酶工程复习资料p

第一章绪论1．酶：是具有生物催化功能的生物大分子，分为蛋白类酶和核酸类酶两大类别。酶的生产：是指通过各种方法获得人们所需的酶的技术过程，重要涉及微生物发酵产酶、动植物培养产酶和酶的提取与分离纯化等。酶的改性：是通过各种方法改善酶的催化特性的技术过程，重要涉及酶分子修饰、酶的固定化、酶非水相催化和定向进化。酶的应用：是通过酶的催化作用获得人们所需的物质或者除去不良物质的技术过程，重要涉及酶反映器的选择与设计以及酶在各个领域的应用等2．酶催化的作用特点：专一性强、催化效率高和作用条件温和等。酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂浓度、克制剂浓度等诸多因素的影响。在酶的应用过程中，必须控制好各种环境条件，以充足发挥酶的催化功能。3．米氏方程：V=VmS/Km+S,Km为米氏常数，是酶催化反映速度等于最大反映速度一半时的底物浓度。克制剂的影响：有可逆克制剂和不可逆克制剂之分。不可逆克制剂与酶分子结合后，克制剂难于除去，酶活性不能恢复。可逆克制剂与酶的结合是可逆的，只要将克制剂除去，酶酶活力即可恢复。可逆性克制作用可以分为竞争性克制、非竞争性克制和反竞争性克制三种。=1\*GB3①竞争性克制：是指克制剂和底物竞争与酶分子结合而引起的克制作用。克制的效果强弱与竞争性克制剂的浓度、底物浓度以及克制剂和底物与酶的亲和力大小有关，随着底物浓度增长，酶的克制作用减弱。特点：酶催化反映的最大反映速率Vm不变，米氏常数Km增大。=2\*GB3②非竞争性克制：是指克制剂与底物分别于酶分子上的不同位点结合而引起酶活性减少的克制作用。特点：最大反映速度Vm减少，米氏常数Km不变。=3\*GB3③反竞争性克制：在底物与酶分子结合生成中间复合物后，克制剂再与中间复合物结合而引起的克制作用称为反竞争性克制。特点：最大反映速度Vm和米氏常数Km同时减少。4．酶的活力测定酶活力：是指在一定条件下，酶所催化的反映初速度。在外界条件相同的情况下，反映速度越大，意味着酶活力越高。酶活力测定过程：反映体系选择、反映条件拟定、反映物检测、酶活力计算、偶联酶反映活力测定酶活力单位：在特定条件下（温度可采用25℃或其它选用的温度，pH等条件均采用最适条件），每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位。这个单位称为国际单位。酶的转换数：是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数，即每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数。酶的生产方法：提出分离法、生物合成法、化学合成法微生物发酵产酶酶的发酵生产：通过预先设计，通过人工操作，运用微生物的生命活动获得所需的酶的技术过程，称为酶的发酵生产。产酶微生物的特点：=1\*GB3①酶的产量高；=2\*GB3②产酶稳定性好；=3\*GB3③容易培养和管理；=4\*GB3④利于酶的分离纯化；=5\*GB3⑤安全可靠、无毒性。酶的发酵生产方式：固体培养发酵、液体深层发酵、固定化微生物细胞发酵和固定化微生物原生质体发酵。酶发酵动力学：是研究发酵过程中细胞生长效率、产物生成效率、基质消耗速率以及环境因素对这些速率的影响规律的学科。一、细胞生长动力学在分批培养过程中，细胞生长一般要经历延迟期、指数生长期、减速期、静止期和衰亡期5个阶段。1950年，法国莫诺德一方面提出了表述微生物细胞生长的动力学，他认为，在培养过程中，细胞生长速率与细胞浓度成正比。营养物浓度（生长限制基质浓度）和生长速率之间的动力学关系：Monod模型µ:比生长速率（1/h）（specificgrowthrate）µmax：最大比生长速率（1/h）S：营养物浓度（生长限制基质浓度）克/LKs：莫诺德常数或饱和常数或营养物运用常数克/L，或mol/L二、产酶动力学（一）酶生物合成的模式根据酶的合成与细胞生长之间的关系，可将酶的生物合成分为4种模式，即：同步合成型、中期合成型、延续合成型、滞后合成型1.同步合成型：酶的生物合成与细胞生长同步。特点：酶的合成可以诱导，但不受分解代谢物阻遏和反映产物阻遏。当去除诱导物、细胞进入平衡期后，酶的合成立即停止，表白这类酶所相应的mRNA很不稳定。2．中期合成型：酶的合成在细胞生长一段时间后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的合成也随着停止。特点：酶的合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏。所相应的mRNA是不稳定的。3．延续合成型：酶的合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成较长一段时间。特点：可受诱导，一般不受分解代谢物和产物阻遏。所相应的mRNA相称稳定。3.滞后合成型：只有当细胞生长进入平衡期以后，酶才开始合成并大量积累。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。特点：受分解代谢物的阻遏作用。所相应的mRNA稳定性高。酶生产中最抱负的合成模式：延续合成型：发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞开始生长就有酶的产生，直至细胞生长进入平衡期后，酶还可以继续生成一段时间。同步合成型：提高相应的mRNA的稳定性，如减少发酵温度。滞后合成型：尽量减少甚至解除分解代谢物阻遏，使酶的合成提早开始。