为痰饮；或气虚血滞，瘀阻肺络；或阴虚火旺煎熬津液为痰，以致虚实夹杂。各种原因导致的肺系疾患，迁延失治，痰浊潴留，气还肺间，日久导致肺虚，早期为肺气虚或气阴两虚，进而可由肺及脾肾；晚间气虚及阳或阴阳两虚。在对COPD的证候学调查的根底上，发现COPD以久病肺虚为主，表现为肺主气功能失调(即肺气虚证)。肺气虚证早期主要指肺的卫外功能减退，表现为恶风自汗、易感冒、咳嗽声低、久咳痰白、气短乏力、自汗、舌淡胖、脉虚无力；肺气虚证中期表现肺主气而司呼吸功能的减退，兼见气短喘促、动那么尤甚；后期是中期的进一步开展，表现为肺的治节功能减退，上不能助心以行血而致心悸、紫绀、颈静脉怒张；下不能通调水道以输膀胱而见尿少、浮肿等。COPD的病机是本虚标实；本虚表现在初期在肺虚(气虚、气阴两虚为主)，久那么及肾，表现在肺肾两虚。标实表现在血瘀贯穿其中。病多为肺虚(气虚或气阴两虚)→肺肾两虚→“虚瘀〞证。“虚瘀〞那么贯穿于COPD的始终。肾主摄纳，呼吸虽为肺所主，但吸入之气，必须靠肾气的摄纳，方可保证呼吸的正常运行，故有“肺为气之主，肾为气之根〞之说。假设肺脏虚损，病穷及肾，可致肾不纳气，而出现喘脱等证候。气之所以虚，主要因为化源不充。医门法律・先哲格言?说：“真气所在，其义有三，曰上中下也。上者所受于天，以通呼吸者也；中者生于水谷，以养营卫者也；下者气化于精，藏于命门，以为三焦之根本者也〞，并谓：上者“其治在肺〞，中者“其治在脾〞，下者“其治在肾〞。中医学有“金水相生〞、“肺肾相生〞、“肺肾相关〞之说。其理论源于?黄帝内经?，?灵枢・经脉?提出肺肾之间经脉相连。……肾，足少阴之脉，……其直者从肾上贯肝膈入肺中。〞故肺胀的气虚多与肺肾虚损有关。瘀血阻滞肺络是慢性阻塞性肺病的主要病理因素32?“?“参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ-GCS活性及表达的影响气血是人体生命活动的重要物质根底，与脏腑的关系十分密切。它们由脏腑化生、输布，脏腑又赖之以进行正常的生理活动。脏腑发生病变要影响气血的变化，而气血的病变也要影响某些脏腑。正常情况下，“气为血之帅，血为气之母〞，血液的化生和推动赖于气，而气又以血为载体。正如?素问・举痛论?说：“经脉流行不止，环周不休。〞血液在人体是行而不居的，如果留着不行，那么为瘀血。肺气郁滞，必致血行不利；且痰浊水饮之邪，其性粘滞重浊，阻碍气机，更易导致血行瘀阻。在肺胀的病因病理中，气虚(肺脾肾)那么运血无力，也是形成血瘀的主要原因。瘀阻肺络是慢阻肺病程中的必然病理。慢阻肺患者支气管、细支气管的毛细血管基底膜增厚，内皮细胞损伤，血栓形成和管腔纤维化、闭塞，从而引起肺循环障碍。当病变开展至肺气肿，大量肺泡周围的毛细血管受肺泡膨胀的挤压而退化，使肺毛细血管大量减少，肺弥散面积减少，产生弥散障碍而缺氧。在急性加重期，感染、痰液阻塞、酸碱失衡等均可加重缺氧。已证实慢阻肺患者血液流变学改变明显，血浆粘度、全血粘度、红细胞压积、体外血栓形成都有异常改变，血液处于高凝状态。