微生物标本接种

关于微生物标本接种第1页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三内容血培养尿培养痰培养脓液脑脊液前列腺STD厌氧培养第2页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三血培养增菌培养商品血培养瓶成人瓶、儿童瓶、中和抗生素瓶无菌操作采集血标本接种到培养瓶后，轻轻混匀以防血液凝固。立即送检，切勿冷藏。采血量成人采血量是10～20ml，儿童1～5ml。血液和肉汤之比为1:5～1:10。35℃培养5-7天第3页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三第4页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三第5页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三体积%阳性血培养结果vs.采集的套数%99%89%80%真阳性20ml/套MayoClinicStudy第6页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三用于培养的血液体积体重

磅

千克体积(ml)/穿刺总量/2次穿刺1%全血体积%总血液体积<19<9122ml1%19-309-14366-10ml1-3%31-6015-2751010-20ml1-2%61-9028-41102020-30ml1-2%>90>422040>40ml1-2%第7页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三采集血培养时间的重要性9%+14%+9%+11%+发热高峰前12-2.5小时发热高峰前2.5-0.5小时发热高峰期间发热高峰后1-12小时166病人105病人199病人258病人Thomsonetal.1991.ASCP.MayoClinicStudy第8页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三立即获得足够血液并且开始抗生素治疗从不同部位获得2-3套血培养(40-60ml血液)最好在5分钟内采集#1#2第9页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三确定检测阳性的培养时间阳性报警时间第10页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三随着时间推移败血症病原菌的变迁%住院患者血培养阳性结果#1

pathogenFromUW,MadisonandG.WashingtonUniv.,St.Louis第11页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三血培养存在的主要问题如果皮肤定植的细菌没有被杀死，这些细菌将通过针头被吸入血培养瓶并在瓶中生长这些细菌(主要为凝固酶阴性葡萄球菌)引起导管相关性败血症(住院患者血培养第一位)医生不能将真的凝固酶葡萄球菌感染和皮肤定植菌“污染”相区分，因此他们用万古霉素治疗患者第12页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三皮肤凝固酶阴性葡萄球菌定植于输液管第13页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三皮肤不是无菌的;定植细菌“污染”血培养第14页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三葡萄球菌在塑料CVC表面生长形成生物膜第15页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三污染细菌血培养污染定义为在几次血培养中单个血培养下列细菌阳性:凝固酶阴性葡萄球菌棒状杆菌微球菌丙酸杆菌

芽孢杆菌第16页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三血培养污染vs.皮肤消毒%污染StudiesfromBaylor,Nashville,&France第17页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三血培养一旦提示阳性结果，涂片行革兰染色，根据镜检结果决定转种羊血平皿及巧克力平皿上，并分别放置普通培养箱及CO2烛缸内35℃～37℃孵育培养需氧和兼性厌氧菌；转种布氏血琼脂，厌氧环境培养厌氧菌；转种沙保罗培养基，培养真菌。将革兰染色结果立即向临床电话初级报告。待细菌鉴定及药敏结果出来后再向临床发出最终报告。第18页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三血液培养【特别提醒】

厌氧菌从血液中培养出厌氧菌的比率相对比较少，不推荐每个病人常规增加一个厌氧血培养，但如果必要，选用其配套的厌氧培养基来培养厌氧菌。

营养苛刻的细菌（FastidiousBacteria）布鲁氏菌属可以在常规血液培养基中生长，并且尽管可以在三天内分离到，但是推荐培养21天，且有必要进行末次接种。HACEK群细菌—嗜泡沫嗜血杆菌（Haemphilusaphrophilus）、放线共生放线杆菌（Actinobacillusactinomycemcomitans）、人心杆菌(Cardiobacteriumhominis)、侵袭埃肯菌(Eikenelluscorrodens)和金氏杆菌（Kingellakingae）与细菌性心内膜炎有关，常规血培养基中可以分离，但培养14天和进行肉汤末次接种会更有效。