中期合成型：要在提高mRNA稳定性以及解除阻遏两方面努力。酶的发酵工艺条件与控制：1、培养基培养基的基本成分五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水2、发酵条件及控制：pH值的控制：培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，或在进行工业发酵时补加酸、碱。通常培养条件：细菌与放线菌：pH7~7.5酵母菌和霉菌：pH4.5~6范围内生长细胞发酵产酶的最适pH值与生长最适pH值往往有所不同。细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反映的最适pH值。温度的控制：通常在生物学范围内每升高10℃，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反映，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，并且往往低于生长最适温度。这是由于在较低的温度条件下，可以提高酶所相应的mRNA的稳定性，增长酶生物合成的延续时间，从而提高酶的产量。溶解氧的控制溶解氧：是指溶解在培养基中的氧气。在酶的发酵生产过程中，处在不同生长阶段的细胞，其细胞浓度和细胞呼吸强度各不相同，致使耗氧速率有很大的差别。因此必须根据耗氧量的不同，不断供应适量的溶解氧。培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速度。溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间、气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。一般说来，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长、气液接触面积越大，则溶氧速率越大。培养液的性质，重要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。控制溶解氧方法：调节通气量、调节氧的分压、调节气液接触时间、调节气液接触面积、改变培养液的性质3、提高产酶的措施（1）添加诱导物对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导β-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。诱导物一般可以分为3类：酶的作用底物、酶的催化反映产物、作用底物的类似物（2）控制阻遏物的浓度阻遏作用根据机理不同，可分为：产物阻遏和分解代谢物阻遏两种。1.产物阻遏作用是由酶催化作用的产物或者代谢途径的末端产物引起的阻遏作用。2.分解代谢物阻遏作用是由分解代谢物（葡萄糖等和其它容易运用的碳源等物质通过度解代谢而产生的物质）引起的阻遏作用。控制阻遏物的浓度是解除阻遏、提高酶产量的有效措施。为了减少或者解除分解代谢物阻遏作用，应当控制培养基中葡萄糖等容易运用的碳源的浓度。采用其他较难运用的碳源，如淀粉等采用补料、分次流加碳源添加一定量的环腺苷酸（cAMP）对于受代谢途径末端产物阻遏的酶，可以通过控制末端产物的浓度的方法使阻遏解除。（3）添加表面活性剂表面活性剂可以与细胞膜互相作用，增长细胞的透过性，有助于胞外酶的分泌，从而提高酶的产量。将适量的非离子型表面活性剂，如吐温（Tween）、特里顿(Triton)等添加到培养基中，可以加速胞外酶的分泌，而使酶的产量增长。由于离子型表面活性剂对细胞有毒害作用，特别是季胺型表面活性剂是消毒剂，对细胞的毒性较大，不能在酶的发酵生产中添加到培养基中。（4）添加产酶促进剂产酶促进剂是指可以促进产酶、但是作用机理未阐明清楚的物质。例如，添加一定量的植酸钙镁，可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的产量提高1～20倍；添加聚乙烯醇可以提高糖化酶的产量。产酶促进剂对不同细胞、不同酶的作用效果各不相同，现在还没有规律可循，要通过实验拟定所添加的产酶促进剂的种类和浓度。第四章酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化：是指将酶从细胞或其他含酶原料中提取出来，再与杂质分开，而获得所规定的酶制品的技术过程，重要涉及细胞破碎、提取、离心分离等等。 细胞破碎：是指通过各种方法使细胞外层结构破坏的技术过程。细胞破碎方法与其原理分类细胞破碎方法细胞破碎原理机械破碎法捣碎法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞研磨法破碎匀浆法物理破碎法温度差破碎法 通过各种物理因素的作用，使组织、细胞压力查破碎法 的外层结构破坏，从而使细胞破碎超声波破碎法化学破碎法添加有机溶剂通过各种化学试剂对细胞膜的作用，从而使添加表面活性剂细胞破碎酶促破碎法自溶法通过细胞自身的酶系或外加酶制剂的催化外加酶制剂法作用，使外层结构受到破坏，从而使细胞 破碎酶的提取：是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液解决含酶原料，使酶充足溶解到溶剂或溶液中的过程，也称为酶的抽提。酶提取时一方面应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶的重要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.02～0.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取PH8～12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或具有较多非极性基团的酶

