基因打靶技术课件

基因打靶技术及研究进展

2007诺贝尔奖专题

王廷璞瑞典卡罗林斯卡医学院10月８日宣布，２００７年诺贝尔生理学或医学奖授予来自美国的马里奥·卡佩奇、奥利弗·史密斯和来自英国的马丁·伊文思因胚胎干细胞研究获该奖项。

这三位科学家是因为“在涉及胚胎干细胞和哺乳动物DNA重组方面的一系列突破性发现”而获得这一殊荣的。这些发现导致了一种通常被人们称为“基因打靶”的强大技术。这一国际小组通过使用胚胎干细胞在老鼠身上实现了基因变化。

马里奥·卡佩奇马丁·埃文斯奥利弗·史密斯

基因打靶：是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内来研究基因及基因组的功能。基因敲除：是使基因组中某个/某几个基因或基因的顺式元件产生缺陷，从而在突变体内丧生正常的功能，来推测这些基因或元件原来在体内的功能。基因敲入：在个体基因组中定点加入某个/某几个基因或顺式元件，使之表达或发挥作用，从而研究该基因或顺式元件在体内的功能。

基因打靶流程图一、基因打靶研究的背景目前的基因转移技术，如显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀及逆转录病毒载体感染等方法，已能有效地将外源基因导入靶细胞内。但这些导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的，可能导致下面几种情况出现：为避免上述情况的出现，最好的途径就是将外源基因导入预先确定的位点。即对细胞内靶位点进行定点修饰——基因打靶，而研究该基因的功能或在生物发育中的作用。随着人类及四十多种微生物基因组测序的完成，发现了大量未知功能的基因，应用基因打靶技术对这些新基因进行靶向修饰，是研究其功能最直接最有效的手段。因此，基因打靶就日益成为继基因转移技术后亟待发展的新技术。早在20世纪初，Morgan等人通过对果蝇眼色遗传的分析揭示了同源染色体之间的DNA重组是产生交换的基础。1985年在哺乳动物细胞中实现了同源重组。基因打靶通常是指用含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。胚胎干细胞注入体内与完整胚胎形成嵌合体后，可以发育形成包括生殖细胞在内的一系列成体组织；正是由于胚胎干细胞的特殊功能，ES细胞基因打靶技术已被广泛地应用于建立转基因动物之中。从80年代到90年代初，小鼠ES细胞基因打靶技术已发展到成熟阶段。1984年，Bradly等成功地用显微注射法将ES细胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，获得生殖系嵌合体，经过适当的交配，获得了源于ES细胞系的纯系小鼠。此实验首次证实体外培养的ES细胞能在体内分化发育成生殖系嵌合体并可获得小鼠纯合体子代。1987年，人们利用ES细胞技术建立了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)基因敲除(Geneknockout)的动物模型。此后，这项技术得到了普遍应用和长足发展。三、打靶载体的构建基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等非同源序列，其中同源序列是同源重组效率的关键因素。基因打靶载体有基因插入型载体(Gene-insertionvector)和基因置换型载体(Gene—replacementvector)。插入型载体中与靶基因同源的区段中含有特异的酶切位点，线性化后，同源重组导致基因组序列的重复，从而干扰了目标基因的功能。置换型载体进行线性化的酶切位点在引导序列和筛选基因外侧，线性化后，同源重组使染色体DNA序列为打靶载体序列替换。大多数基因敲除突变都采用置换型载体进行基因打靶。四、外源DNA导人的方式外源DNA导人的方式主要有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等。目前应用最广的是显微注射法。Capecchi报道，用显微注射法导入可得到很高的转染效率，占接受外源DNA细胞的10％~20％，但显微注射每次只能注射一个细胞，而电穿孔法可同时使许多细胞得到转染。Mansour等研究发现电穿孔可使1％的ES细胞稳定转染。逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲合力，可用于时空特异性基因打靶，在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展潜力。五、基因打靶的筛选方法（1）正负双向选择系统(positive-negative-selection,PNS)：为了更好地筛选发生同源重组的克隆，1988年Mansour等人设计了PNS,解决了定点整合与随机整合的鉴别问题。同源重组时，只有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外部分将被切除。随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体内。置换型载体含有正负选择基因各一，正选择基因多为neo基因，位于同源区内，其在随机整合和同源重组中均可正常表达。G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。Ｇ418的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。用G418作正筛选，选出含有neo基因的细胞株，再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk基因的细胞株，保留未含有tk基因的同源重组细胞株。此方法是目前应用较广泛的一种策略。正向筛选标记基因Neo具有双重作用，一方面导致靶基因的插入突变；同时作为重组细胞的正向筛选标志，该基因产物可使细胞在含有新霉素的培养基中生长。除了上述方法外，还可用PCR及Southern杂交法进一步筛选及鉴定中靶细胞。（2）正相选择法（positiveselectionmethod）麻省理工学院Sharp教授的研究组独辟新径，建立了一种新的同源重组选择方法—正相选择法。这种选择法适用于在靶细胞内正常表达的基因的定点突变。其主要程序是：将选择标记基因neor的启动子和起始密码剪切掉，再嵌合入打靶载体中与靶位点同源的序列内，将打靶载体转染进靶细胞，可能出现下面几种情况：①打靶载体不整合入靶细胞基因组，将随传代而丢失；②外源打靶序列随机整合，由于neor基因缺失了其自身的启动子和起始密码，整合位点周围亦无启动子，使neor基因的表达受阻；③虽是随机整合，但其整合位点侧翼序列在其它基因的启动子能启动neor基因的表达；④外源打靶载体与靶位点发生了同源重组，则neor基因可借助靶基因自然存在的其和起始密码的作用而呈现表达活性。因此，如用G418筛选，则抗性细胞中将只包含后两种可能情况，根据这两种情况下基因组DNA酶切图谱的不一致，用Southern印迹杂交即可检测出同源重组的克隆。六、基因打靶的策略（一）完全基因剔除(completeknotk-out)的策略在ES细胞中进行基因打靶最常用的策略依然是使用PNS载体。借助于阳性选择标记基因通常被插入靶基因功能最关键的外显子中，或通过同源重组删除靶基因最重要的功能域，实行靶基因的完全剔除。阳性选择标记基因常采用β-半乳糖苷酶基因（lacZ），将其以正确的读框插入靶基因的外显子中，除了剔除靶基因外，通过分析β-半乳搪苷酶的活性可以研究靶基因表达的时空顺序。lacZ基因5’端若携带内源核糖体插入位点(internalribosomalentrysites，IREs)，则lacZ基因的插入会不受时相的控制而得到正确的翻译。此外，由于阴性选择基因(多为tk基因)可能在转染及整合过程中失活，导致打靶载体随机整合的ES克隆得以生长，因而PNS载体依然得到较多随机整合的ES克隆。（二）大规模随机基因剔除—基因捕获(genetrapping)用常规方法进行基因打靶，必须针对靶位点在染色体组文库中筛选相关的染色体组克隆，需耗费大量的时间和人力。利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工作及费用，更有效和更迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。典型的基因捕获载体包括一个无启动子的报道基因，通常是neo基因。neo基因插入到ES细胞染色体组中，并利用捕获基因的转录调控元件实现表达的ES克隆可以很容易地在含G418的选择培养基中筛选出来。