生物化学：第二章 核酸b

*rRNA的种类（根据沉降系数）真核生物5SrRNA28SrRNA5.8SrRNA18SrRNA原核生物5SrRNA23SrRNA16SrRNArRNA的甲基化多发生在核糖上。原核生物核糖体（S)亚基（S)rRNA(S)真核生物806040285.851850703023516（以大肠杆菌为例）蛋白质21种31种49种33种（以小鼠肝为例）核蛋白体的组成(二)RNA的高级结构特点RNA是单链分子，因此，在RNA分子中，并不遵守碱基种类的数量比例关系，即分子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基的总数。RNA分子中，部分区域也能形成双螺旋结构（类似A-DNA双螺旋结构），不能形成双螺旋的部分，则形成突环。这种结构可以形象地称为“发夹型”结构或茎环结构。在RNA的双螺旋结构中，碱基的配对情况不象DNA中严格。G除了可以和C配对外，也可以和U配对。G-U配对形成的氢键较弱。不同类型的RNA,其二级结构有明显的差异。tRNA中除了常见的碱基外，还存在一些稀有碱基，这类碱基大部分位于突环部分.tRNA的高级结构1、tRNA的二级结构tRNA的二级结构大都呈“三叶草”形状，在结构上具有某些共同之处，一般可将其分为四臂四环：包括氨基酸接受臂、反密码（环）臂、二氢尿嘧啶（环）臂、TC（环）臂和可变环。除了氨基酸接受区外，其余每个区均含有一个突环和一个臂。

(1)氨基酸接受区

包含有tRNA的3-末端和5-末端，3-末端的最后3个核苷酸残基都是CCA，A为腺苷酸。氨基酸可与其成酯，该区在蛋白质合成中起携带氨基酸的作用。

(2)反密码区

与氨基酸接受区相对，一般环中含有7个核苷酸残基，臂中含有5对碱基。其中环正中的3个核苷酸残基称为反密码子。（3)二氢尿嘧啶区该区含有二氢尿嘧啶。环由8-12个核苷酸组成，臂由3-4对碱基组成。

(4)TC区

该区与二氢尿嘧啶区相对，假尿嘧啶核苷酸—胸腺嘧啶核糖核苷酸环(TC)由7个核苷酸组成，通过由5对碱基组成的双螺旋区(TC臂)与tRNA的其余部分相连。除个别例外，几乎所有tBNA在此环中都含有TC

。

(5)可变区位于反密码区与TC区之间，不同的tRNA该区变化较大，一般有3-18个核苷酸组成。假尿苷胸腺嘧啶核糖核苷稀有核苷（tRNA）2、tRNA的三级结构在三叶草型二级结构的基础上，突环上未配对的碱基由于整个分子的扭曲而配成对，目前已知的tRNA的三级结构均为倒L形。稳定因素：碱基堆积力和氢键siRNA和miRNA介绍：小的干涉RNA（smallinterferingRNA;siRNA）和微小RNA（microRNA；miRNA）是两种序列特异性地转录后基因表达的调节因子，是小RNA的最主要组成部分，它们的相关性密切，既具有相似性，又具有差异性。小的干涉RNA（siRNA）是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA，由约20个碱基对组成。SiRNA在RNA沉默通道中起中心作用，是对特定（特异性强）信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素。RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，通过这种方式，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉默，迅速阻断基因活性。(在2002年度Science评选的10大科学成就中RNAi名列榜首,06年获诺贝尔生理学和医学奖

)可以简化/替代基因敲除

miRNAs是一种21－25nt长的单链小分子RNA，其结构特征如下：广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，它本身不具有开放阅读框（ORF）；成熟的miRNA，5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基，这也是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。miRNA表达的时序性和组织特异性提示人们miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。第二章核酸

引言：核酸概述第一节：核酸的种类、分布与功能第二节：核酸的化学组成第三节：核酸的分子结构第四节：核蛋白体第五节：核酸的重要理化性质与分析技术第六节:基因组学简介核酸与蛋白质复合物的结构生物体内的核酸通常与蛋白质结合形成复合物，以核蛋白的形式存在。