从细胞、细胞碎片或其他含酶原料中提取酶的过程受到扩散作用的影响。提高温度，减少溶液粘度、增长扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有助于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。酶的分离方法沉淀分离：是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度减少，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。沉淀分离的方法沉淀分离方法分离原理盐析沉淀法运用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法运用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法运用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离2．离心分离：是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。离心机重要分为常速（低速）离心机、高速离心机和超速离心机。常速离心机又称为低速离心机,其最大转速在8000r/min以内，相对离心力（RCF）在1×104g以下，在酶的分离纯化过程中，重要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。高速离心机的最大转速为（1～2.5）×104r/min，相对离心力达成1×104～1×105g，在酶的分离中重要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而导致酶的变性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。超速离心机的最大转速达(2.5～12)×104r/min，相对离心力可以高达5×105g甚至更高。超速离心重要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等。离心条件的拟定：根据需要选择的离心力、离心时间及离心介质的PH值和温度等条件。3过滤与膜分离过滤：是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。过滤的分类及其特性(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同)类别截留颗粒大小截留的重要物质过滤介质粗滤>2μm酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷、烧结金属等微滤0.2～2μm细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤20Å～0.2μm病毒、生物大分子等超滤膜反渗透<20Å生物小分子、盐、离子反渗透膜膜分离：离借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分技术。膜分离所使用的薄膜重要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。四种常用膜分离技术的基本特性膜技术膜技术截留物尺寸nm（分子量）推动力分离机理微滤MF>20(>40,000)压力差，>100kPa筛分超滤UF1～20(10,000--40,000)压力差，>100kPa筛分纳滤NF>1(100～1000)压力差，<1000kPa优先吸附、表面电位反渗透RO(>100)压力差，>1000kPa优先吸附、溶解扩散超滤要细看（书本P101）4．层析分离层析分离：是运用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同限度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达成分离。层析分离方法层析方法分离原理吸附层析运用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离分派层析运用各组分在两相中的分派系数不同，而使各组分分离离子互换层析运用离子互换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达成分离目的凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，运用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达成物质分离亲和层析运用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子互换层析的特性结合在一起，实现组分分离（1）吸附层析是运用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附设备简朴。