从理论上讲，在选择培养基中存活的克隆应该100％地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通过筛选标记基因侧翼cDNA或染色体组序列分析来获得。用基因捕获法在单次实验中可以获得数以百计的带有单基因剔除的ES克隆。但此方法的缺点是只能剔除在ES细胞中表达的基因。随着应用哺乳动物体细胞克隆新个体的成功实现。在体细胞中应用基因捕获剔除更多在发育晚期才表达的基因，其后通过核移植技术获得带有突变基因的动物个体、这不失为一种可以弥补以上缺陷的办法。此外用基因捕获法进行基因剔除的另一个缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰。（三）精细突变的引入人类疾病中许多是由于基因功能丧失引起的，也有许多是由于基因过表达或功能获得（gainoffunction）引起的。对后者就无法用基因剔除的方法获得相应的疾病模型。为此，研究者发明了各种可以将诸如插入终止密码子或替换某个氨基酸之类的精细突变引入小鼠基因组中的方法。早期的研究者采用的方法主要有两种，一是将不含选择标记基因的打靶载体直接经显微注射法引入ES细胞，然后用PCR分析鉴定同源重组克隆；另一种是用带有精细突变但无选择标记基因的打靶载体与仅含标记基因的载体经电穿孔共转染ES细胞。这两种方法在技术上有很大局限性，现在基本上已不再使用。目前较为常用的方法主要有“HitandRun”、“TagandExchange”以及基于重组酶系统的方法。（1）打了就走策略(HitandRun法)HitandRun法，也称进退策略。这一方法包括两次同源重组：第一步（Hit）用插入型载体进行同源重组，这样会在靶位点插入带有突变的基因组序列以及载体骨架，载体骨架上带有两个筛选标记（如正筛选标记基因neo和负筛选标记基因tk）。第二步（Run）利用tk抗性筛选，富集为数不多的发生了染色体内重组的克隆。染色体内重组去除了含有负筛选标记基因的载体序列，由于负筛选标记基因的消失，细胞就恢复了对负筛选药物的抗性，因此，回复突变体可以在负选择培养基中存活下来。为了便于应用Southern方法对中靶克隆进行筛选，可对靶基因突变位点的相邻核苷酸进行改造，产生一个新的限制性内切酶位点而不影响相邻氨基酸的组成。有时可以通过改变碱基组成使突变基因序列和野生型基因序列间的差异达到最大，以便于用不同的PCR引物检出突变基因和野生型基因。Hasty等用此方法在小鼠ES细胞同源异型基因簇Hox-2.6基因3’端引入了一个终止密码子，得到了减少43个氨基酸的突变蛋白。HitandRun法的不足之处是：第一，此过程中第二步染色体内的同源重组无法精确地控制，可能会导致失去携带突变的同源序列，而留在基因组中的仍是未修饰的内源片段。第二，整个过程需要采用两种培养基分别进行先后两次筛选。第三，无法同时引进多个位点突变。另一类采用置换型载体进行基因打靶、将突变经过两次同源重组引入靶基因的策略部分地弥补了这些缺陷。（2）双置换法(DoubleReplacement)最早提出这一设想的研究者称其为“In-Out”法。第一步用含有Hprt基因的打靶载体转染Hprt–ES细胞，由于Hprt基因双侧是靶基因的同源序列。通过在HAT培养基中筛选并用PCR进行基因组分析，筛选发生同源重组、Hprt基因整合到基因组中的阳性克隆。第二步，用只携带突变同源序列的打靶载体转染第一步获得的Hprt+ES细胞。同源重组发生后，突变序列整合入基因组，Hprt被置换出来。Hprt–细胞可在6-GT培养基上筛选并用PCR进行分析。这种方法的优点在于，第一步获得的Hprt+ES细胞，除了可用于产生普通的基因剔除小鼠外，更可作为将不同突变引入靶基因的基础。1995年，Moore等将这种方法稍加改进，称其为“双置换法”（doublereplacement）。他们用这种方法将5种突变分别引入Prion蛋白基因，探讨研究人类Prion蛋白相关疾病及其基因治疗的可能性。（3）“标记和置换”法(TagandExchange)“标记和置换”的策略与双置换法有许多共同之处。它是用两个不同的置换型载体进行两次连续的基因打靶完成的。通过第一步的同源重组插入正负筛选标记基因（如neo和tk）对靶基因进行“标记”。第二步打靶用在同源序列上带有精细突变的载体来转染第一步得到的ES克隆，带有精细突变的同源序列将置换下被“标记”的靶基因。