慢阻肺患者大多年事较高，正气渐虚，且慢阻肺反复发生，迁延不愈，久病伤正气，正虚推动血行不力而易形成瘀血；心主血脉，肺朝百脉，肺助心主治节，调节血液循环，外邪闭肺，或痰郁阻肺，皆可致肺失宣降，不能助心主治节而形成血瘀；久病脾肾阳虚，甚那么累及心阳，不能温煦经脉或煽动血脉，血液凝滞，形成瘀血。故临床常见唇甲青紫、面色黎黑、肌肤甲错、胁下痞块、舌质暗红或紫暗或有瘀斑、脉涩等表现。血瘀络滞，五脏六腑营养障碍而功能受累，可导致机体抵抗力低下，易致外邪侵袭，引起慢阻肺的反复急性发作。郭丽萍等对42例肺心病患者的血浆纤溶活性进行了测定，结果血浆纤溶活性降低与肺心病高凝状态有关，并容易导致肺小动脉血栓形成[38]。因此，瘀血阻肺是慢阻肺的一个重要的病理环节，活血化瘀法在慢阻肺的中医治疗上，显得尤为重要，它不仅可改善血液循环，改善血液粘稠性，而且可改善脏腑组织的供血供氧，提高机体抵抗力。33讨论2.3.参七虫草胶囊的组方依据、成效与研究为发挥中医“治病必求其本〞的优势，将中医药治疗慢阻肺的切入点选择为COPD的稳定期，针对慢阻肺稳定期“虚瘀〞病机，导师选用西洋参、冬虫夏草、参三七等组成参七虫草胶囊。该药专为COPD之肺肾亏虚，气阴缺乏，瘀血阻肺而设，能补益肺肾，活血祛瘀；为标本兼治之方。方中西洋参君药，辅以冬虫夏草益肺肾之精，佐以参三七活血化瘀以治标，诸药合用，配伍合理，标本同治，补虚不留邪，祛邪不伤正，遣药精当，立意深明，表达了中医治疗本病之特色与经验。且用之于临床，常有效验。为将该经验方推广，导师十余年来对该药进行了一系列的研究。临床研究表明该药能显著地减少COPD患者的下呼吸道急性感染次数、发病持续时间及抗生素的应用时间，亦可提高患者的免疫功能[10]。在动物实验中发现COPD模型组大鼠肺组织TNF-αmRNA的表达量显著升高，该药可以降低肺组织TNF-αmRNA表达[12]；大鼠COPD模型的血清TNF-α、IFN-γ明显升高，IL-4、IL-10那么显著减低，该药那么可调节上述细胞因子的紊乱，能降低TNF-α、IFN-γ的水平，上调IL-4、IL-10的水平，使Th1/Th2恢复平衡[11]。以上研究说明参七虫草胶囊临床疗效确切，其治疗COPD的作用与抑制炎症介质、调节细胞因子的紊乱相关。2.4.参七虫草胶囊的拆方分析西洋参味甘、微苦，性寒。归心、肺、肾经。具有补气养阴，清火生津之成效。常用于阴虚火旺的喘咳痰血及热病气阴两伤，烦倦，口渴等症。本草记载：?本草再新?：“治肺火旺，咳嗽痰多，气虚呵喘，失血，劳伤，固精安神，生产诸虚。〞?本草从新?：“补肺降火，生津液，除烦倦。虚而有火者相宜。〞?本草求原?：“清肺肾，凉心脾以降火，消暑，解酒。肺气本于肾，凡益肺气之药，多带微寒，但此那么苦寒，唯火盛伤气，咳嗽痰血，劳伤失精者宜之〞。?医学衷中参西录?：“西洋参能补助气分，兼能补益血分，为其性凉而补，凡欲用人参而不受人参之温补者，皆可以此代之。〞34参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ-GCS活性及表达的影响药理研究：西洋参含人参皂苷〔Rb1、Rb2、Rb3、Rd、Re、Rg1、Rh1、Rh2、Ｆ2、F11等〕、挥发油〔75%为倍半萜类化合物〕、无机元素类、脂肪酸类、氨基酸类、糖和多糖类、酶类[超氧化歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)]、聚乙炔类化合物等[39][40]。