操作过程：吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱。层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液所有进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。洗脱方法涉及溶剂洗脱法、置换洗脱法、前缘洗脱法。（2）分派层析分派系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达成平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件拟定后，层析系数是一常数。在分派层析中，通常采用一种多孔性固体支持物（如滤纸、硅藻土、纤维素等）吸着一种溶剂为固定相，这种溶剂在层析过程中始终固定在多孔支持物上。另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂可沿着固定相流动，称为流动相。当某溶质在流动相的带动流经固定相时，该溶质在两相之间进行连续的动态分派。分派层析重要有纸上层析、分派薄层层析、分派气相层析等方法。（3）离子层析离子互换层析是运用离子互换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达成分离目的的一种层析分离方法。离子互换剂是具有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。按活性基团的性质不同，离子互换剂可以分为阳离子互换剂和阴离子互换剂。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子互换剂，也可用阴离子互换剂进行酶的分离纯化。操作过程：涉及装柱、上柱、洗脱、收集和互换剂再生等环节。具体看书本（P110）。（4）凝胶层析凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，运用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达成物质分离的一种层析技术。原理：凝胶层析柱中装有多孔凝胶，当具有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达成分离的目的。操作过程：涉及装柱、上柱、洗脱等过程。（5）亲和层析亲和层析是运用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。酶与底物,酶与竞争性克制剂,酶与辅助因子,抗原与抗体，酶RNA与互补的RNA分子或片段,RNA与互补的DNA分子或片段等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用.亲和层析种类：根据欲分离组分与配基的结合特性,亲和层析可以分为：共价亲和层析、疏水层析、金属离子亲和层析、免疫亲和层析、染料亲和层析、凝集素亲和层析（6）电泳分离电泳：带电粒子在电场中向着与其自身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。方法：电泳方法按其使用的支持体的不同，可以分为：纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、自由电泳、等电聚焦电泳影响因素：颗粒在电场中的移动速度重要决定于其自身所带的净电荷量，同时受颗粒形状和颗粒大小的影响。此外，还受到电场强度、溶液pH值、离子强度及支持体的特性等外界条件的影响。6、萃取分离萃取分离是运用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。萃取分离中的两相一般为互不相溶的两个液相。有时也可采用其它流体。分类：按照两相的组成不同，萃取可以分为：有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取、反胶束萃取双水相萃取：运用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达成分离。各种双水相系统聚合物P聚合物Q或盐聚丙二醇甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚糖聚乙二醇聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖甲基纤维素羟甲基葡聚糖，葡聚糖乙基羟乙基纤维素葡聚糖羟丙基葡聚糖葡聚糖聚蔗糖葡聚糖聚乙二醇硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒石酸钾钠第五章酶分子修饰酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的技术过程称为酶分子修饰。重要涉及金属离子置换修饰、大分子结合修饰、侧链基团修饰、肽链有限水解修饰、核苷酸链有限水解修饰、氨基酸置换修饰、核苷酸置换修饰和酶分子的物理修饰。酶分子修饰重要研究内容：1对酶分子的侧链基团，特别是酶活性中心中的必需基团进行化学修饰，研究酶结构与功能的关系2通过对酶功能基团的修饰和水不溶性大分子的结合，改造酶性能，增长酶的稳定性3通过对酶分子内或分子间的交联，或与水不溶性载体的结合制成固定化酶，催化特定的反映4用化学方法合成新的有机催化剂，使其具有酶活性(模拟酶)5用分子生物学方法克隆酶或修饰酶基因以产生突变酶，或设计新基因合成自然界不存在的新酶(抗体酶)大分子结合修饰：采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的催化特性的方法称为大分子结合修饰。