Askew等用标记和置换法成功地将ES细胞内源的Na+-K+-ATP酶基因改变了两个氨基酸，使其既能维持转膜运输的离子泵功能，又能抵抗强心类糖苷的抑制作用。（4）利用Cre-LoxP系统引入点突变近年来，导入精细突变最常用的方法应首推以Cre-LoxP为基础的重组系统。Cre-LoxP位点特异重组酶是由酵母或细菌所编码、可识别特异靶位点并在其上催化断裂和重接、从而产生精确的DNA重组的一类酶。根据序列相似性，重组酶可分为Int家族（integrasefamily）和resolvase-invertasefamily。Cre是来源于P1噬菌体cre基因所编码的一个38ku蛋白，属于Int家族，它可识别P1基因组上由34bp核苷酸序列构成的称为LoxP的特异靶位点，并根据Loxp的方向性，可在各种底物（超螺旋环状型，松弛型和线型DNA分子）上介导三种不同的重组事件：①相位点之间序列的缺失；②插入序列；③两个反向位点之间序列颠倒。需指出的是，Cre重组酶所催化的是一个可逆的重组事件，重组的程度与重组酶的表达水平相关。此外在位点特异重组反应的任何阶段上，不需要任何辅助因子参与；该特点使Cre/LoxP位点特异重组酶系统成为可在各类种属上进行意向DNA操作的有用工具。应用Cre-LoxP系统将精细突变导入基因组的策略为：在置换型的打靶载体中，正负筛选标记基因两侧各放置一个LoxP序列，并被置于靶基因的内含子中。携带精细突变的外显子位于载体一侧的同源臂上。经过同源重组和突变的鉴定后（如利用新产生的酶切位点来鉴定），通过转染将Cre重组酶表达质粒导入中靶ES细胞。（四）条件性基因打靶Cre-loxP系统、FLP/FRT系统和条件性基因敲除Cre/loxP：来自P1噬菌体，Cre重组酶基因和loxP序列位于P1噬菌体基因组内，loxP是Cre酶的识别序列。Cre（FLP）重组酶有删除/整合、倒位、转位等功能基本策略是通过类似于基因敲除的方法将两个loxP位点同向引入到要删除的基因片段两侧。FLP/FRT：来自酵母，FRT是FLT酶的识别序列5’ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT3’3’TATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATA5’CreCre反向重复序列ATAACTTCGTATATATACGAAGTTATGCATACATCreCreloxP反向重复序列5’ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT3’3’TATTGAAGCATATCGTATGAATATGCTTCAATA5’CreCre+loxP序列及其酶切示意图“条件性”主要由控制Cre酶产生方法来实现，采用不同时空表达专一性的启动子来表达Cre酶，就能在小鼠发育的特定阶段或特定组织达到某基因敲除的目的。条件基因敲除大大开拓了基因敲除的应用范围，并赋予基因敲除的新的涵义。条件性基因敲除的意义：建立条件性基因敲除需要分三步进行：1、通过同源重组的方法在待删除片断的两侧引入同向的loxP位点（此步同ES细胞的打靶，只是载体不同），用Cre的瞬时表达载体转染ES细胞克隆，在Cre酶下发生DNA重排。2、构建一个在特定组织和发育阶段表达Cre酶的转基因小鼠3、将前两步获得的小鼠杂交，在子代小鼠转筛选特定组织中基因敲除的小鼠。条件性基因敲除的打靶载体和技术流程示意基因敲入基因敲入：用一个设计好的基因片段来取代基因组中的特定片段和将一个设计好的基因片段插入到基因组的特定片段中，这一技术也是建立在Cre－loxP系统基础上。基因敲入有两条途径删除选择标记基因：第一条途径是引入loxP位点的同源重组后，引入Cre基因瞬时表达载体，在ES细胞内瞬时表达Cre，删除两个loxP位点之间的序列，然后用该ES细胞建立相应的小鼠品系。第二条途径是先引入loxP位点的ES细胞建立一个小鼠品系，与一种Cre转基因小鼠品系杂交，最后建立基因敲入的小鼠品系。基因敲入的打靶载体和技术流程示意条件基因打靶有如下特点：①通过条件性基因敲除，研究完全敲除具有致死效应的基因的功能以及基因在特定的组织细胞或个体发育特定阶段的功能。②通过条件性基因激活，实现转基因的可控制性表达。