有以下药理作用：对中枢神经系统的作用〔抗疲劳与增加耐缺氧能力、抗缺氧作用、增强学习和记忆〕；对心血管系统的作用〔抗心肌缺血、抗心律失常、抗高血压、抗休克、抗氧化和调节血脂代谢〕；对消化系统的作用；对血液和造血系统的作用〔溶血、抑制血小板聚集、升高白细胞〕；对肝损伤的保护作用；提高免疫系统的功能；抗癌作用；抗衰老作用；提高性腺的作用。不良反响有：过敏、心律失常加剧、女性内分泌失常、脾阳虚征象[41]。冯孝义等报道洋参五加口服液能显著提高大白鼠红细胞内超氧化歧化酶〔SOD〕的活力，这样便能在一定程度上防护超氧自由基对人体神经、血管、生物膜和生物大分子等的损伤，同时抑制脂褐质在神经节、脊髓、脑干、心肌细胞等重要部位的沉着，可望在防治衰老和许多疾病方面发挥作用[42]。张善玉等报道以西洋参为主要成份，配麦冬、枸杞子和维生素类等制成的复方西洋参口服液对亚硝酸钠有良好的去除作用，能明显提高大鼠血浆抗氧化物歧化酶活力，降低丙二醛含量，具有一定的抗氧化作用[43]。杨素娟等报道使用健脾固肾丸(西洋参、蛤蚧、紫河车、菟丝子等)治疗慢性阻塞性肺病稳定期56例，与平喘的中成药对照，有较好的疗效[44]。中医理论中肺胀的病机为肺肾两虚，而西洋参的补益肺、肾气阴的作用与其吻合。现代医学认为COPD的发病与氧化-抗氧化失衡相关，且在临床中观察到患者多有免疫功能的低下。药理研究说明西洋参具抗氧化、提高免疫系统功能的作用，与发病机制无不合拍。冬虫夏草味甘，性平。归肺、肾经。具有益肾壮阳，补肺平喘，止血化痰之成效。为滋养肺肾之要药。常用于肺虚或肺肾两虚之久咳虚喘，劳嗽痰血及肾虚腰疼，阳萎遗精等症。本草记载：?本草从新?：“保肺益肾，止血化痰，己劳嗽。〞?药性考?：“秘精35讨论益气，专补命门。〞药理研究：冬虫夏草含粗蛋白、脂肪、粗纤维、碳水化合物，另有18种氨基酸、虫草酸、冬虫夏草素、虫草多糖、核苷类、肽类、多种维生素和20余种无机元素。有以下药理作用：调节特异性和非特异性的免疫功能、改善呼吸系统的功能、保护肾脏的作用、对心血管系统的作用〔抗心肌缺血、抗心律失常、降低冠脉血管阻力〕、抗衰老、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、调节内分泌系统功能的紊乱等[45]。吴晓晖等报道百令胶囊〔采用微生物深层液体培养法生产的发酵虫草菌粉〕治疗中医证属肺肾两虚证的慢性阻塞性肺病疗效确切，平安性好。它对机体免疫系统有双向调节作用,可以刺激NK细胞并增强细胞毒性，从而恢复对Ｂ细胞抗体的抑制作用，减少白细胞介素(IL-4,IL-6),α-干扰素水平。它的重要药效分为核苷类物质，多种氨基酸，麦角甾醇及微量元素等，可通过补充人体必需氨基酸，改善营养状况，提高抵抗力到达对COPD的治疗作用[46]。刘进等报道冬虫夏草菌粉虽不能防止模型组大鼠COPD的形成，但能减轻COPD气道炎症的程度，能有效阻止阻塞性肺气肿病理改变的进一步开展，并在一定程度上抑制肺功能的进行性恶化和改善其通气功能[47]。