大分子结合修饰的重要过程：1．修饰剂的选择大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子，要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。2．修饰剂的活化作为修饰剂使用的水溶性大分子具有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反映而结合在一起。在使用之前一般需要通过活化，活化基团才干在一定条件下与酶分子的某侧链基团进行反映。3．修饰将带有活化基团的大分子修饰剂与通过度离纯化的酶液以一定的比例混合，在一定的温度、PH等条件下反映一段时间，使活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。4．分离通过度离方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰剂。大分子结合修饰的作用：提高酶的催化效率、增长酶的稳定性、减少或消除酶的抗原性等。侧链基团修饰：采用一定的方法（一般为化学法）使酶的侧链基团发生改变，从而改变酶的催化特性的修饰方法称为侧链基团修饰。侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团及组成RNA的核苷酸残基的功能团。重要有氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基等等。侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。a各种氨基酸侧链的修饰剂氨基酸侧链基团修饰剂Lys氨基三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亚胺Arg胍基苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮Cys巯基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺

二硫键巯基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羟基碘、四硝基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亚胺物理修饰:通过各种方法使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的催化特性的方法称为酶分子的物理修饰。修饰特点：在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排，使酶分子的空间构象发生某些改变。酶分子修饰的应用：在酶学研究的方面的应用：酶的活性中心研究、酶的空间结构研究、酶的作用机制研究。在医学方面的应用：减少或者消除酶抗原性、增强医药用酶的稳定性在工业方面的应用：提高工业用酶的催化效率、增强工业用酶的稳定性、改变酶的动力学特性。在抗体酶研究开发方面的应用在核酸类酶人工改造方面的应用在有机介质酶催化反映中的应用酶、细胞、原生质体固定化固定化酶：是指固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反映的酶，反映后的酶可以回收反复使用。固定化酶的优缺陷：优点：提高酶的催化效率、增长稳定性、多次使用、可以装塔连续反映、纯化简朴、提高产物质量、应用范围广缺陷：初次投入成本高、扩散限制，大分子底物较困难酶的固定化：采用各种方法，将酶固定在水不溶性的载体上，制备成固定化酶的过程称为酶的固定化。方法：将酶和含酶菌体或菌体碎片固定化的方法重要涉及吸附法、包埋法、结合法、交联法和热解决法等。吸附法：运用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，从而使酶固定化的方法叫做物理吸附法，简称吸附法。包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。根据载体材料和方法的不同，可以分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类。结合法：选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法。根据酶与载体结合的化学键不同，可分为离子键结合法和共价键结合法。离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。常用载体:DEAE-纤维素，DEAE-葡聚糖凝胶使用注意：pH、离子强度、温度2．共价键结合法：通过共价键使酶与载体结合的固定化方法。可以形成共价键的基团：游离氨基、游离羧基、巯基、咪唑基、酚基、羟基、甲硫基、吲哚基、二硫键常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、无机载体要使载体与酶形成共价键，一方面必须使载体活化，即借助于某种方法，在载体上引进活泼基团，此活泼基团再与酶分子上的某一基团反映，形成共价键。载体活化的方法：A．重氮法、B．叠氮法、C．烷基化反映法、D．硅烷化法、E．溴化氰法（4）交联法：借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。（5）热解决法：是将含酶细胞在一定温度下加热解决一段时间，使酶固定在菌体内，而制备得到固定化菌体的方法。 各类固定化方法的特点比较项目吸附法结合法交联法包埋法