DNA分子十分巨大，将它组装在有限的空间内，需要高度组织，用压缩比来表示。即：DNA分子长度与组装后特定结构长度之比称为压缩比。1.病毒：病毒颗粒主要由蛋白质和核酸及脂质、糖类组成。动物病毒主要为DNA病毒，植物病毒主要为RNA病毒。核酸是遗传物质，而蛋白质与病毒宿主的专一性有关，同时可以保护核酸免受损伤。头部颈圈尾部基板尾丝尖钉核酸位于病毒粒子的中心,蛋白质包围在核酸外面,形成衣壳,并决定病毒粒子的外形。病毒的侵染性由核酸引起,蛋白质无侵染性,仅起保护作用或识别宿主细胞表面位点。噬菌体T2结构2.细菌的拟核细菌基因组为双链环状DNA，与碱性蛋白和少量RNA结合，形成突环结构。其DNA分子的长度大约是其菌体长度的1000倍。所以细菌DNA在细胞内紧密缠绕形成致密的小体，称为拟核（nucleoid）.3.真核生物的染色体(核蛋白)

DNA双链以左手螺旋缠绕在组蛋白形成的八聚体核心上即核小体念珠状结构核小体链进一步盘绕、折叠形成染色质丝组成突环玫瑰花结螺线圈由螺线圈组装成染色单体。

真核生物的染色质丝组蛋白八聚体：H2AH2BH3H4各2个分子从DNA到染色质丝，DNA压缩了近100倍，若从DNA到最后凝缩成染色体，DNA压缩了近万倍。第二章核酸

引言：核酸概述第一节：核酸的种类、分布与功能第二节：核酸的化学组成第三节：核酸的分子结构第四节：核蛋白体第五节：核酸的重要理化性质与分析技术第六节:基因组学简介一、核酸的一般物理性质DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末状固体，都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。（用乙醇从溶液中沉淀核酸）DNA和RNA在细胞中常以核蛋白形式存在，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。

DNA核蛋白RNA核蛋白

0.14mol/LNaCl-+1-2mol/LNaCl+-DNA溶液的粘度很大，而RNA溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。

第五节、核酸的重要理化性质与分析技术二、核酸的两性性质及等电点与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有弱碱性基团碱基，因而核酸也具有两性性质。由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱基呈现弱碱性，所以核酸的等电点比较低。（当核酸分子内的酸性解离和碱性解离相等，本身所带的正电荷与负电荷相等时，此时核酸溶液的pH值即为核酸的等电点pI）如DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5。核酸在其等电点时溶解度最小。RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNA没有这种作用。三、核酸的水解1.核酸的酸解核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断（降解）。酸对核酸的作用因酸的浓度、温度和作用时间不同而不同。嘌呤碱基比嘧啶碱基易被水解下来。2、核酸的碱解DNA和RNA对碱的耐受程度有很大差别。例如，在稀碱（0.3-1mol/LNaOH）溶液中，在室温至370C条件下RNA几乎可以完全水解，生成2′-或3′-磷酸核苷；DNA在同样条件下则不受影响，若加温至1000C，4个小时也可得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。在RNA水解时，2′-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。2、核酸的酶解生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。以DNA为底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA为底物的RNA水解酶（RNases）。根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶。核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3′-端或5′-端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。（小球菌核酸酶即可外切又可内切）在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。四、核酸的紫外吸收在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组分定性和定量测定的依据。纯DNA:OD260/OD280=1.8RNA:OD260/OD280=2*样品中若含有杂蛋白及苯酚，则A260/A280明显降低。应用：纯度鉴定含量测定五．核酸的变性、复性与杂交1、核酸的变性（denaturation）与变性因素核酸的变性是指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链结构的过程。变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构(碱基顺序)保持不变。能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、盐酸胍和尿素等的存在均可引起核酸的变性。RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有DNA那样明显。利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。因为天然状态的DNA在完全变性后，紫外吸收(260nm)值增加25－40%。而RNA变性后，约增加1.1%。增色效应：变性后DNA对260nm紫外光的吸收率（A260）比变性前明显增加，这种现象称为增色效应.A260值增加粘度下降浮力密度增加旋光性质改变分子量不变2.DNA变性后的表现3.DNA的热变性和解链温度（Tm）用加热的方法使DNA变性叫做热变性DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将DNA的变性达到50%时，即增色效应达到一半时的温度称为DNA的解链温度（meltingtemperature,Tm）,Tm也称熔解温度或DNA的熔点。

