微生物与免疫学实验四酶联免疫吸附实验详解演示文稿

微生物与免疫学实验四酶联免疫吸附实验详解演示文稿第一页，共三十一页。优选微生物与免疫学实验四酶联免疫吸附实验第二页，共三十一页。ELISA简介1971年瑞典学者Engvall和Perlmann，荷兰学者VanWeeman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验（ELISA）第三页，共三十一页。ELISA基本的实验过程包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色第四页，共三十一页。ELISA检测抗原

Ag+ Ab*Ag-Ab*第五页，共三十一页。ELISA检测抗体

Ab+ Ag*Ab-Ag*第六页，共三十一页。ELISA检测抗体(间接法)Ag+Ab1Ag-Ab1Ag-Ab1+Ab2*Ag-Ab1-Ab2*第七页，共三十一页。由于结合在抗原—抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，从而提高了敏感性。如细胞抗原上每个分子结合3～5个分子抗体，当此抗体作为抗原时又可结合3—5分子的荧光抗体，所以和直接法相比荧光亮度可增强3或4倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于多种第一抗体的标记显示，这是现在最广泛应用的技术。间接法比直接法灵敏第八页，共三十一页。酶标板第九页，共三十一页。酶标仪第十页，共三十一页。一、ELISA法间接法检测血清中HBsAb【实验目的】1．熟悉ELISA的原理。2．了解免疫标记技术的原理。【实验原理】

采用纯化HBsAg包被反应板，加入待测标本，同时加入HBsAg-HRP。当标本中存在HBsAb时，就会形成HBsAg-HBsAb-HBsAg-HRP复合物，加入TMB(四甲基联苯胺)底物产生显色反应，反之就无显色反应。第十一页，共三十一页。将抗原HBsAg吸附于载体表面（厂家已经完成）第十二页，共三十一页。将待测血清加入，温育，血清中如有HBsAb，则抗原抗体结合第十三页，共三十一页。加入酶复合物，(HBsAg-HRP),酶复合物与表面抗体结合第十四页，共三十一页。加入酶的底物，酶与底物反应，显色第十五页，共三十一页。二、ELISA间接法检测血清中HBsAg原理同检测抗体,但小孔底部包被的为HBsAb酶复合物为:HBsAb-HRP当标本中存在HBsAg时，就会形成HBsAb-HBsAg-HBsAb-HRP复合物，加入TMB(四甲基联苯胺)底物产生显色反应，反之就无显色反应。第十六页，共三十一页。【实验材料】1．乙肝病毒HBsAg（或HBsAb）酶联免疫诊断试剂盒。

预包被微孔条（用纯化的单抗-HBs或纯化HBsAg包被）酶结合物（多克隆抗-HBs-HRP或HBsAg-HRP）阳性对照阴性对照洗涤液(浓缩液，用前以蒸馏水稀释25倍)显色剂A、B（一般为四甲基联苯胺和H2O2）终止液（2mol/LH2SO4）。2．微量加样器，吸水纸等。第十七页，共三十一页。①检测HBsAg或HBsAb的反应条②酶标抗体③阴性对照血清④阳性对照血清⑤洗涤液⑥显色液(A,B)ELISA试剂盒包含以下各组分：第十八页，共三十一页。待测血清1号、2号、3号、4号注意：待测血清是从医院采集的正常血清(人为加进去乙肝表面抗原或者抗体)，但是并不表示血清中不含有可传染的疾病，所以实验中要注意安全。第十九页，共三十一页。实验步骤每4人一组，每组有检测HBsAg和检测HBsAb的反应条各一条,每条含6个反应孔。每组有2种试剂盒(黄色测HBsAg,粉红色测HBsAb),黄色试剂盒用黄色反应条,粉红色试剂盒用红色反应条。第二十页，共三十一页。3、检测方法每孔加待检血清50ul,每次实验各做1个阴性对照和阳性对照;本实验空白对照孔不设，前面讲台上有空白的反应条，可以作为空白对照。注意：每位同学选择一种待测血清进行检测（见下图）。第二十一页，共三十一页。阴性阳性待检血清甲,乙,丙………….对照对照1号同学取待测血清1号…………..阴性阳性待检血清甲,乙,丙………….对照对照1号同学取待测血清1号2号同学取待测血清2号…………..2号同学取待测血清2号第二十二页，共三十一页。(2)每孔加1滴酶结合物,充分混匀，37℃孵育30min(3)甩弃孔内液体（在水池中甩弃，不要在实验室中随地甩弃）；(4)每孔加满洗涤液,静置1min,甩干。同上洗涤重复5次，拍干。第二十三页，共三十一页。(6)每孔加显色液A,B各1滴,充分混匀，置37℃15min.按以下方法,进行肉眼观察结果:

阴性对照孔无色,阳性对照孔蓝色;

待测孔显蓝色,为阳性,否则为阴性。(7)加终止液（本实验不加终止液）第二十四页，共三十一页。4结果记录及结论阴性对照孔阳性对照孔空白对照孔待测1待测2结果结论待测3待测4第二十五页，共三十一页。HBV属于嗜肝DNA病毒科，是乙型肝炎的病原体。在中国，HBV感染或携带者已超过1.3亿，发病人数超过3000万人。HBV基因组为双链环状DNA，其中有一个单链区。HBV的抗原组成由表面抗原（HBsAg）、核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)组成。三种抗原具有其相应抗体：HBsAb（抗表面抗原抗体）、HBeAb（抗e抗原抗体）、HBcAb（抗核心抗原抗体）。第二十六页，共三十一页。HBsAg为二聚体糖蛋白，大量存在于感染者血液中，为HBV感染的主要标志；HBcAg存在于Dane颗粒核心结构表面，为内壳成分，其外被HBsAg覆盖，不易在血循环中检出，但能刺激机体产生抗-HBc，抗-HBcIgM的存在提示HBV处于复制状态；HBeAg游离于血中，其消长与病毒体消长及DNA多聚酶消长基本一致，故HBeAg为HBV复制及具有强感染性的一个指标；第二十七页，共三十一页。HBeAg刺激机体产生的抗-HBe能与受染肝细胞表面的HBeAg结合，通过补体介导破坏受染肝细胞，抗-HBe的出现是预防后良好的象征。HBV的主要感染源是患者或无症状的HBsAg携带者，通过血液、体液、母婴传播。本实验只检测HBsAg及其抗体HBsAb第二十八页，共三十一页。HBsAg（本实验测）HBeAg抗-HBs（本实验测）抗-HBe抗-HBc结果分析+----HBV感染或无症状携带者++---急慢性乙肝或携带者++--+“大三阳”急慢性乙肝患者（传染性强）+--++“小三阳”急慢性乙肝感染，趋向于恢复--+++既往感染恢复期----+既往感染或“窗口期”--+--既往感染或接种过疫苗乙肝两对半检测的结果判断方法第二十九页，共三十一页。【注意事项】1．试剂盒应于4℃存放，在有效期内使用。2．微孔条须密封防潮，从冷藏环境中取出时,应在室温中平衡