物理吸附共价键结合离子键结合

制备难易易难易较难较难固定化限度弱强中档强强活力回收率较高低高中档高载体再生也许不也许也许不也许不也许费用低高低中档低底物专一性不变可变不变可变不变合用性酶源多较广广泛较广小分子底物、药用酶

固定化酶在工业生产上的应用1．葡萄糖异构酶——世界上生产规模最大的一种固定化酶。用吸附法、结合法、凝胶包埋法等进行固定化。葡萄糖异构酶葡萄糖--------------------果糖-------------果葡糖浆2．聚丙烯酰胺凝胶包埋具有延胡索酸酶的产氨短杆菌菌体，制得固定化延胡索酸酶。工业化生产L-苹果酸3．运用固定化乳糖酶可以连续生产低乳糖奶固定化酵母细胞等微生物可用于生产各种酒类第七章酶非水相催化酶在非水介质中进行的催化作用称为酶的非水相催化。酶非水相催化的几种类型：有机介质中的酶催化——有机溶剂有机介质中的酶催化是指酶在具有一定量水的有机溶剂中进行的催化反映。合用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。酶在有机介质中由于可以基本保持其完整的结构和活性中心的空间构象，所以可以发挥其催化功能。2．气相介质中的酶催化——气相介质酶在气相介质中进行的催化反映。合用于底物是气体或者可以转化为气体的物质的酶催化反映。由于气体介质的密度低，扩散容易，因此酶在气相中的催化作用与在水溶液中的催化作用有明显的不同特点。3．超临界介质中的酶催化——超临界流体酶在超临界流体中进行的催化反映。超临界流体是指温度和压力超过某物质超临界点的流体。离子液介质中的酶催化酶在离子液中进行的催化作用。离子液是由有机阳离子与有机（无机）阴离子构成的在室温条件下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳定性好。酶在离子液中的催化作用品有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键选择性等显著特点。有机介质反映体系：单相共溶体系——与水互溶的有机溶剂极性较大的有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产物都能溶解在这种体系中。不存在传质障碍。极性大的溶剂对一般酶的催化活性影响大，能在该体系反映的酶较少。2．两相/多相体系——与水不溶性，非极性有机溶剂由具有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶性)相所组成的两相体系。游离酶、亲水性底物或产物溶解于水相，疏水性底物或产物溶解于有机相。催化反映在两相界面进行，一般合用于底物或产物两者或其中一种是属于疏水化合物的催化反映。3．微水介质体系——非极性有机溶剂用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固体酶悬浮在有机相中。但仍然具有必需的结合水以保持酶的催化活性(含水量一般小于2%)。酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态，或者吸附在固体载体表面上。有机介质酶催化中广泛应用的一种反映体系。4．(正)胶束体系是在大量水溶液中具有少量与水不溶的有机溶剂，加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴。表面活性剂的极性端朝外，非极性端朝内，有机溶剂抱在液滴内部。反映时，酶在胶束外面的水溶液中，疏水性的底物或产物在胶束内部。反映在胶束的两相界面中进行。5．反胶束体系具有表面活性剂与少量水的有机溶剂系统。反向微团：疏水尾部向外，与非极性有机溶剂接触，急性头部向内，形成一个极性核。反映时，酶分子在反胶束内部的水溶液中，疏水性底物或产物在反胶束外部，催化反映在两相的界面中进行。有机介质酶催化的优点：1．有助于疏水性底物的反映：有机溶剂增长了疏水性底物的溶解度，增长了疏水性物质的转化效率；可改变反映平衡的移动方向：在有机介质中，可发生水解反映的逆反映，如氨基酸合成肽能催化在水中不能进行的反映：转酯反映；酚氧化在氯仿中比水中效率高；防止水引起的副反映发生；酶稳定性增强，较少微生物污染；易于实现固定化以及产物和酶的回收酶在有机介质中的催化特性：酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性与水有很大差别，对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影响，从而显示出与水相介质中不同的催化特性。底物特异性：有机介质中，酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的底物特异性会发生改变。立体选择性：有机溶剂中酶的立体选择性减少。因素：1.在水和有机溶剂中，底物的两种对映体将水从酶分子疏水性结合位点上置换出来的能力有所不同。2.在疏水性差的溶剂中，疏水性的基团进入酶的疏水袋中比暴露在溶剂中热力学平衡更为有利，因此酶分子中的亲核基团易于进攻位置合适的底物分子的羟基，从而得到某个构型的产物。而在疏水性强的溶剂中，疏水性基团更倾向于暴露在溶剂中，而非进入酶的疏水袋，从而失去酶对底物的选择性。