③通过Cre切除条件性基因修复(Creexcision-conditionalgenerepair)，进行基因的可修复性敲除，以研究一个基因的多种功能。（五）时空特异性基因打靶完全基因剔除将靶基因自产生时刻起在所有的组织器官中终生灭活。许多在成体器官发育中具有重要功能的基因，如肿瘤抑制基因Brca1、Brca2、Dpc4/Smad4等，由于在胚胎早期表达，基因剔除后往往导致小鼠胚胎早期死亡，使得研究者无法深人探索这些基因在成体中的重要作用。因此可以在特定的时间和空间—即在特定的发育阶段和特定的组织细胞中开启或关闭特定基因的时空特异性基因打靶（spatiotemporalgenetargetingSTGT）技术应运而生。Cre/LoxP和FLP—frt系统的应用使得组织特异性基因剔除变为现实。第1例应用Cre/LoxP系统研制成功的组织特异性基因剔除小鼠是由Gu等人在1994年报道的。构建条件剔除（conditionalknockout）小鼠的打靶载体，常将阳性选择标记基因置于靶基因的内含子中，并在靶基因重要功能域两侧的内含子中插入方向相同的LoxP序列，因为许多时候选择标记基因即便被放置在内含子中，也会阻断靶基因的转录。Meyer等人同时应用Cre—LoxP和FLP—frt系统研制了系列fgf8等位基因突变小鼠。fgf8染色体组上的不同区域分别放置了成对的LoxP序列和frt序列，通过与Cre或FLP转基因小鼠杂交可以分别获得完全敲除小鼠和条件敲除小鼠。此外，还可通过感染表达重组酶的腺病毒或逆转录病毒实现组织特异性的重组。为了达到在时空上调节基因打靶的目的，研究者将Cre基因置于配体或药物可诱导的启动子控制下，Kühn等人在1995年报道了Mx1—Cre转基因鼠的研究，Mxl是一种与抗病毒感染相关的基因，它在健康的小鼠中是不表达的，但可被重组干扰素或干扰素诱导剂pI—PC诱导。另一个常用的系统是四环素调节系统。St-Onge等人证实应用经典的tet系统可实现Cre介导重组的诱导控制，但存在较高的背景Cre重组酶活性。这些研究都是试图在转录水平上来控制Cre重组酶的表达从而达到在特定时段将靶基因剔除的目的。另一类研究则采用在转录后水平调节重组酶活性的策略。Feil等人将Cre基因与人雌激素受体突变的配体结合功能域融合，产生的Cre-ERT具有tamoxifen依赖的重组酶活性。他们将融合蛋白置于巨细胞病毒(CMV)的启动子下研制成功了转基因小鼠。第1例对Cre重组酶活性真正实现时空上调节的研究是1998年由Schwenk等人报道的。他们应用B细胞特异的启动子将Cre-ER融合蛋白的表达限制在B淋巴细胞中。B淋巴细胞中Cre介导的重组效率高达80％。（六）染色体组大片段的删除和重排（1）Cre介导的非同源染色体间的重排

基于Cre-LoxP系统的位点特异性重组可以介导长距离的重组，这种重组已被应用于果蝇和植物，在哺乳动物中也取得成功。Li等用此方法成功地将淀粉样前体蛋白基因（APP）200kb的片段去除。其方法为在第一次打靶的过程中同时将两个选择标记基因neo、tk及3’端缺失的hprt基因和LoxP序列引入到靶位点的上游，通过筛选得到neo抗性的阳性克隆。筛到的克隆用于进行第二次打靶，在靶位点的下游引入另一个LoxP序列和5’端缺失的hprt基因，同时引入两个选择标记基因hyg和tk基因。中靶的阳性克隆在Cre重组酶的存在下发生重组将tk基因去除，将对FIAU产生抗性。同时，两端部分缺失的hprt基因在染色体上重新组成有功能的hprt基因，使该克隆能在含HAT的培养基中存活。具体的实施过程有两种策略：一种是通过两次打靶分别将两个LoxP位点引入靶位点。中靶的克隆转染表达Cre酶的质粒，去除两个LoxP位点之间的序列；另一种是第一次中靶的克隆直接转染第二次的打靶载体和Cre酶表达质粒，直接筛选最终中靶的克隆。两种方法都得到了嵌合体小鼠。Justice等用此系统研制了携带毛色基因标记的染色体组大片段缺失的突变小鼠。（2）Cre-LoxP介导的姐妹染色体间的重排哺乳动物细胞中有相当数量的基因是多拷贝的，这些多拷贝的基因在染色体上排列在一起形成基因簇。基因簇中的基因具有相同或相似的功能。用基因打靶的方法研究这些基因的功能必须使这些基因同时产生突变。如果基因簇内的各基因的遗传距离较大，可以分别在每一个拷贝上引入突变，通过子代的杂交获得每个拷贝同时带有突变的个体。但当基因簇内的各基因间的距离很小时，染色体交换的频率非常低，无法通过子代杂交获得各拷贝同时带有突变的个体。用Cre-LoxP系统可以实现这一目的。具体的实施策略是将两个LoxP序列通过同源重组分别引入到两个基因中去，得到两个分别带有LoxP序列的小鼠品系。两个品系杂交，就会得到在两条姐妹染色体上同时带有LoxP序列的小鼠，再和表达Cre酶的第三个小鼠品系杂交便可获得两个拷贝同时删除的子代。Matsuaka等将编码肾素基因簇内的两个基因ren1和ren2用此方法同时灭活获得了成功。Cre介导的非同源染色体间的重排