第19页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三血培养常规血液培养基不能分离钩端螺旋体。分枝杆菌（Mycobacteria）使用常规血培养基不能分离。导管头培养导管头是为了明确细菌来源。最常用的方法是半定量的方法，方法是用5cm长的导管末端部分在血液琼脂平板上滚动4次。培养物出现15个以上的菌落，提示有潜在的导管相关性感染。第20页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三导管相关感染的诊断敏感性和特异性检测管腔内的&外周细菌不需要移走导管可靠性和可重复性易操作快速回报感染的微生物可以分离对患者安全关键点:患者必须有菌血症第21页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三检测导管相关感染移走导管MakiRoll(半定量)超声波降解和稀释(定量)通过管腔抽吸(定量)保留导管管腔刷定量培养(CVC&外周血)达到阳性的时间(CVC&外周血)第22页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三哪部分用于培养第23页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三Maki滚动法第24页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三导管尖阳性培养结果第25页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三苛养菌不要放置常规血培养>5天由如下微生物引起的可疑的败血症或心内膜炎:霉菌(组织胞浆菌,

镰刀菌,等等秕糠马拉癣菌军团菌属巴尔通体新型隐球菌Q-热惠普尔病支原体属其他病原菌

3分离管咨询ID医生血清Ag凝集+分离培养第26页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三干预措施可以减少导管相关性感染手消毒

用洗必泰进行皮肤消毒

在穿刺过程中完全无菌操作

锁骨下静脉穿刺

移去不必要的中央静脉插管血管内导管相关性感染预防指南.MMWRRecomRep2002:51(RR10)1-29soap第27页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三尿道感染每年850万例尿路感染,90%为女性1/2.5个妇女在一生中会得UTI下行性感染：血流肾脏膀胱（金黄色葡萄球菌，酵母菌，结核分枝杆菌）上行性感染：尿道膀胱肾盂血流第28页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三AnatomyofUrinaryTract

尿路的解剖图侧面图膀胱耻骨子宫颈尿道输卵管卵巢子宫阴道直肠肛门第29页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三综合病症尿道炎或急性尿路综合征膀胱炎-膀胱的炎症肾盂肾炎-肾脏的炎症

Age年龄5102030//60有症状的无症状的第30页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三尿路感染病原菌第31页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三大肠埃希菌与膀胱上皮细胞相互作用伞状粘附膀胱上皮细胞第32页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三尿液运输方法无需冷藏第33页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三有症状妇女的尿路感染诊断性试验第34页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三尿液革兰染色-革兰阴性杆菌第35页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三传统的尿培养使用校准过的接种环(0.001or0.01ml)垂直插入装有尿液的无菌容器中

在琼脂平板上分区划线：血平皿，麦康凯平皿或CLED平皿大多数尿路病原菌能在血平皿上生长麦康凯平皿有鉴别功能，为革兰阴性杆菌的选择性培养基第36页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三尿培养的划线方式第一区=50,000cfu/ml第二区=75,000cfu/ml第三区=100,000cfu/ml沿中心线向下=50,000cfu/ml长向边缘=100,000cfu/ml第37页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三