区域选择性：在酶促反映中，底物某一位置上的基团被选择性地转化而另一位置上的相同基团没有被转化的现象键选择性：与酶的来源和有机介质的种类有关。与氢键参数有关，易于形成氢键的基团，不易进行反映。反之易于反映热稳定性：酶在缺水的环境中，使得酶分子中肽键水解、二硫键破坏、氨基酸异构化等无法进行，酶构象的刚性增长，稳定性提高。活性：有机溶剂直接作用于酶有些酶的活性会随着某些有机溶剂浓度升高而增大，在某一浓度达成最大值；低水有机溶剂体系中，大部分酶活性得以保持，但也有某些酶活性亦发生变化。pH：pH对水相中进行的酶促反映有较大影响，但在有机相反映体系中，很难直接测定。有机介质中酶催化反映的条件及其控制：酶在有机介质中可以催化多种反映，重要涉及：合成反映、转移反映、醇解反映、氨解反映、异构反映、氧化还原反映、裂合反映等。重要应控制的条件有水含量：酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才干进行催化反映。所以酶在有机介质中进行催化反映时，水是不可缺少的成分之一。有机介质中的水含量多少对酶的空间构象、酶的催化活性、酶的稳定性、酶的催化反映速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底物和反映产物的溶解度有关。酶的种类和浓度：酶种类：依据反映的类型，如：脂肪酶、蛋白酶、氧化酶等酶形式的选择：冷冻干燥的酶粉、固定化酶、结晶酶、酶与大分子物质的复合物等使用载体对酶固定化，所选择载体对酶的微水环境影响尽也许小。假如酶基本存在于载体表面，则疏水性载体对酶的固定化有利。随着载体亲水性增强，酶的催化活力呈下降趋势(亲水基团争夺必需水，导致构想改变)。提高载体疏水基团含量，可提高固定化酶对疏水性底物的亲和力，提高反映活性。底物的种类和浓度：依据酶在所使用有机介质中的专一性选择适宜的底物底物浓度-酶促反映速度有机溶剂的种类：温度：在微水有机介质中，酶促反映的最适温度高于水溶液中的最适温度温度升高，立体选择性下降pH：有机相中最适pH通常与水溶液中相同或接近酶分子从缓冲液中转到有机介质后，酶分子保存原有的pH印记通过调节缓冲液pH，对有机介质中酶催化的pH值进行调节离子强度：有机介质中，酶的催化活性与酶在缓冲液中的离子强度和pH有密切关系盐，增长离子强度，可帮助酶维持构象。可通过调节缓冲液中离子强度的方法对有机介质中酶催化的离子强度进行调节控制。酶非水相催化的应用：酶催化反映应用脂肪酶肽合成青霉素G前体肽合成酯合成醇与有机酸合成酯类转酯各种酯类生产聚合二酯的选择性聚合酰基化甘醇的酰基化蛋白酶肽合成合成多肽酰基化糖类酰基化羟基化酶氧化甾体转化过氧化物酶聚合酚类、胺类化合物的聚合多酚氧化酶氧化芳香化合物的羟基化胆固醇氧化酶氧化胆固醇测定醇脱氢酶酯化有机硅醇的酯化手性药物的拆分：手性化合物：化学组成相同，立体结构互为对映体的两种异构体化合物。一种显著疗效，一种弱或无效；一种显著疗效，一种毒副作用；两者药效相反；或具有不同的药效；或具有互补性手性药物的合成与生产中，除通过不对称合成的方法得到光学纯的手性化合物外，一般得到的由等量的相应异构体分子组成的外消旋体。非生物法拆分：运用机械分离法、色谱分离法、动力学拆分等生物法：2个对映体竞争的酶同一活性中性位置，两者反映速度不同，产生选择性而分开第八章酶的定向化一、酶分子定向进化：简称酶定向进化，是模拟自然进化过程（随机突变+自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。二、酶定向进化过程：1.从细胞内提取或者通过PCR等方法获得目的分子的基因2.在体外采用易错PCR、DNA重组、基因家族重排等技术进行人工突变，以获得丰富多样的突变基因。3.构建突变基因文库4.高通量筛选定向选择。酶基因酶基因随机突变随机突变反复进行反复进行构建突变基因文库构建突变基因文库进化酶负突变基因筛选正突变基因进化酶负突变基因筛选正突变基因三、酶定向进化的原理及特点：特点：适应面广：酶定向进化不需要事先了解酶的结构、催化作用机制等，可以广泛应用于各种P酶（蛋白质类酶）和R酶（核酸类酶）的改性。目的性强：酶定向进化是根据应用过程中酶呈现出的催化效率低，稳定性差等缺陷，通过基因体外随机突变，人工定向选择从而获取所需的进化酶，进化方向明确，具有很强的目的性。效果显著：通过酶的定向进化，可以在很短的时间内完毕自然进化漫长的进化历程，效果显著。四、酶基因的随机突变产生策略：1.易错PCR：是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变过程：1.双链DNA变性2.引物与单链DNA退火结合3.引物延伸具体做法：1.减少一种dNTP的量（减少5%-10%）2.加入dITP来代替被减少的dNTP3.缓冲液中另加0.5mmol/LMn2+,提高Mg2+浓度。特点：操作简便、随机突变丰富，但正突变概率低，突变基因文库较大，文库筛选的工作量大，一般合用于较小基因的定向进化。2.基因重排技术：又称DNA改组技术，是从正突变基因文库中分离得到的同源DNA，用酶切割成随机片段，通过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。过程：1.目的基因片段的准备2.DNase

I(脱氧核糖核酸酶I)酶切3.不加引物的PCR4.加引物的PCR两条以上正突变基因两条以上正突变基因酶切酶切DNA随机片段DNA随机片段酶切酶切无引物PCR突变基因（反复进行）无引物PCR突变基因（反复进行）基因重组基因重组 构建突变基因文库构建突变基因文库进化酶正突变基因筛选负突变基因进化酶正突变基因筛选负突变基因特点：在正突变的基础上进行，具有正突变概率高、进化速度较快的特点，但是在进行无引物PCR获得全长突变基因之前，必须将DNase