一般DNA的Tm值在82-95C之间RNA的Tm值G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G、C含量，可通过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44Tm大小可反映出DNA的均一性：均质DNA的熔解过程发生在一个较小的温度范围内；异质DNA的熔解过程发生在一个较宽的温度范围内。Tm与介质中离子强度有关：DNA的保存应在含盐的缓冲液中温度/0CA2600.020.11.0mol/LKCl与介质中的离子强度有关盐溶液中的阳离子与DNA中的磷酸基团结合而中和负电荷，使双螺旋稳定，所以，离子浓度低，Tm低，溶解温度范围也宽，反之亦然。4、核酸的复性（renaturation）变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA复性后，一系列物理、化学性质将得到恢复。DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性，这一过程也叫退火（annealing)。分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性也与它本身的组成和结构以及介质的离子强度有关。DNA复性变性的两条呈单链状态的DNA，经复性又重新形成双螺旋结构时，其溶液的A260值比复性前减小，这种现象称为减色效应。5、核酸的杂交（hybridization）热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构,这样形成的新分子称为杂交DNA分子。DNA单链与互补的RNA链之间也可以发生杂交。核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。DNA-DNA杂交双链分子变性复性不同来源的DNA分子制备特定的探针（probe）通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。RNA的分子结构:mRNA的结构特点(真核与原核比较)tRNA的结构特点(三叶草和倒L)核酸的性质:(溶解度;紫外吸收;变性:增色\减色效应;解链温度;退火;分子杂交)六、

核酸分析技术核酸的分离纯化序列分析（略）破碎细胞（裂解）→去除蛋白质（SDS-苯酚抽提或用氯仿—异戊醇）。

振荡→冷冻离心→DNA或RNA溶于上层水相，变性蛋白在中间界面（反复多次）→

70%冷乙醇沉淀尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌抑制核酸酶(DEPC:焦碳酸二乙酯)(一)、

核酸的分离纯化超螺旋DNA或不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），浮力密度不同，用溴化乙锭-CsCl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来这一方法常用于质粒DNA的纯化溴化乙锭-CsCl密度梯度离心(Ethidiumbromide,EB)1、Southern印迹法DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上固定（80℃，4-6h）与放射性标记DNA探针杂交（高盐浓度，68℃，几小时）放射自显影带有DNA片段的凝胶变性（NaOH0.5mol/L）凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段的膜SouthernBlotting可用于DNA之间同源性分析鉴定技术2、

NorthernBlotting

研究对象是mRNA，探针一般是DNA。总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛）3、

WesternBlotting抗原与抗体的杂交研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。（二）核酸含量测定定磷法、定糖法和紫外吸收法（P79-80）（二）、序列分析Sanger双脱氧法化学测序法测定1000bp以上的DNA序列（三）、PCR与RT-PCR技术1、PCR技术：亦称聚合酶链反应（Polymerasechainreaction,PCR），是以DNA聚合酶在体外扩增DNA片段技术，经历DNA变性、退火、聚合酶催化DNA链的延伸等三个步骤周而复始的过程（经过25-35轮循环DNA可以扩增106-107倍）。也用于RNA的扩增。2、RT-PCR：称反转录PCR（reversetranscriptionPCR）即将RNA模板的反转录与cDNA的聚合酶链反应（PCR扩增）相结合。第六节:基因组学简介

基因：Gene,

DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列，其编码产物是RNA或多肽链。基因包括非编码DNA调节序列、编码DNA序列和间隔序列。基因组：Genome,

生物细胞中单套染色体的所含DNA序列的全部组成。基因组学：genomics,基因组学的概念是1986年由Thomas和Roderick首先提出来的，它是一门涵盖了对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录图谱）、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的科学，其研究内容包括结构基因组学和功能基因组学。

相异：试比较核酸、蛋白质一级结构的不同，写出各自基本结构单位的通式比较项目蛋白质核酸基本结构单位连接的键主链的组成（不变成分）侧链（可变成分）基本结构单位通式核苷酸氨基酸肽键3ˊ，5ˊ-磷酸二酯键由-N-C-CO-反复循环组成由戊糖+磷酸反复循环组成R侧链碱基H2N-CH-COOHRH2PO3-O-H2C(O)HHON一般将水解时，能够释放20．92kj／mol能量的化合物都叫做高能化合物。ATP水解时释放的能量是30．