实验三 植物营养

高级植物生理实验报告

植物营养农学院农药学东保柱20132020542013年12月27日实验1植物组织铵态氮含量的测定（茚三酮比色法）一、实验原理植物吸收的氮主要是氨态氮和硝态氮，后者经过还原过程形成氨，前者经同化后形成谷氨酰胺和谷氨酸，然后形成其他氨基酸和蛋白质。测定氨态氮的方法有多种，本实验为改良的茚三酮比色法。a-氨基酸与水合茚三酮溶液一起加热，经氧化脱氨变成相应的a-酮酸，酮酸进一步脱羧变成醛，水合茚三酮则被还原，在弱酸环境中，还原型茚三酮，氨和另一分子水合茚三酮反应，缩合生成蓝紫色物质。根据蓝紫色的深浅，在580nm波长下测定吸光值。本实验中在茚三酮试剂中添加乙二醇并补加正丁醇和丙醇，可以克服茚三酮的不稳定性。二、仪器设备研钵、烧杯、漏斗、量筒、具塞试管、三角瓶、容量瓶、移液管、天平、沸水浴锅、可见分光光度计三、 试剂10%醋酸（lOOmL）1%抗坏血酸（lOOmL）5口g/mL亮氨酸或丙氨酸溶液（0.005g定容至lOOOmL）pH5.4醋酸缓冲液：8.8mL0.2mol/L醋酸（冰醋酸11.55mL稀释至lOOOmL）加41.2mLO.2mol/L醋酸钠（醋酸钠16.4g或三水醋酸钠27.2g配成lOOOmL）。水合茚三酮试剂：l.lg茚三酮放到烧杯中，加入15mL正丙醇，摇匀，溶解，后加入3Oml正丁醇和6Oml乙二醇，混匀，再加9mLpH5.4醋酸缓冲液，混匀。保存于棕色瓶中，冰箱保存，适用期限1O天。四、 操作步骤标准曲线的绘制以下表所示量从5ug/mL亮氨酸或丙氨酸溶液中分别取溶液并在每个试管中加蒸馏水至2mL，对照加2mL蒸馏水，后在各试管中加入3mL水合茚三酮试剂和O.lmL1%抗坏血酸，摇匀。盖上试管塞，于沸水中加热15分钟，取出后搅拌冷却15分钟。冷却后的有色溶液中加无水乙醇至10mL，在波长580nm处测吸光值，以铵态氮浓度（ug/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。试管号1234567试剂（mL）00.20.40.81.21.61.8铵态氮浓度（ug/mL）00.512345称取0.5g新鲜植物材料，放入研钵中，加入5mL10%醋酸，研磨后以蒸馏水稀释至100mL，混匀，通过滤纸过滤，弃去最先滤下的一部分滤液后过滤到100mL三角瓶中。从剩下的滤液中取2mL放入试管中，加3mL水合茚三酮试剂和0.1mL1%抗坏血酸，摇匀。盖上试管塞，于沸水中加热15分钟。同时将盛有对照溶液（提取液用蒸馏水代替）的试管加热。取出后搅拌冷却15分钟。加热形成的红色茚三酮试剂被氧氧化而褪色，茚三酮与氨基酸形成的蓝紫色反应产物仍然存留并变得更加鲜明。冷却后的有色溶液中加无水乙醇至10mL，混匀。在波长580nm处测光密度值，根据标准曲线查得数值代入以下公式计算铵态氮含量。样品c值：1.436、1.435、1.436、1.435（0.1X10XC）X（100g样品中的氨态氮毫克数）= X100（2Xn）C：比色液中氨态氮浓度（Ug/mL）10：比色液体积（mL）n：样品重量（g）100：分析溶液总体积（mL）0.1：ug换算成mg并折算成100g物质中含量的换算系数。实验2植物体内硝态氮含量的测定一、原理在浓酸条件下，N0-与水杨酸反应，生成硝基水杨酸。生成的硝基水杨3酸在碱性条件下(pH12)呈黄色，最大吸收峰在波长410nm处，可直接比色测定。二、仪器和设备分光光度计、天平、刻度试管、移液器、移液管、容量瓶、漏斗、水浴锅、滤纸三、试剂500mg/LNO—N标准溶液:称取KN00.3611g溶于蒸馏水中，定容至lOOmL。335%水杨酸-硫酸溶液：称取5g水杨酸溶于lOOmL浓硫酸中，搅拌溶解后，贮藏于棕色瓶中。3.8%NaOH溶液：8.695gNaOH溶于lOOmL蒸馏水中。四、方法标准曲线的制作吸取500mg/LNO—N标准溶液0,1,2,3,4,6,8mL分别放入50mL3容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，使之成为0、10、20、30、40、60、80mg/L的系列标准溶液。吸取上述系列标准溶液0.1mL，分别放入刻度试管中，以0.1mL蒸馏水代替标准溶液作空白。再分别加入0.4mL5%水杨酸-硫酸溶液，摇匀，在室温下放置20分钟后，再加入8%NaOH溶液9.5mL，摇匀冷却至室温。显色液总体积为10mL。以空白作参比，在410nm波长下测定光密度。以NO-N浓度为横坐3标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线并计算出回归方程。硝酸盐的测定(1)样品液的制备：取2g植物材料切碎后放入刻度试管中，加入10mL蒸馏水，封口。置于沸水浴中提取30分钟，冷却，将提取液过滤到25mL容量瓶中,并反复冲洗残渣，最后定容至刻度。（2）样品液的测定：吸取样品液O.lmL分别放入刻度试管中，加入5%水杨酸-硫酸溶液0・4mL，混匀后置室温下20分钟，再慢慢加入9.5mL8%NaOH溶液,待冷却至室温后以空白作对照，在410nm波长下测定光密度值。在标准曲线上查得或用回归方程计算出NO--N浓度，再用以下公式计算其含量。3NO—N含量（mg/g）=（DX样品液总量）/样品鲜重3D：标准曲线上查得NO—N浓度（mg/L）