尿培养的培养基5%血平皿（美国用羊血，欧洲用马血）伊红美兰平皿（EMB）大肠埃希菌为金属绿麦康凯平皿–LFvsNLF胱氨酸-乳糖-低电解质平皿（CLED）显色平皿(BBL公司的CHROMagar，HardyBluEcoliBiplate)CUTI（Oxoid公司）;CPSID2（生物梅里埃公司）;UriSelect（Biorad公司）;Rambach;others第38页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三蛋白胨，酵母提取物，色原物科玛嘉显色培养基（BBL）大肠埃希菌肠球菌无乳链球菌腐生葡萄球菌第39页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三同样的接种物在科玛嘉显色培养基（BBL）上生长大肠埃希菌，肠球菌和变形杆菌在血平皿上生长CHROMagar™Orientation(BBL)第40页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三chromIDCPS-生物梅里埃公司的产品快速鉴定大肠埃希菌，变形杆菌和肠球菌可分离所有尿道病原菌更好的可操作性更好的鉴定能力更高的可靠性第41页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三尿培养【操作步骤】1．培养皿放置至室温，先充分摇匀尿液2．用1μl定量接种环或用微量移液器无菌吸取10ul尿液接种于羊血平皿和MAC上，然后用无菌接种环划线涂布，置35℃，最好在5～10％co2环境下，孵育18～24小时3．次日观察结果，根据诊断标准进行诊断，阳性结果做细菌鉴定和药敏。第42页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三尿培养【定量标准】用1μl接种环，结果×1000cfu/ml；用10μl接种环，结果×100cfu/ml。菌计≥10万cfu/ml，继续鉴定和药敏。降低标准的情况：幼儿、儿童或男性的确定的尿路感染，其尿标本定量也可＜10万cfu/ml；插导管的患者、最近用过抗生素者、大量喝水者、伴发脓尿和有症状者、有尿路阻塞或由于血源性传播而患有肾盂肾炎者，其尿标本定量也可＜10万cfu/ml；患有尿道综合征的性活跃的年轻女性，其尿标本定量也可＜100cfu/ml。第43页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三评价尿培养的标准病人标本特征有意义的菌落形成单位/ml（非皮肤污染）无症状者清洁留取100,000有症状者，不固定的清洁留取10,0001-2种机会致病菌。若多于2种则认为尿液被污染有症状者，性活跃女性清洁留取100个纯菌落肠杆菌科菌男性清洁留取1000个机会致病菌任何人内置导尿管100,000任意数量机会致病菌任何人通过直接导管获得100任意数量机会致病菌任何人通过外科手术从肾脏获得任意数量（肉汤增菌，厌氧菌）任何人Percutaneousbladdertap经皮膀胱吸取任意数量（肉汤增菌，厌氧菌）任何人Any任何标本任何数量金黄色葡萄球菌不同人有争议任何数量的酵母菌第44页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三尿培养-注意事项标本留取严格执行无菌操作。不要将尿液标本接种于增菌肉汤培养基中。清洁中段尿标本不要进行离心处理。尿液标本原则上不做厌氧培养。尿液收集后应立即送检，不能送检者可置4℃～8℃冰箱储藏，储存时间≤24小时。患者应在用药前或停用抗生素后至少三天留取尿液，尿液中勿加防腐剂。第45页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三痰培养-操作步骤取适量痰液化剂放入痰标本盒内混匀放置30分钟，

用无菌环挑2～3环标本，分区划线接种于羊血平皿或沙保培养基上、Mac置35℃孵育18～24小时,巧克力平板5％co235℃孵育18～24小时。观察结果，根据细菌生长情况进行鉴定及药敏。挑取脓液部分涂片，革兰染色镜检。判断标本是否合格。第46页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三痰培养-操作步骤痰标本涂片染色显微镜检查的分类：判断标准比较简单的方法就是确定鳞状上皮细胞数量：细胞数＞10/低倍视野，说明混有痰液。细胞数/低倍视野WBC＜10鳞状上皮细胞＞25不合格WBC