I去除干净以免切割突变基因。重排技术改良：交错延伸PCR技术：在PCR反映中把常规的退火和延伸合并为一步，缩短其反映时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。反复进行，当PCR片段大小接近全长基因时，分离全长基因并用基因外引物扩增全长基因。特点：可以省去DNA重排技术中DNase

I切割这个环节，具有简便、快速的特点。随机引物体外重组技术：以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，PCR生产大量互补于模板不同位点的短DNA片段，然后除去模板，这些短DNA片段互为模板和引物进行扩增，通过碱基序列的重新排布而获取全长突变基因。特点：DNA小片段是通过随机引物引导的PCR反映而产生的，可以用较少的DNA模板获得较多的DNA小片段，同时省去DNA重排技术中DNase

I切割这个环节，具有简便、快速的特点。3.基因家族重排：又称基因家族改组技术，是从基因家族的若干同源基因出发，用DNaseI切割成随机片段，通过不加引物的多次PCR循环，使DNA碱基序列发生重新排布而引起基因突变的技术过程。过程：（同DNA重排技术）两者重要不同点在于基因家族重排是从基因家族的若干同源基因出发进行DNA序列重排，DNA重排技术是采用易错PCR等技术所获取的两个以上的这个突变基因出发进行DNA序列重排。特点：排除了不必要的突变，大大加快了基因体外进化的速度。基因间同源性较高，形成杂合体的频率较低。五、酶突变基因的定向选择的基本过程：基因载体突变基因基因载体突变基因基因重组基因重组突变基因文库突变基因文库筛选筛选目的基因目的基因通过DNA重组技术将随机突变获得的各种突变基因与适宜的载体进行重组，获得重组载体。通过细胞转化等方法将重组载体转入适宜的细胞或进行体外包装成为有感染活性的重组λ噬菌体，形成突变基因文库采用各种高通量筛选技术，在人工控制的特定环境中对突变基因进行筛选，得到目的基因。六、构建基因文库的过程过程重要涉及：载体的选择、基因重组、形成基因文库等1.载体的选择：根据目的基因的特性、载体的特点与重组DNA的筛选方法等选择适宜的载体，常用载体有：质粒载体、噬菌体DNA载体、黏粒载体、嗜菌粒载体等。2.基因重组：在体外通过DNA连接酶的作用，将基因与载体DNA连接在一起形成重组DNA，根据目的基因片段的末端性质和载体DNA、外源DNA分子上限制性核酸内切酶位点的性质，可选用黏性末端连接、平头末端连接和修饰末端连接。（黏性末端连接比平头末端连接效率高，修饰末端连接方式用于载体DNA和外源DNA末端不匹配时。）3.组装突变基因文库将重组DNA转入受体细胞或包装成有感染活性的重组噬菌体。七、抱负基因文库的质量规定：文库的包容性：文库中包含的DNA分子是否能完整的反映出源基因的所有也许的变化和改变，涉及正突变、负突变和中性突变，以便进行全面的筛选。这就规定构建的文库必须有足够大的容量，通常具有106或更大的容量。文库的完整性：文库中包含的DNA片段必须尽也许完整的反映基因的结构和功能信息，以便通过筛选得到的突变基因可以通过表达获取完整的具有催化功能的进化酶。八、常用的高通量筛选方法及各自的特点：筛选方法筛选依据特点平板筛选法依据细胞在平板培养基上的生长情况、颜色变化、透明圈情况等进行筛选通量大、效率高、简便、快速、直观、容易控制和调整环境条件荧光筛选法依据是否产生荧光、荧光的强度情况等进行筛选通量大、效率高、直观、明确、容易判断、需要克隆报告基因噬菌体表面展示法依据噬菌体外膜结构蛋白与外源蛋白形成的融合蛋白在噬菌体表面的展示情况进行筛选通量大、效率高、有效基因通过展示进行富集、需要构建外源基因与噬菌体外膜蛋白基因的融合基因酵母细胞表面展示法依据凝集素蛋白与外源蛋白形成的融合蛋白在酵母细胞表面的展示情况进行筛选通量大、效率高、有效基因通过细胞表面展示进行富集、需要构建靶蛋白基因与外源蛋白基因的融合基因九、酶定向进化的应用：定向进化技术在酶的改性方面，重要应用于提高酶的催化效率、增强酶的稳定性、改变酶的底物特异性等方面。第九章酶反映器一，酶反映器：用于酶或固定化酶进行催化反映的容器及其附属设备称为酶反映器。酶反映器是用于完毕酶促反映的核心装置。它为酶催化反映提供合适的场合和最佳的反映条件，以便在酶的催化下，使底物（原料）最大限度地转化成产物。它处在酶催化应过程的中心地位，是连接原料和产物的桥梁。二、酶反映器的类型：按结构区分：搅拌罐式反映器、鼓泡式反映器、填充床式反映器、流化床式反映器、膜反映器按操作方式区分1.分批式反映2.连续式反映3.流加分批式反映混合形式1.连续搅拌罐反映器2.分批搅拌罐反映器反映器类型适合的操作方式合用的酶特点搅拌罐式反映器分批式,流加分批式连续式,游离酶固定化酶反映比较完全，反映条件容易调节控制。填充床式反映器连续式固定化酶密度大，可以提高酶催化反映的速度。在工业生产中普遍使用。流化床反映器分批式流加分批式连续式固定化酶流化床反映器具有混合均匀，传质和传热效果好，温度和pH值的调节控制比较容易，不易堵塞，对粘度较大反映液也可进行催化反映。鼓泡式反映器分批式流加分批式连续式游离酶固定化酶鼓泡式反映器的结构简朴，操作容易，剪切力小，混合效果好，传质、传热效率高,适合于有气体参与的反映。膜反映器连续式游离酶固定化酶清洗比较困难喷射式反映器连续式游离酶通入高压喷射蒸汽，实现酶与底物的混合，进行高温短时催化反映，合用于某