人类的许多遗传疾病是由于染色体的易位引起的，应用Cre-LoxP系统成功地建立了相应的动物模型。其原理是，将LoxP序列分别引入到非同源染色体上，在Cre酶的存在下诱导非同源染色体之间的重组。VanDeursen等通过两次连续的基因打靶将两个LoxP序列分别引入到小鼠ES细胞的13号染色体的DEK和2号染色体的Can基因中，两次中靶ES细胞转染超螺旋结构的编码Cre重组酶的质粒，得到了染色体易位的ES细胞。（七）诱导性基因打靶（1）诱导性基因打靶原理

它主要由Cre/loxP及诱导系统组成。Cre／loxP系统由重组酶Cre和该酶的特定作用位点loxP组成，其中的重组酶Cre可诱导LoxP所在的DNA发生缺失、插入、重复、倒位和易位等多种形式的基因突变或染色体畸变。诱导性基因打靶就是以该系统为基础、利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制、或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性、从而在loxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因打靶技术。（2）诱导性基因打靶的类型根据所用诱导剂的种类，诱导性基因打靶可分为四环素诱导型、干扰素诱导型（二者所用诱导剂为控制Cre基因表达的启动子活性的活化物)和激素诱导型(所用诱导剂为Cre酶活性的激活物)等几种类型。以Cre／loxP系统介导的位点特异性重组为基础的诱导性基因打靶术的优势：①诱导基因突变的时间可人为控制；②可避免因基因突变而致死胎的问题；③在2个loxP位点之间的重组率较高；④如用病毒或配体/DNA复合物等基因转移系统来介导Cre的表达，则可省去建立携带Cre的转基因动物的过程。（八）基因敲入（GeneKnockin）通过基因打靶，用一种基因替换另一种基因以便在体内测定它们是否具有相同功能。也可通过该技术进行靶向基因治疗。与基因敲除不同之处在于：设计载体时将靶基因第一外显子N端缺失并将新的替换基因置于靶基因的调控序列之下。七、基因打靶的影响因素基因打靶的效率是指可检测到的细胞中发生同源重组的细胞数与转染的细胞总数之比，又称同源重组效率。基因打靶效率在不同的研究报道中变动范围较大，其波动性来自较多的影响因素。(1)打靶载体的影响打靶载体中同源序列是决定同源重组效率的关键因素，Thomas和Capecchi研究表明，当载体同源序列长度从4kb增加至9kb时，基因打靶效率增加10倍，与此同时，非同源重组效率增加40倍。Zimmer等用显微注射法将含20kb同源重组序列的载体插入小鼠基因组，破坏了Hox1.1基因，其效率是1/150。Hasty等研究发现，同源序列达一定长度后，继续的增加对同源重组效率不产生显著影响。(2)外源DNA导入方式的影响目前，外源DNA导入的方式主要有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒感染法。不同的导入方法对同源重组效率有明显影响。目前应用最广的是显微注射法，用显微注射法导入可得到很高的转染率，占接受外源DNA细胞的10~20%，但显微注射每次只能注射一个细胞，而用电穿孔法可同时使许多细胞得到转染，可使1%的ES细胞稳定转染。1993年，Squires等利用精子载体法制作转基因鸡，其阳性率为15~25%。近年，精子载体法研究在不断的进行，影响DNA与精子结合的因素可能是获得成功的一个关键因素。而逆转录病毒载体法利用某些病毒对某些组织具有特异的亲合力，在人类疾病的基因治疗方面显示了良好的发展潜力。(3)靶基因的影响早期研究缺陷型标记基因时发现整合标记基因的同源重组效率与它在基因组中的插入位置有关，说明基因组中的不同区域对同源