10～25鳞状上皮细胞＞25不合格WBC＞25鳞状上皮细胞＞25不合格WBC＞25鳞状上皮细胞10～25可接受WBC＞25鳞状上皮细胞≤10合格WBC≤25鳞状上皮细胞≤25可接受?第47页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三用革兰氏染色来评估呼吸道标本是否合格>10鳞状上皮细胞/LPF——拒收！弹性纤维，中性粒细胞多，鳞状上皮细胞少，有代表性的好标本第48页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三形态学鉴别要诀——球菌革兰阴性双球菌——肾型豆子样，平行纵轴排列=奈瑟菌属革兰阳性双球菌——拉长，单个纵轴，末端呈点状（柳叶刀状）=链球菌（肺炎链球菌）第49页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三实际革兰氏染色革兰阴性双球菌：在生殖道标本或脑脊液中多为奈瑟菌属；在下呼吸道分泌物中提示为卡他莫拉菌革兰阳性双球菌提示肺炎链球菌第50页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三形态学鉴别要诀——球菌革兰阳性球菌成对，成链——较小、拉长的、从不4联排列=链球菌属革兰阳性球菌呈堆排列，通常很圆，细胞较大，不拉长，可成对，但链不超过4个细胞。可能因脱色过度呈革兰阴性。但如果不是肾型话不可能为革兰阴性菌。第51页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三链状的革兰阳性球菌：提示链球菌短链，<6个细胞，提示肠球菌或B群链球菌；肺炎链球菌血培养中长链的革兰阳性球菌（>6个细胞）提示化脓链球菌或草绿色链球菌革兰氏阳性球菌第52页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三更多的革兰氏染色形态学呈堆或四联排列的革兰阳性球菌提示葡萄球菌第53页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三革兰阳性杆菌的形态学鉴别要诀革兰氏阳性杆菌可以很规则，如果是需氧菌则非常可能是芽胞杆菌属，如果是厌氧则非常可能是梭菌属。如果很小，可能是不呈链状的李斯特菌属，如果呈链状则很可能是乳酸杆菌属。革兰阳性不规则的杆菌（多形态），一端比另一端粗。常相互吸附或呈篱笆样排列=棒状杆菌属或丙酸杆菌属第54页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三细胞内细菌第55页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三革兰阴性双球菌第56页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三多形态提示混合厌氧菌感染第57页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三外型奇特的酵母菌，不像米老鼠的耳朵或白色念珠菌椭圆形孢子。报告“真菌成分和酵母样细胞”。不要遗忘革兰阴性杆菌。第58页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三痰培养-特别提醒洋葱伯克霍尔德菌是一种重要的呼吸道致病原，可引起囊性纤维化。常规培养基中生长良好。诺卡菌（Nocardiaspp）诺卡菌是一种重要的呼吸道致病菌。培养的标本应立即进行实验室检查，如果延迟时间不长，4℃保存也可以接受。标本革兰染色检查，可以发现小的革兰阳性菌，外观呈分枝状、丝状或球状。没有特异的培养诺卡菌的培养基，可用心浸液沙氏葡萄糖琼脂、脑心浸液琼脂、羊血琼脂或胰蛋白大豆琼脂。25-37℃孵育3周，37℃更好。鼻咽部—金黄色葡萄球菌确定金黄色葡萄球菌带菌者，用聚酯头拭子从前鼻孔取鼻咽分泌物，接种5％羊血，35℃孵育2d。第59页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三痰培养-特别提醒鼻咽部—脑膜炎奈瑟菌采集鼻咽拭子标本，接种血琼脂、巧克力琼脂或MTM培养基，5％CO2的潮湿环境，35℃孵育72h。喉—A群链球菌喉部标本最常用于诊断A群链球菌喉炎，标本接种血琼脂5～10％CO2环境，35℃孵育48h。第60页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三脑脊液-操作步骤将脑脊液标本经离心（≥1500g，15min）后，将上清液倒入消毒的试管，留下0.5ml沉淀和液体，充分混匀。无菌吸取标本20～30ul分别划线接种于羊血平皿、巧克力平皿，分别置烛缸和普通培养箱内35℃孵育24～48小时。应同时制备涂片，革兰染色镜检。观察结果，有细菌生长者进行细菌鉴定和药敏。第61页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三脑脊液-操作步骤也可将脑脊液标本注入增菌培养瓶内先行增菌培养，具体操作参见血液培养。采集CSF是为了诊断脑膜炎，细菌性脑膜炎分为急性和慢性两种。急性脑膜炎在感染后24h内产生症状，通常由化脓性细菌引起，最可能的病原菌根据患者年龄和疾病是否由社区或医院感染而有变化。包括：B群链球菌、脑膜炎奈瑟菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌和流感嗜血杆菌等。慢性脑膜炎（症状持续至少4周）的典型致病菌包括：结核分枝杆菌、梅毒螺旋体、布鲁氏菌、问号钩端螺旋体和博氏疏螺旋体。脑脊液离心涂片抗酸染色，应用3000～3600g30min。厌氧菌很少引起脑膜炎，因此不需要对脑脊液常规进行厌氧菌培养。厌氧菌常与脑脓肿形成、硬脑膜下积脓和硬脑膜外脓肿有关。第62页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三脓液培养-标本要求临床医生根据需要无菌操作取材，比较理想的方法是用注射器抽取脓性物质。从脓肿底部或脓肿壁的取样，效果最好。如果不能获得抽取物，也可以用拭子从伤口深处采集渗出物，至少采集两个拭子，一个用于涂片染色，一个用于培养。厌氧培养最好不用拭子。将采集的标本置于无菌试管内，立即送检。厌氧培养标本取材应迅速、准确，禁止接触空气，盛标本容器内要排尽空气第63页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三脓液培养【标本处理】标本划线接种于羊血平皿，35℃孵育24～48小时。同时涂片革兰染色。厌氧培养接种布氏血琼脂，厌氧环境培养。观察结果，有细菌生长者进行细菌鉴定和药敏。第64页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三前列腺培养【标本要求】