沈晓强等报道冬虫夏草制剂对于中医证属肺肾两虚的慢性阻塞性肺疾病临床病症和体征有较好的疗效[48]。钱皓瑜报道冬虫夏草有改善COPD患者肺通气功能，提高血氧分压的作用，对COPD有治疗作用。同时冬虫夏草能降低COPD患者血浆内皮素浓度，冬虫夏草的治疗作用可能与此有关[49][50]。综上所述，冬虫夏草对中医证属肺肾两虚的慢性阻塞性肺疾病的疗效确切，作用机理与其调节特异性和非特异性的免疫功能、改善呼吸系统的功能、抗氧化、抗炎、改善呼吸系统的功能等成效相关。参三七甘，微苦，性温。具有化瘀止血，活血定痛之效。常用于有瘀的各种内外出血证及跌打损伤，瘀滞疼痛等症。本草记载：?本草从新?：“甘，平。保肺益肾，止血化痰，已劳嗽。〞?本草新编?：“三七，止血之神药也。无论上、中、下之血，凡有外越者，一味独用亦效，参加于补血补气药中那么更神，盖此药得补而无沸腾之患，补药得此而有安静之休36参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ-GCS活性及表达的影响也。〞?文房肆考?：“保肺气，实腠理。〞?本草纲目?：“止血、散血、定痛、金刃箭伤、跌扑杖疮血出……亦主吐血、衄血、下血、血痢、崩中、经水不止，产后恶血不下、血晕、血痛、赤目肿痛、虎咬蛇伤等病。〞医学衷中参西录?：三七……善化瘀血，又善止血妄行，为吐衄要药，病愈后不致瘀血留于经络……化瘀血而不伤新血，允为理血妙品。〞药理研究：三七主要成分为皂苷和黄酮苷，如人参皂苷、三七皂苷、人参醇、槲皮素、三七氨酸等。具有以下药理作用：止血抗凝、抗炎镇痛、对心血管系统的作用〔增加冠脉流量、抗心肌缺血、扩血管降压、抗心律失常、抗脑缺血〕、保肝、护肾、抗氧化与衰老、免疫调节、调节中枢神经系统功能、降血脂等[45]。李夏凤报道连续4年冬季服用参蛤三七散治疗后，患者抵抗力明显增加，平均每年发病程度，住院天数等均逐渐下降，与对照组相比临床疗效满意。该药由人参30ｇ、蛤蚧4对、三七30ｇ等研极细沫组成[51]。马文裴等报道三七总皂甙(PanaxNotoginsengsaponins，PNS)具有扩张血管，减少氧自由基的生成和特异性阻断血管平滑肌受体门控Ca2+通道的作用。可抑制大鼠慢性低氧性肺动脉高压的形成，其机制可能与其调节NO含量、抗氧自由基损伤、减轻细胞损伤和降低红细胞比积有关[52]。COPD病程后期导致肺心病，从以上的资料中可以看出三七在此阶段可以发挥重要的治疗作用。3.氧化-抗氧化指标的意义的发病因素与发病机制COPD的发病因素包括个体易感因素以及环境因素两个方面，两者相互影响。个体因素又包括某些遗传因素〔如α1-抗胰蛋白酶缺乏〕和气道高反响性。环境因素又包括吸烟、职业性粉尘和化学物质的接触、空气污染、感染、社会经济地位及其他因素〔如寒冷空气、迷走神经功能失调等〕[6]。其中，吸烟被公认为是重要的发病因素，呼吸道感染是另一个重要的发病因素，而α1-抗胰蛋白酶重度缺乏与非吸烟者的肺气肿形成有关。COPD发病机制的研究也进展很快，目前比拟流行的有以下几种学说。37?“?“讨论1.粘液分泌亢进与小气道阻塞