首先用无菌等渗盐水的拭子洗净尿道口。

由临床医生行前列腺按摩术留取标本于无菌试管内，立即送检。【标本处理】

将标本划线接种于羊血平皿，35℃孵育24～48小时。观察结果，有细菌生长者进行细菌鉴定和药敏。【注意事项】留取标本注意避免污染。疑为性传播疾病做相应的STD培养。第65页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三淋球菌培养【操作步骤】待检物划线接种于专用MTM平皿上，将接种好的平皿置烛虹中置35℃温箱孵育48小时；取出平皿，挑取可疑菌落进行鉴定；

鉴定：涂片革兰染色；氧化酶试验；β－内酰胺酶试验；生长试验；糖发酵试验。第66页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三支原体培养从4~10℃冰箱中取出所需数量地培养基瓶，恢复液及鉴别、定量、药敏板，使其在接种前接近室温。旋下外盖，取下丁基橡胶内塞，然后挤滴加入恢复液，培养基迅速融解、表面至标签上缘处（约1.8ml）应随即、直接往培养基瓶接种标本（如果延迟接种，则标本置室温不超过2小时；在4~10℃时不超过8小时）混匀后，从瓶内分别取50微升（1大滴）加到鉴别、定量、药敏板的每一小孔中然后，在每孔正中上方，准确、挤滴加入一滴石蜡油。将鉴别、定量、药敏板置36℃孵育箱中培养12小时后，即可开始观察结果;不见阳性者，则连续培养时间应延长至48小时结束。第67页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三临床细菌室厌氧菌培养基本程序厌氧培养基本设备厌氧标本采集和运送步骤厌氧菌的分离和鉴定步骤厌氧菌的报告厌氧菌的药敏试验厌氧菌的菌种保存第68页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三厌氧培养基本设备输送琼脂Amies琼脂(41998、41999)难辩梭菌琼脂(43213)厌氧培养基厌氧培养装置厌氧气袋厌氧盒或厌氧罐厌氧培养箱厌氧菌鉴定方法第69页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三需要准备的厌氧菌培养基斯氏琼脂+5%羊血：适用所有厌氧菌生长斯氏万古霉素+5%羊血：适用革兰阴性厌氧菌难辩梭菌选择培养基(CCFA)：分离难辩梭菌改良厌氧血平皿第70页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三改良厌氧血平皿配制血琼脂基础(按1000ml量）半胱氨酸：0.4克氯化血红素(5mg/ml):1ml1%维生素K1:0.1ml加热溶解冷却后调整pH7.4高压灭菌后冷却至50℃时加入5-10%的脱钎维羊血混合后倾注平皿。营养好可供大多数厌氧菌生长质量控制：产黑色素普雷沃菌形成典型菌落和色素产气夹膜梭菌有双圈溶血。第71页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三厌氧标本的选择、采集和运送可疑厌氧菌感染特征感染局部产生气体分泌物有恶臭分泌物带血或呈黑色粘膜周围的感染如肛周、口腔、鼻窦、咽颊等细菌培养阴性，但有菌血症表现长期使用氨基糖苷类抗生素，但无效者有基础疾病免疫低下者第72页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三需做厌氧血培养的高危人群肠脓毒症、女性生殖道感染、褥疮及呼吸道感染患者ICU患者或近期做过腹部外科手术的患者严重烧伤和外伤患者伴有严重心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、移植和免疫抑制患者老年患者临床高度怀疑有厌氧菌感染的患者

绝大多数住院患者需要做厌氧血培养第73页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三正确地收集标本不能做厌氧培养的标本：咽、鼻、尿道或直肠拭子。咳出的痰，通过支气管镜取的分泌物排出或导出的尿及胃内容物。粪便（除难辨梭菌）第74页，共85页，2022年，5月20日，18点22分，星期三可做厌氧培养的标本从未开放的脓肿抽取脓液尿：从耻骨联合上方做膀胱穿刺吸出从肾造口管收集的气管切开吸取的肺分泌物女性生殖器：后穹隆穿刺穿刺抽出的胸腔液、腹腔液、脑脊液窦道标本：可插入小导管用注射器吸出窦道损伤部位取材做活组织检查第75页，共85页，2022年，5月20日