吸烟或吸入其他有害物质会导致粘液分泌增加表现为粘液腺扩大，杯状细胞增加、粘液分泌亢进与粘蛋白过度分泌。而粘蛋白过度分泌是小气道阻塞和肺组织重构的高危因素。2.蛋白酶-抗蛋白酶失衡

肺气肿是由于蛋白酶-抗蛋白酶失衡所致，前者可以消化弹性蛋白和肺泡壁上的其他蛋白结构，后者那么对抗与平衡前者。蛋白酶主要有：中性粒细胞弹性蛋白酶、蛋白酶3、组织酶G、基质金属蛋白酶(MMPs)。抗蛋白酶主要有α1-抗胰蛋白酶、α1-抗糜蛋白酶、分泌性白细胞蛋白酶抑制物(SLPI)、组织金属蛋白酶抑制物(TIMPs)。3.氧化与抗氧化失衡

COPD患者的氧化应激增加，氧化物主要有超氧阴离子(O2-)、羟根(OH)、次氯酸(HOCL)和H2O2等。抗氧化物有超氧歧化酶(SOD)、过氧化氢酶、谷胱甘肽氧化复原系统等。当氧化与抗氧化失衡，氧化应激增加那么造成了COPD肺实质的损害。4.炎症细胞、细胞因子和炎性介质的介导作用

COPD气道与肺实质的持续炎症病变涉及多种细胞和炎症介质，激活的炎症细胞释放各种细胞因子和炎性介质损伤肺结构。气道与肺实质炎症反响的主要炎症细胞为：巨噬细胞、CD8T淋巴细胞、中性粒细胞、上皮细胞、嗜酸性粒细胞。这些炎症细胞各自释放以下细胞因子和炎症介质：肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-8、LTB4、巨噬细胞趋化肽(MCP-1)、血小板活化因子(PAF)和转移生长因子-β(TGF-β)等。5.感染

病原体的感染与慢性炎症加剧了肺损伤，造成支气管纤毛去除系统的破坏，寄植于上呼吸道的微生物移生致下呼吸道，释放病原体产物，造成气道内皮细胞损伤；导致炎症，炎症细胞引起细胞因子和炎性介质释放，从而促进COPD的开展。6.血管病理

慢性缺氧可导致肺血管收缩并产生肺动脉高压，造成肺循环的重建。这一过程主要包括：血管平滑肌延伸至本来无肌肉成分的血管；血管内膜增生和使一些血管发生纤维化和闭塞。上述变化将会使一些患者从COPD演变为肺源性心脏病[4][53]。可以看出，COPD并不是一种单一发病因素、发病机制的疾病。导师认为在以上发病机制中，氧化与抗氧化失衡是起重要始动作用的环节或者说是在以上不同38参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ-GCS活性及表达的影响的发病层面中是非常重要的一环，对该机制的研究意义较大。因此，本实验的观察指标全部与氧化与抗氧化失衡相关。3.2.氧化-抗氧化失衡与COPD研究说明机体产生氧化物增加及(或)抗氧化物减少与COPD发病密切相关,氧化-抗氧化失衡在COPD发病中的作用及对其治疗已日益受到重视。氧化物/抗氧化物系统机体氧化物的产生：氧化物是指氧的某些代谢产物及其含氧衍化物，其化学活性强、不稳定，具有较强的氧化能力。主要包括超氧阴离子(O・2-)、羟自由基(・OH)、单线态氧(O・2)、过氧化氢〔H2O2〕、脂质过氧化物(RO、ROO・与ROOH)等。氧化物在细胞线粒体、过氧化体、内质网、胞浆膜及酶系统内形成。・OH及HOCL均具有极强的氧化活性，很容易引起组织损伤。肺内氧化物的来源：⑴.吸烟：香烟烟雾和焦油均含有较高浓度的自由基，每口烟雾含有超过1015的氧自由基。⑵.炎症细胞：中性粒细胞〔PMN〕及肺泡巨噬细胞〔AM〕作为主要的炎症细胞与嗜酸粒细胞〔EOS〕、淋巴细胞、肺上皮细胞一起参与炎症反响且影响氧化/抗氧化平衡，产生氧自由基和氧化卤素。⑶.其他：吸入空气污染中的臭氧及NO，可使气道发生脂质过氧化及产生氧化物。抗氧化物系统：正常情况下包括酶类和非酶类。酶类包括：⑴.超氧化物歧化酶〔SOD〕，可催化O・2-歧化生成H2O2，去除O・2-。⑵.谷胱甘肽过氧化物酶〔GPx〕，可去除脂质过氧化物和H2O2。⑶.过氧化氢酶〔CAT〕，主要去除H2O2。非酶类包括：⑴.脂溶性抗氧化物，如维生素Ｅ、β胡萝卜素、胆红素等；⑵.水溶性抗氧化物：如维生素Ｃ、谷胱甘肽〔GSH〕、半胱氨酸、尿酸等；⑶.高分子量抗氧化物：如白蛋白、气管支气管粘液、线粒体组分Ｑ、丙酮酸及其它不明物质；⑷.DNA氧化损伤修复系统，主要存在于核内。患者存在氧化-抗氧化失衡研究证实吸烟者尤其吸烟的COPD患者存在氧化/抗氧化失衡，且其主要与在39讨论气道与血中由于吸烟引起氧化物产生增加或白细胞释放活性氧增加所导致的氧化负担加重以及机体抗氧化物的耗损或缺乏所导致的抗氧化能力的下降相关。由于氧化-抗氧化失衡可导致抗蛋白酶失活、气道上皮损伤、粘液分泌过多、增加PMN在肺微血管系统的聚集及前炎症介质的基因表达，故氧化-抗氧化失衡的存在是COPD的发病机制的重要特征之一。氧化物与蛋白酶-抗蛋白酶失衡：COPD患者由于吸烟、感染及炎症等因素使PMN、AM和T细胞在肺内聚集，并且释放多种细胞因子和蛋白裂解活性物质，同时反响性氧化产物也增多，它们可使α1-抗胰蛋白酶失活，从而引起肺损伤和肺功能降低。氧化物直接损伤肺组织：⑴.脂质过氧化，自由基可直接与脂类反响，夺取一个氢原子形成脂基团，在有氧的情况下，引发脂质过氧化链式反响，产生脂过氧基和脂氢过氧化物。脂质过氧化导致脂肪酸链断裂，影响膜的流动性和通透性，它还可增加花生四烯酸代谢合成物,如血栓素、前列腺素Ｅ、白三烯Ｃ4等，参与炎症过程。⑵.DNA损伤，线粒体DNA(MtDNA)是细胞内自由基产生位点之一,由于其结构和功能的特殊性,也是自由基攻击的主要靶标。⑶.蛋白质损伤，氧化物与蛋白质分子中的甲硫氨酸、半胱氨酸、酪氨酸等残基直接发生反响，破坏蛋白质一级结构，使蛋白质功能受损，酶失活。⑷.改变信号传导通路，氧化物以第二信使的作用参与细胞信号转导机制的调节。气道氧化损伤与气道阻塞：气道上皮细胞由于直接与外界环境接触而易受氧化损伤，继发气道阻塞与气流受限。肺内抗氧化物改变：由于氧化物在COPD的发病中起到破坏作用，因此抗氧化物的防御作用对COPD的发病至关重要。一局部研究说明抗氧化物是减少的，另一局部却提示抗氧化物是增加的。目前对抗氧化能力差异大的具体原因尚未明确，有待进一步研究。其他：氧化物产生系统如黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶与COPD患者气道高黏液分泌机制有关，氧化物可促使摩尔质量大的黏液产生，阻碍了纤毛的功能，减少肺表面活性物质的活性，损害纤维原组织，并产生其它可以阻碍肺部修复机制的作用。40参七虫草胶囊对慢阻肺大鼠模型γ